芥子酸對含殼聚糖的模型飲料中花色苷的保護作用

艾 欣, 潘 飛, 朱澤輝, 張銘昕, 劉雅琪,趙 磊,*, 趙 亮,*

(1.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心/北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048; 2.中國農業科學院 蜂蜜研究所,北京 100093)

顏色作為評價食物的重要感官指標之一,影響著消費者對于食品的選擇和接受度。長期以來,為保證食物的色澤,著色劑被廣泛應用于食品加工行業中。然而,合成食品著色劑(三芳基甲烷類、氧雜蒽類和偶氮類等)不僅不能提供人體所必需的營養,安全性也備受質疑[1]。研究表明,部分合成著色劑經人體代謝后可引起過敏反應,產生致癌物質,與靶細胞相互作用[1-2]。天然著色劑花色苷來源廣泛、無毒,與生物系統相容性高,且具有較好的生物活性,如抗炎、抗氧化、調節血脂等[3],被認為是食品工業中最佳的天然著色劑之一。

天然花色苷具有強大的著色能力,在酸性pH值下,只需要很小的濃度就可以使食品獲得所需的紅色、粉紅色和紫色[4],并且能快速溶于食品水相中[5],常用于軟飲料和葡萄酒等產品的生產。然而花色苷非常容易降解,其穩定性受到各種因素的影響,如pH值、溫度、光、氧和抗壞血酸等[6]?？箟难嵩谑称饭I中常被作為抗氧化劑和營養增補劑使用,飲料等一些食品中的抗壞血酸往往與花色苷同時存在。由于抗壞血酸的自氧化會破壞花色苷的結構導致花色苷被降解[7],因此,尋找能應用于食品中且能提高花色苷穩定性的輔色劑尤為關鍵。

殼聚糖(chitosan,CS)是一種聚陽離子多糖,是由幾丁質經過脫乙酰作用得到的產物,無毒且生物相容性和生物降解性好[8],同時具有抑菌、降脂和增強免疫等多種生理功能[9]。近年來,研究人員普遍將CS用于花色苷智能活性食品保鮮膜和遞送載體的研究。Pinheiro等[10]將葡萄皮花色苷吸附在CS上,成功提高了花色苷的熱穩定性。Ge等[11]用CS衍生物制備花色苷納米復合物,顯著提高了在抗壞血酸影響下花色苷的穩定性。目前已有研究將CS作為飲料的穩定劑或增稠劑[12-13],在改善飲料體系質地和穩定性的同時也賦予飲料一定的生理活性。然而,飲料中CS的性質如溶解性、穩定性等[14]易受體系pH值影響[15],且抗壞血酸也是飲料中常見的成分和添加劑。因此,研究CS和抗壞血酸同時存在時對花色苷穩定性的影響至關重要,Ai等[16]前期研究發現,溶液中的CS反而會對抗壞血酸存在時的花色苷穩定性造成不利影響。酚酸是花色苷的一種重要輔色劑,花色苷與酚酸如咖啡酸、芥子酸(sinapic acid,SA)、迷迭香酸[17]等相互作用能夠形成一種“三明治”結構的復合物,進而達到增強色澤、提高顏色穩定性的效果[18]。量子化學計算結果表明,SA在12種有機酸中與花色苷(矢車菊素-3-O-葡萄糖苷)之間的二元配合物結合能最高[16],因此選擇芥子酸作為典型酚酸輔色劑用于后續研究。此前,Watrelot等[19]和Guo等[20]證實了多酚能夠非共價結合凝膠或分散形式的多糖,并且形成的凝膠極易吸附和結合花色苷等酚類化合物[21],因此我們推測多酚具有改善多糖對花色苷保護作用的潛力。Fernandes等[22]在果膠-花色苷混合物中加入兒茶素出現了增色效應,起到了輔色作用。Zhao等[23]證實了迷迭香酸與黃原膠聯用能提高L-抗壞血酸存在下花色苷的穩定性。然而,此前鮮有關于利用酚酸來改善高濃度多糖對花色苷不利影響的報道,且其作用機制還有待研究。

花色苷模型飲料是可以模擬食品飲料體系中花色苷的存在狀態,并排除多余物質干擾,借以研究花色苷穩定性的一種研究模型。殼聚糖目前未被國標列入飲料類食品添加劑中,本研究僅是將酚酸與多糖聯用來提高花色苷模型飲料穩定性的一種探討。本研究擬采用降解動力學、分子動力學模擬等手段,研究SA對含CS和抗壞血酸的模型飲料體系中黑米花色苷穩定性的保護效果和作用機制,希望為酚酸提高多糖對花色苷的保護作用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米花色苷提取物[矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(純度>15%)],湖北紫鑫生物科技有限公司;芥子酸(純度≥97%),上海源葉生物科技有限公司;殼聚糖(分子質量為50～190 kDa,脫乙酰度≥75%),美國Sigma-Aldrich公司;抗壞血酸,天津福晨化學試劑有限公司;所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax i3型連續波長多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司;VC1010D型照亮計,西安勝利儀器有限責任公司;CM-3601A型色差儀,日本柯尼卡美能達控股株式會社;HHSY21-Ni4型恒溫水浴鍋,北京精華科瑞儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1CS和SA混合溶液的制備

稱取不同質量的CS溶于pH值為3.0的檸檬酸緩沖溶液,攪拌過夜至充分水合,制備得到不同質量濃度的CS溶液(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/mL)。將SA加入CS溶液中,得到SA(質量濃度為5 mg/mL)和CS混合溶液。CS的添加濃度根據文獻報道的飲料中使用范圍確定[24]。

1.3.2花色苷溶液的制備

花色苷溶液的制備按照Zhao等[25]的方法,略加修改。將一定量的黑米花色苷提取物粉末溶于20 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH值3.0)中,使花色苷的質量濃度為0.25 mg/mL,攪拌10 min后,加入CaCl2,使Ca2+的終質量濃度為0.2 mg/mL,然后加入L-抗壞血酸(1 mg/mL)充分混合。加入等體積的不同濃度的CS或CS+SA溶液,充分混合后將各溶液的pH值調整為3.0。本實驗中花色苷的終質量濃度為0.125 mg/mL,該濃度可減少花色苷的自締合效應對顏色的干擾。該濃度下,僅添加花色苷溶液記作空白組;添加花色苷和抗壞血酸溶液記作對照組;在對照組基礎上添加20、10、5、2.5、1.25 mg/mL的CS分別記作CS20組、CS10組、CS5組、CS2.5組、CS1.25組;在對照組基礎上添加SA和20、10、5、2.5、1.25 mg/mL的CS分別記作CS20+SA組、CS10+SA組、CS5+SA組、CS2.5+SA組、CS1.25+SA組。

1.3.3加速儲藏實驗

加速儲藏實驗,主要是利用升高溫度、加催化劑等方法以加速食品的氧化和腐敗,通過加速物質的物理或化學變化,以探討產品的穩定性,具有減少產品開發時間的優勢[26]。根據Zhao等[25]報道的方法,將所有花色苷模型飲料溶液置于試管中,隨后,將試管放置于40 ℃水浴,正常光照7 d。采用pH示差法測定溶液中花色苷的含量[17],用色差儀測量溶液顏色的變化,采用紫外分光光度計測定溶液的吸光值[23]。為了可視化顏色變化,使用Adobe Photoshop CC軟件從每個樣本的L*、a*、b*值中創建色塊。

1.3.4降解動力學分析

參考Zhao等[25]報道的方法,根據不同處理時間的吸光值變化可以計算出熱降解速率常數K和半衰期t1/2,此外,采用D值可以進一步衡量顏色穩定性的指標。熱降解速率常數K、半衰期t1/2和D值的計算方法見式(1)至式(3)。

(1)

(2)

(3)

式(1)至式(3)中,At為加熱tmin時的花色苷最大吸光值,A0為花色苷的初始最大吸光值;K為降解速率常數,d-1;t1/2為半衰期,表示花色苷降解至50%所需要的時間,d;D值表示90%的花色苷顏色降解所需的時間,d。

1.3.5分子動力學模擬優化

為了闡明SA對CS存在時花色苷保護作用的機制,對不同花色苷體系進行50 ns分子動力學模擬。使用PACKMOL(Version 20.2)程序包[27]分別對所有組的CS周圍隨機分配5個花色苷分子,其中CS位于中央,其他分子隨機分配在CS周圍,且確保CS與其他分子之間存在足夠大的距離,兩者之間不存在相互作用?；ㄉ蘸蚐A的拓撲使用PRODRG2服務器建立[28],并根據Lemkul等[29]報道的方法,對其幾何結構和電荷性質進行修改。模擬體系在矩形的盒子中進行,加入外顯溶劑(SPC水模型),所有原子之間保持10 ?的距離,并加入水分子,添加相反電荷的離子用于中和體系電荷。所有體系均采用最陡下降法優化分子體系的幾何結構并進行能量最小化(最大設置為1 000.0 kJ·mol-1·nm-1)。能量最小化后,體系經過正則系綜NVT(0.2 ns)和等溫等壓系綜NPT(1 ns)兩步驟達到平衡。本研究中分子動力學模擬均使用GROMACS(Version.2019.5)軟件包進行(http:∥www.gromacs.org)[30],力場采用GROMOS96 43a1[31]使體系恒溫(40 ℃),所有含氫原子的鍵使用默認線性(LINCS)算法進行約束[32]。使用V-rescale方法使體系恒溫(40 ℃),使用Parrinello-Rahman方法使體系恒壓(1 bar)。采用粒子網格(PME)方法處理遠距離靜電力[33],以14 ?截斷量計算范德華力,時間步長1 fs,每100 fs收集一次快照。模擬結束后,使用GROMACS(Version.2019.5)軟件包分析軌跡。所有圖片經過PyMOL軟件處理。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0軟件包進行顯著性分析,實驗結果以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示。所有實驗重復3次,設定3～5個平行。組間數據比較用單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示差異極顯著。使用Origin 2018和PyMoL軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 SA對含CS的模型飲料中花色苷穩定性的影響

2.1.1對花色苷顏色穩定性的影響

為增強含CS的模型飲料體系中花色苷的穩定性,本研究探究了在不同CS質量濃度下SA對花色苷顏色穩定性的影響。添加CS或CS+SA,對花色苷吸光值和顏色變化量(ΔE*)影響的實驗結果見圖1?？瞻捉M經過加速儲藏實驗之后,在7 d時,吸光值由0.76下降至0.57[圖1(a)、圖1(c)],ΔE*值從0增加至9.97[圖1(b)、圖1(d)]。不同實驗組處理下花色苷顏色變化的色塊圖見圖2。由圖2可見,花色苷在7 d加速儲藏實驗條件下顏色仍保持紅色,表明在貯藏7 d的過程中,花色苷降解程度較低,并且相對穩定。然而,圖1結果表明,在對照組中花色苷的吸光值從0.81下降至0.17,ΔE*值從2.94增加到40.23,且顏色由紅色變為淡粉色(圖2)。與對照組相比,CS對花色苷的顏色無保護作用,吸光值和ΔE*值變化無顯著性差異[圖1(a)和圖1(b)],添加不同質量濃度的CS(1.25～20.00 mg/mL)+SA(5.00 mg/mL)組中黑米花色苷的吸光值增加,ΔE*值明顯降低[圖1(c)和圖1(d)]。CS5+SA組對花色苷的顏色保護效果最好,在7 d加速儲藏實驗中,與對照組相比吸光值增加了191.73%,而ΔE*降低了57.27%。這表明,SA顯著提高了含CS的模型飲料體系中花色苷顏色的穩定性,具有較好的花色苷顏色保護作用。

圖1 CS和CS+SA對花色苷吸光值和ΔE*的影響Fig.1 Effect of CS and CS+SA on absorbance value and ΔE* of anthocyanin

圖2 CS和CS+SA存在時花色苷顏色變化分析Fig.2 Analysis of color changes of anthocyanin in presence of CS and CS+SA

2.1.2對花色苷含量穩定性的影響

加速儲藏實驗中SA對含CS模型飲料中花色苷保留量的影響見表1。由表1可見,經過7 d加速儲藏實驗,僅添加花色苷的模型飲料中花色苷的質量濃度從16.62 mg/mL緩慢下降至8.42 mg/mL。CS和SA對花色苷含量的保留率計算結果見圖3。在對照組基礎上添加CS對花色苷無法達到保護作用。當CS添加的質量濃度為1.25～20.00 mg/mL時[圖3(a)],花色苷的保留率僅為8.59%～13.38%,其中CS質量濃度為2.5 mg/mL的CS2.5組保留率最高,顏色穩定性的保護效果也最好。而SA能顯著提高含CS模型飲料體系中花色苷的含量,延長花色苷的保留時間。圖3(b)顯示,CS5+SA組對花色苷的保護效果最好,花色苷的保留率為36.52%,綜合CS組和CS+SA組的結果,選擇了CS添加的質量濃度為2.5、5.0 mg/mL進行后續降解動力學實驗。在CS添加量相同的條件下,CS+SA組對黑米花色苷的保護作用顯著高于CS組,這與2.1.1中添加SA后對花色苷作用效果影響的分析結果是一致的。Fernandes等[22]在含有果膠的花色苷溶液中加入了兒茶酸,發現兒茶酸增強了果膠對花色苷的保護作用,因此,推測酚類化合物具有改善多糖對花色苷保護效果的潛力。添加SA能提高CS和抗壞血酸共同存在下花色苷的保留率,并且SA作為酚類化合物具有通過氫原子轉移機制清除自由基的能力[38],從而保護花色苷免于抗壞血酸自氧化作用導致的降解。

表1 花色苷在含CS的模型飲料及添加SA體系中的保留量

圖3 CS和CS+SA在加速儲藏實驗條件下對花色苷含量的影響Fig.3 Effect of CS and CS+SA on anthocyanin content under accelerated experimental conditions

2.2 SA對含CS的模型飲料中花色苷的降解動力學分析

圖4為花色苷在7 d加速儲藏實驗中的降解動力學曲線。由圖4可以看出,在有或無抗壞血酸存在時,黑米花色苷的降解均符合一級反應動力學(R2>0.99),符合此前研究花色苷降解動力學的報道[39]。降解動力學曲線反映了花色苷在7 d加速儲藏實驗條件下的降解規律,可以看出,相比僅添加抗壞血酸的對照組引起花色苷的ln(At/A0)大幅下降,

圖4 CS和CS+SA對花色苷降解動力學參數的影響Fig.4 Effect of CS and CS+SA on degradation kinetics parameters of anthocyanin

CS+SA組比CS組能更有效地減緩花色苷的降解。表2為在7 d加速儲藏實驗條件下不同體系中花色苷的降解動力學參數計算結果。由表2的花色苷降解速率常數(K)和半衰期(t1/2)可知,添加CS組的K值均小于對照組,而在添加相同質量濃度的CS的情況下,CS+SA組比CS組的花色苷降解速率常數更小,半衰期更大。在CS質量濃度為5.00 mg/mL時,K減小了0.152 3d-1,t1/2提高了2.3倍,說明SA能夠明顯增強CS存在時對花色苷的保護效果。Zhao等[23]發現,迷迭香酸能夠提高黃原膠對黑米花色苷的保護作用,且半衰期t1/2為8.20 d。與之相比,本研究中CS5+SA組有效提高了花色苷降解的半衰期(t1/2=10.468 d)。此外,通過計算花色苷顏色損失達90%時所需要的時間(D值)也能夠評估CS或CS+SA組對黑米花色苷顏色穩定性的影響。表2中,空白組的D值為49.421 d,在添加抗壞血酸的情況下,CS5+SA組的D值最高(34.788 d),說明該質量濃度的CS+SA對花色苷顏色降解的延緩作用效果最好,與其他實驗組相比能最大限度地減少花色苷的氧化降解。

表2 花色苷在不同模型飲料體系中的降解動力學參數

2.3 SA對含CS的模型飲料中花色苷作用的分子動力學模擬分析

采用分子動力學模擬技術分析SA對CS存在時花色苷顏色的保護作用機制。以黑米花色苷的主要成分矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)為模型,計算機模擬CS、SA及花色苷的分子運動軌跡和產生的相互作用見圖5。從圖5(a)中花色苷的運動軌跡可知,當花色苷單獨存在時,其自身會發生結合并聚集,氫鍵和芳香環上的π-π堆積是其分子間主要驅動力[圖5(b)]。圖5(c)顯示,當CS存在時,會吸引花色苷分子靠近,并通過氫鍵與花色苷結合。與CS組相比,SA的存在促進更多數量的花色苷分子向CS靠近。圖5(d)顯示,游離的SA可與花色苷分子形成氫鍵和π-π堆積,而SA和花色苷均可與CS通過氫鍵結合。從花色苷的結合位點來看,游離SA促使了花色苷分子從兩側與CS結合,這也就解釋了CS組與CS+SA組對花色苷顏色保護作用的差異。

圖5 不同體系中分子運動軌跡及相互作用的分子動力學模擬Fig.5 Molecular dynamic simulation of molecular trajectories and interaction of different systems

不同體系的分子動力學相關參數分析結果見圖6。圖6(a)和圖6(b)分別提取了CS和CS+SA存在時的兩個花色苷體系的均方根差(root mean square deviation,RMSD)值和CS分子的RMSD值。RMSD值揭示了分子在模擬過程中構象與初始構象的位置變化。由圖6(a)可見,隨著模擬時間的延長,添加CS和CS+SA的兩個花色苷體系RMSD值分別在5.8 nm和5.1 nm附近波動,說明所有體系中分子的位置不再發生劇烈變化,最終都達到了穩定的平衡狀態[40]。對CS分子的RMSD值分析表明,CS和CS+SA體系中的CS分子均在0.35 nm附近小范圍波動,表明兩個體系的CS均具有比較穩定的分子結構[41]。溶劑可及性表面積(solvent accessible surface area,SASA)表示模擬過程中聚合物與溶劑相互作用的比值,以此預測結合過程中構象變化的程度,也常用于分析體系疏水作用的變化。由圖6(c)可觀察到,在整個模擬過程中,兩個體系中CS的SASA值都能保持在 14 nm 附近的范圍內,表明CS和CS+SA兩個體系的結構都比較穩定。在模擬時間為35 ns處,當SA存在時CS的SASA值下降,說明該體系中疏水相互作用參與了CS與花色苷分子的結合[25]。

圖6 分子動力學模擬下不同體系的RMSD、SASA及氫鍵相關參數分析Fig.6 Parameters of RMSD、SASA and hydrogen bonds analysis of different systems under molecular dynamic simulation

體系中氫鍵的數量也能夠表明不同體系對花色苷的保護程度及差異。圖6(d)和(e)分別表示CS與花色苷分子之間的平均氫鍵數量以及非溶劑的氫鍵數量。有研究認為,配體的結合親和力會隨著氫鍵數量的變化而變化[42],可以看出,CS+SA體系比CS體系與花色苷之間形成了更多氫鍵,尤其是非溶劑的平均氫鍵數量,即加入SA促進了CS與花色苷的結合,說明CS+SA體系的結構更為穩定[43]。

分析不同體系中能量的差異能夠更好地解釋花色苷的穩定性。范德華力和靜電力是兩種相互作用力,其數值可用來比較不同體系的相互作用強度,絕對值越大表示相互作用越強。各體系之間的相互作用的能量計算結果見表3。由表3可知,在對本研究中不同體系的能量表征中發現,花色苷與花色苷分子之間的能量并沒有明顯的差異,而CS+SA體系與花色苷分子之間的總能量(-2 442.67 kJ/mol)要低于單獨的CS體系與花色苷分子之間的總能量(-2 157.74 kJ/mol),說明 CS+SA體系與花色苷的結合更加穩定。進一步對表3中CS+SA體系中不同分子間的相互作用力進行分析,結果顯示,CS與花色苷之間主要產生的是范德華力,而SA與花色苷之間則是由庫侖相互作用主導的。

表3 不同體系在分子動力學中的相互作用能量分析

分子動力學模擬驗證了加速儲藏實驗中的結果,即與單一的CS體系相比,CS+SA體系可以與花色苷有更強、更穩定的相互作用,SA能有效延緩CS存在時花色苷的降解速度。

3 結 論

本研究通過加速儲藏實驗研究了CS和CS+SA體系對花色苷顏色和含量的穩定性影響,并利用分子動力學模擬對其作用機制進行了分析。結果表明,與以往研究采用單一的CS體系相比,SA的加入對含CS的模型飲料中抗壞血酸造成的花色苷降解起到了改善作用,減少了儲藏過程中花色苷顏色的變化和含量的下降,可使花色苷的保留率最高達36.52%,并使花色苷的降解速率常數顯著降低,半衰期明顯提高。分子動力學模擬顯示,游離的SA可與花色苷分子形成氫鍵和π-π堆積,促使花色苷分子靠近CS+SA復合物,產生較為穩定的結構,復合物和花色苷分子之間相互作用產生的總能量可達-2 442.67 kJ/mol。SA與CS聯用能有效地提高花色苷的穩定性,顯著減輕花色苷因受到抗壞血酸自氧化作用而降解的程度。殼聚糖目前未被列入國標規定的飲料類食品添加劑中,本研究僅是對提高花色苷模型飲料穩定性的一種探討。在本研究的基礎上,結合實際,選擇國標推薦的食品添加劑,將酚酸、多糖聯用的輔色機理運用于花色苷模型飲料中還有待深入研究。