熱反應牛骨香精酶解工藝優化及關鍵氣味化合物鑒定

王海麗, 關 鑫, 唐 源, 宋煥祿,*, 潘文清, 龔 林, 陳琬盈

(1.北京工商大學 食品與健康學院, 北京 100048;2.湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司, 湖南 長沙 410100)

畜禽骨是一種營養價值較高的肉類加工副產品。隨著畜禽養殖業的擴大、屠宰量的增多,畜禽骨的產量隨之增加,畜禽骨及其相關副產物的加工與增值利用成為了研究熱點。牛骨素是牛骨的加工粗產物,是牛骨經過粉碎、加熱浸提、過濾除渣、離心除油、濃縮后制得的牛骨髓抽提物。牛骨素中的優質蛋白含量高約34%,可溶性固形物含量約50%;根據制作過程中是否離心除油,牛骨素可分為濃湯型、清湯型等產品類別。近年來,天然香料香精的需求處于不斷上升的趨勢,以牛骨素作為蛋白酶解物來源,與糖類、氨基酸等原料,通過美拉德反應制備的熱反應牛骨香精屬于天然產品的范疇,既具有牛肉的獨特香味,又有骨湯的鮮味,是深受消費者喜愛的復合調味料。

蛋白質水解是食品工業中開發肉類風味香精的重要過程。在食品生產過程中,游離氨基酸和多肽可以作為重要的風味前體物對食品質量產生影響:一方面其本身能夠呈現一定滋味,而且還能與其他滋味成分交互作用增強或者減弱食品風味[1];另一方面可作為風味原料或前驅物直接與糖類發生美拉德反應,增強香氣[2]。通過定向控制骨素酶解條件可產生多樣化的目標產物,用于開發各種風味濃郁、醇厚自然的肉味香精[3]。目前,研究多集中于雞骨素和豬骨素等[4-7],對于酶解牛骨素制備熱反應牛骨香精的研究較少,因此,制備出風味醇厚、圓潤自然的熱反應牛骨香精具有較高的市場價值。

Chiang等[8]研究了內切蛋白酶和外切蛋白酶酶解處理對牛骨提取物理化性質的影響,結果證明骨素的酶解在將低值肉制品轉化為具有低黏度、無凝膠特性的高值功能成分方面展示了潛力。Zheng等[9]研究了微波和超聲波對牛骨蛋白酶水解產物的水解度、抗氧化活性和風味特性的影響,結果發現微波結合超聲波可以提高牛肉骨粉中蛋白質的酶解效果,改善酶解產物的抗氧化性能和風味。Dong等[10]從雞骨素中高壓提取蛋白質,發現雞骨素在酶解8 h后,小分子肽含量與酶解1 h相比增加了74倍,結果證明雞骨素及其酶解產物是一種新的、潛在的適合各種食品的營養補充劑。但已有研究均未對酶解骨素再經熱反應制得的熱反應香精進行深入研究。因此,本研究以牛骨素為原料,選用復合蛋白酶,利用單因素實驗和響應面試驗考察酶解溫度、酶解時間、復合酶加酶量及復合酶加酶比例對酶解液水解度,以及由酶解液與糖、氨基酸等原料經美拉德反應制備的熱反應牛骨香精的感官評分的影響,并利用高效液相色譜法測定游離氨基酸質量比、利用全二維氣相色譜-嗅聞-質譜技術,分析牛骨素酶解前后制備的熱反應牛骨香精關鍵氣味化合物的質量比。本研究旨在為熱反應牛骨香精工業化生產中的酶解工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨素(清湯型,蛋白質質量分數為35%、氯化鈉質量分數為13%、可溶性固形物質量分數為47%)、水解植物蛋白(hydrolyzed vegetable protein,HVP),湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;葡萄糖、木糖、半胱氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫胺素,河南興源化工產品有限公司;復合風味蛋白酶FlavourzymeTM500MG(1.0×105U/g)、諾維信復合蛋白酶ProtamexTM(1.5×105U/g),丹麥諾維信公司;氨基酸混合標準試劑、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(9-fluorenylmethyl chloroformate, FMOC),美國Sigma公司;硼酸鹽緩沖溶液、甲醇、乙腈、磷酸二氫鈉、甲醛、氫氧化鈉,國藥集團化學試劑有限公司;2-甲基-3-庚酮,上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

8890A-5977型全二維氣相色譜-嗅聞-質譜[配備的一維色譜柱為DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm),二維色譜柱為 DB-17ms(1.85 m×0.18 mm×0.18 μm)]、1200型高效液相色譜,美國安捷倫公司;Sniff 9100型嗅聞儀,瑞士Brechbuhler公司;BSA124S型電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司;MP511型pH計,上海雙旭電子有限公司; SA402B型電子舌,日本INSENT公司;HH-2型數顯恒溫水浴鍋,北京天林恒泰科技有限公司;CR22N型高速冷凍離心機,天美(中國)科學儀器有限公司;KD-310型凱氏定氮儀,嘉盛(香港)科技有限公司;PEN3型便捷式電子鼻,德國Airsense公司。

1.3 實驗方法

1.3.1酶解液的制備

酶解液的制備參考文獻[11]方法并做出優化。將50 g牛骨素加入錐形瓶,于恒溫水浴鍋中加熱,待溫度恒定后加酶,開啟電動攪拌棒進行攪拌,保持恒溫酶解。酶解反應結束后將水浴溫度迅速升至90 ℃,恒溫保持10 min滅酶,制得牛骨素酶解液,冷卻至室溫備用。重復實驗3次。

1.3.2熱反應牛骨香精的制備

根據實驗室前期的方法并進行優化[12]。稱取牛骨素酶解液30.0 g,添加蒸餾水14.0 g、葡萄糖0.5 g、木糖1.0 g、半胱氨酸1.0 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、硫胺素0.5 g和HVP 2.5 g于錐形瓶中,在pH值為7.0、120 ℃條件下反應1 h制備熱反應牛骨香精,冷卻至室溫備用,重復實驗3次。

1.3.3水解度的測定

參照文獻[13]的方法,對牛骨素酶解液的水解度進行測定,計算方法見式(1)。

(1)

式(1)中,氨基酸態氮的測定使用甲醛滴定法,g;總蛋白質量的測定使用凱氏定氮儀,g。

1.3.4熱反應牛骨香精的感官評價

由北京工商大學分子感官科學實驗室成員(平均年齡為27歲)組成的感官評價小組,所有參加的評價員均符合ISO 6658、ISO 8586-1和ISO 8586-2要求。實驗前對氣味屬性和基本五味進行4 h的感官訓練,對熱反應牛骨香精的整體風味輪廓進行評價。實驗步驟:準確稱取10 g樣品于40 mL頂空瓶中,在55 ℃的恒溫金屬浴中加熱。氣味評價時需在相鄰樣品之間間隔5 min,必要時使用咖啡豆緩解嗅覺疲勞。滋味評價時將樣品稀釋10倍,并打亂序號,每兩個樣品之間使用純凈水漱口。滋味和氣味的感官評價均按照10分制(6個梯度):未感知為0分,極弱為1～2分,氣味或滋味較弱為3～4分,中等強度感知為5～6分,氣味或滋味感知較強為7～8分,非常強烈為9～10分,感官評價使用的參比標準溶液見表1。

表1 感官評價使用的參比標準溶液

感官評分的計算見式(2)。

感官評分=0.6×(0.5×肉香分+0.3×烤香分+
0.2×焦糖香分+0.2×辛香分-0.1×酸味分-0.1×
焦煳味分)+0.4×(0.5×鮮味分+0.5×咸味分+
0.2×甜味分-0.1×苦味分-0.1×酸味分)。

(2)

1.3.5牛骨素酶解工藝的優化

1.3.5.1 單因素實驗設計

控制其他條件不變,依次考察酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)、復合酶加酶量(750、1 000、1 250、1 500、1 750 U/g) 、復合酶加酶比例[復合風味蛋白酶的加酶量(以酶活計)∶復合蛋白酶的加酶量(以酶活計)為1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2]對牛骨素酶解液水解度和制備的熱反應牛骨香精感官評分的影響。

1.3.5.2 響應面試驗設計

在單因素實驗基礎上,以酶解溫度、酶解時間、復合酶加酶量和復合酶加酶比例(復合風味蛋白酶的加酶量:復合蛋白酶的加酶量)4個因素作為自變量,以不同條件下制備的熱反應牛骨香精感官評分為響應值,設計4因素3水平的響應面試驗。采用Design-Expert 8.0軟件Box-Behnken方法進行試驗設計,確定較優的酶解條件。

1.3.6游離氨基酸的測定

1.3.6.1 游離氨基酸的定性和定量

游離氨基酸的定性和定量方法參考文獻[14]方法進行。利用高效液相色譜,采用安捷倫的柱前衍生法對牛骨素、酶解液、熱反應牛骨香精中的16種游離氨基酸進行定量分析。分別取2 g牛骨素、酶解液、熱反應牛骨香精加入6 g 0.1 mol/L的HCl,在4 ℃、10 000 r/min離心15 min,取上清液,過0.45 μm尼龍濾膜,待儀器檢測,每個樣品做3次平行,結果以“平均數±標準偏差”表示。

測定條件。色譜柱為Zorbax Eclipse-AAA (4.6 mm×150 mm×5 μm), 流動相A為40 mmol/L的NaH2PO4溶液,pH值為7.8; 流動相B為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10,流速為1 mL/min,進樣量1 μL,檢測波長設置為338 nm,柱溫設置為45 ℃。梯度洗脫程序為0 min,0流動相B;1.9 min,0流動相B;18.1 min,37%流動相B;23.2 min,37%流動相B;24.0 min,100%流動相B;26.0 min,100%流動相B;27.0 min,0流動相B;30.0 min,0流動相B。

1.3.6.2 游離氨基酸滋味活性值的計算

參考文獻[15]方法測定游離氨基酸。利用滋味活性值(taste activity value, TAV)判斷呈味氨基酸對牛骨素、酶解液、熱反應牛骨香精滋味的影響。TAV的計算見式(3)。

(3)

式(3)中,CX表示味覺成分的質量比,mg/100g;R表示味覺成分的識別閾值,mg/100 g。

1.3.7氣味輪廓的測定

參考文獻[16]方法使用電子鼻對牛骨素、酶解液測定氣味輪廓。準確稱取樣品5 mL于40 mL頂空瓶中,55 ℃條件下加熱30 min,然后依次用電子鼻對揮發性氣味進行分析檢測,電子鼻載氣為干燥空氣,設置測試時間為300 s,清洗時間為100 s,每組樣品做3個平行。

1.3.8滋味輪廓的測定

參考文獻[17]方法使用電子舌對牛骨素、酶解液測定滋味輪廓。準確移取20 mL樣品于燒杯中,按照1∶4加入蒸餾水,以10 000 r/min離心15 min后通過0.45 μm濾膜抽濾至澄清,分別取30 mL樣品放于電子舌專用杯中進行檢測,采樣時間為120 s,每組樣品檢測4次。

1.3.9關鍵氣味化合物的鑒定

1.3.9.1 揮發性氣味化合物的測定

參考Wang等[18]的方法,利用全二維氣相色譜-嗅聞-質譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC×GC-O-MS)對牛骨素、酶解液分別制備的熱反應牛骨香精的揮發性氣味化合物進行測定。

準確稱取5 g樣品于20 mL干凈無異味的頂空瓶中,加入1 μL質量濃度為0.816 μg/μL的內標化合物2-甲基-3-庚酮(溶于正己烷),蓋好瓶蓋。設置自動化進樣程序,使樣品在55 ℃的條件下平衡20 min,插入萃取頭吸附40 min,在250 ℃條件下解析8 min。每個樣品做3個平行。

氣相條件。升溫程序為初始溫度40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min的速率升至230 ℃,保持5 min,調制周期為3.5 s,進樣口溫度為250 ℃。高純氦氣作為載氣,進樣分流比為2∶1,分流流量為2 mL/min。

質譜條件。離子源溫度為230 ℃,電子轟擊源為70 eV,質譜掃描范圍為全掃描,m/z范圍為40～500 u,四極桿溫度為150 ℃,檢測器溫度為250 ℃。

1.3.9.2 揮發性氣味化合物的定性定量分析

揮發性氣味化合物由質譜(mass spectrometry,MS)結果、化合物保留指數(retention index,RI)和氣味(odor,O)描述共同確定,化合物的質譜結果通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00和NIST 17數據庫根據結構和匹配度檢索鑒定,匹配度一般要求超過700,然后根據正構烷烴(C7～C30)獲得保留指數對化合物二次鑒定[19]。用內標化合物2-甲基-3-庚酮對熱反應牛骨香精中的揮發性氣味化合物進行半定量,計算方法見式(4)。

(4)

式(4)中,CX為待測化合物的質量比,ng/g;CO為內標的質量濃度,0.816 μg/μL;AX為待測揮發性氣味化合物的峰面積;AO為內標化合物的峰面積;m為樣品的質量,g;V為內標的體積,μL。

1.3.9.3 關鍵氣味化合物的氣味活性值計算

使用氣味活性值(odor activity value,OAV)評估關鍵氣味化合物對熱反應牛骨香精整體香氣的貢獻。OAV值計算方法見式(5)。

(5)

式(5)中,Ci表示揮發性氣味化合物的質量比,ng/g;OTi表示該化合物在水中的閾值,ng/g。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2019和Origin 2021軟件對數據進行整理,采用SPSS Statistics 19.0軟件對酶解液的水解度和牛骨素制備的熱反應牛骨香精的感官評分進行顯著性分析,結果表示為“平均值±標準差”,采用Design-Expert V8.0.6軟件分析響應面試驗結果。

2 結果與分析

2.1 牛骨素酶解工藝的優化結果

2.1.1單因素實驗結果

不同酶解條件對酶解液水解度和制備熱反應牛骨香精感官評分的影響見圖1。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

酶解效果可以由水解度反映,水解度越高,釋放的化合物越多[20]。DH的標準測定較復雜,本研究用式(1)的計算值進行粗略估算。復合風味蛋白酶和復合蛋白酶的較適酶解溫度均為50～55 ℃,45～65 ℃,隨著酶解溫度的升高,水解度和感官評分先上升后下降,50 ℃時水解度較高,肉香味厚重,當酶解溫度高于較適溫度后,酶活性降低或者部分活性喪失,水解度和感官評分呈下降趨勢。酶解時間為4 h時制備的熱反應牛骨香精感官評分較高,肉味濃厚,隨著酶解時間的延長,感官評分逐漸降低,可能是由于酶解時間過長,分解出的氨基酸與其他成分發生反應產生了不良氣味。4～6 h水解度無明顯差異,推測是因為底物與酶活性位點基本完全結合,無多余的酶活位點參與反應,考慮到節能,選擇4 h為較優酶解時間。復合酶加酶量為750～1 250 U/g時,酶解液水解度和熱反應牛骨香精的感官評分顯著增加(P<0.05)且與復合酶加酶量呈正相關,但加酶量繼續增加時,水解度和感官評分逐漸減緩但差異不顯著,這是因為底物一定時,隨著加酶量的不斷增加,沒有過多的底物與酶結合,且過量的酶反而會抑制酶反應的進行,因此,較適復合酶加酶量為1 250 U/g。復合酶加酶量一定,隨著復合風味蛋白酶與復合蛋白酶的加酶比例逐漸增加,當復合風味蛋白酶與復合蛋白酶加酶比例為3∶2時感官評分與水解度達到較大值,當復合酶加酶比例繼續增加時,感官評分和水解度呈明顯下降趨勢,這與復合蛋白酶單獨作用時水解度大于復合風味蛋白酶單獨作用有關,因此隨著復合風味蛋白酶比重的繼續增加會降低酶解液水解度。

2.1.2響應面試驗結果

響應面試驗設計與結果分析見表2和圖2。

圖2 不同的酶解因素交互作用對熱反應牛骨香精感官評分的影響Fig.2 Effect of interaction of different enzymatic hydrolysis factors on sensory score of thermal reaction bovine bone flavoring

表2 酶解工藝優化的響應面結果

對表2中的數據進行回歸分析,得到二次多項回歸方程為y=8.06+0.17A+0.38B-0.3C+0.013D-0.16AB-0.23AC+0.12AD-0.32BC+0.18BD+0.025CD-0.28A2-0.4B2-0.99C2-0.2D2。

因素間相互作用的強弱可以通過響應曲面反映,響應面呈凸形,表明因素之間的交互作用較強,作用顯著。由圖2可知,隨著各因素值的增加,感官評分呈現不同程度的上升趨勢,當各因素達到一定值繼續增加時,響應值逐漸降低,說明熱反應牛骨香精的感官評分與酶解溫度、酶解時間、復合酶加酶量、復合酶加酶比例之間呈非線性關系。只有在特定的酶解條件下制備熱反應牛骨香精,感官評分才會有較大值。通過模型得到的較優條件為酶解溫度50 ℃、時間4 h、復合酶加酶量1 250 U/g、復合風味蛋白酶與復合蛋白酶的加酶比例為3∶2,感官評分為8.24分,進行3次重復實驗后,感官評分為8.17分,與理論值無顯著性差異,說明該工藝具有可行性。

2.2 牛骨素、酶解液及熱反應牛骨香精中游離氨基酸的變化

牛骨素、酶解液及熱反應牛骨香精中游離氨基酸的質量比變化見表3。

表3 牛骨素、酶解液、熱反應牛骨香精中游離氨基酸的質量比、閾值、TAV值

游離氨基酸具有鮮味、甜味、苦味、無味等呈味特征[21], TAV用來表征化合物滋味活性的大小。

酶解液中除組氨酸和丙氨酸外,所有游離氨基酸的TAV相對于酶解前均顯著提升。鮮味氨基酸在酶解液中質量比較高,丙氨酸雖然主要提供甜味,但是與鮮味氨基酸具有協同提鮮的作用[22]。酶解液中苦味氨基酸約占游離氨基酸總質量比的一半,這與Kong等[23]的研究結果相似,其指出苦味氨基酸是雞肉酶解液中的主要氨基酸。另外,有研究表明,苦味氨基酸通常不具備味覺活性,苯丙氨酸和酪氨酸是苦味氨基酸也是芳香族氨基酸,當芳香族氨基酸閾值高于含量時,可以提高酶解液的鮮味和甜味[24]。由于美拉德反應過程的消耗,大部分氨基酸質量比均顯著性降低,推測這部分氨基酸轉變為其他重要的呈味物質[25],甜味氨基酸總量增加,可能與美拉德過程中涉及的Strecker降解、羰氨反應和肽降解等反應有關。熱反應牛骨香精相較于酶解液所有苦味氨基酸質量比均減少且TAV值均小于1,這與李嬌等[26]的研究一致,他們發現美拉德反應可以改善酶解液的滋味并改變氨基酸的組成和比例。因此,經酶解大量的呈味氨基酸被釋放出來,美拉德反應可以幫助減少酶解液中的苦味,增加鮮味和甜味,使熱反應牛骨香精的滋味得到改善。

2.3 牛骨素酶解前后的氣味輪廓分析結果

電子鼻分析牛骨素、酶解液的氣味輪廓主成分分析(principal component analysis,PCA)和雷達圖見圖3。由圖3(a)可知,PC1為86.8%,PC2為9.1%,貢獻率之和接近95.9%,說明兩個主成分能夠反映樣品之間的綜合信息。 PC1的方差貢獻率遠大于PC2,表明PC1軸向右距離越大,樣品差異性越大。兩個樣品在橫坐標上距離相對較近,但相互間無重疊部分,說明兩個樣品的揮發性物質有一定差異。由圖3(b)可看出R3、R4、R5、R9變化幾乎無影響,說明酶解后氨類、氫化物、有機硫化物、短鏈烷烴芳香等化合物的種類和含量變化不大。牛骨素和酶解液R2(對氮氧化物靈敏)、R8(對乙醇、部分芳香化合物靈敏)和R10(對長鏈烷烴類化合物靈敏)的響應值變化較為明顯,推測這3個感應器是區分兩個樣品的重要指標。說明在酶解后,酶解液產生更多的氮氧化物,同時使牛骨素烷烴類中具有不愉快氣味化合物的含量降低,在一定程度上可以改善牛骨素的整體風味。

圖3 牛骨素和酶解液電子鼻響應值的PCA和雷達圖Fig.3 PCA and radar plot of electronic nose response values of BBE and enzymatic hydrolyate

2.4 牛骨素酶解前后的滋味輪廓分析結果

電子舌分析牛骨素、酶解液的滋味輪廓主成分分析(PCA)和雷達圖見圖4。由圖4(a)可知PC1為77.1%,PC2為22.5%,貢獻率之和為99.6%,說明酶解前后兩個樣品的滋味存在顯著性差異。通過電子舌對牛骨素和酶解液中的4種基本味(酸、苦、咸、鮮)以及濃厚味、澀味進行滋味分析。由圖4(b)可知,酶解后鮮味值較大,酶解使鮮味氨基酸大量釋放,這與游離氨基酸的測定結果相符。濃厚味、咸味的響應值增加,可能是因為蛋白質水解后產生了具有咸味或類似咸味作用的肽[27]。酸味響應值小于-30,說明樣品中無該味道[28]?？辔俄憫到档偷珶o明顯變化,分析其原因,一方面可能是因為酶解過程中使用的復合風味蛋白酶包含內切蛋白酶和外切肽酶兩種活性,可用來降低水解產物的苦味肽鏈,將其徹底降解為氨基酸;另一方面可能與苦味氨基酸不具備味覺活性,苦味易被其他味道掩蓋有關。

圖4 牛骨素和酶解液電子舌響應值的PCA和雷達圖Fig.4 PCA and radar plot of electronic tongue response values of BBE and enzymatic hydrolyate

2.5 熱反應牛骨香精關鍵氣味化合物的鑒定結果

牛骨素、酶解液分別制備熱反應牛骨香精的特征風味二維譜圖見圖5。運用GC×GC-O-MS對牛骨素、酶解液分別制備的熱反應牛骨香精進行色譜分析,結合嗅聞檢測,共鑒定出揮發性化合物164種,包含27種醛類、30種酮類、12種醇類、16種酸類、7種含硫化合物、10種酯類、18種吡嗪類、10種呋喃類、6種噻唑類、4種噻吩類和24種其他類化合物,其中74種是氣味活性化合物。牛骨素制備熱反應牛骨香精樣品鑒定出145種揮發性化合物,酶解液制備熱反應牛骨香精鑒定出129種揮發性化合物。

圖5 牛骨素和酶解液制備的熱反應牛骨香精的全二維氣相色譜-嗅聞-質譜Fig.5 GC×GC-O-MS of thermal reaction bovine bone flavoring prepared by BBE and enzymatic hydrolysate

牛骨素和酶解液分別制備熱反應牛骨香精中揮發性氣味化合物的質量比和關鍵氣味化合物的OAV見表4和表5。已鑒別出的物質中,酶解液制備的熱反應牛骨香精產物中酸類物質總質量比顯著增加,可能是由于氨基酸降解后經過氧化或還原作用產生,也可能是由飽和脂肪酸本身氧化降解產生[29],牛骨素經酶解后發生美拉德反應生成了乙酸,乙酸具有強烈刺激性氣味,屬于低級飽和酸,雖然酸類化合物閾值較大,但酸類化合物與其他香氣成分之間具有協同效應,可以使熱反應牛骨香精整體氣味更加豐富和強烈。醛類物質與其他類型化合物相比,總質量比較高,酶解液制備的熱反應牛骨香精中產生了(E,E)-2,4-癸二烯醛,其閾值很低,OAV大于7,具有油味和雞肉香味,對熱反應牛骨香精的脂肪氣息具有貢獻作用。酮類化合物種類雖然較多,但其閾值相對較高,因此對熱反應牛骨香精風味的貢獻并不突出,然而有些酮類是形成雜環類化合物的重要中間體,對肉香味的形成有著必不可少的作用[30],4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮呈現焦糖氣息,具有明顯的增香增甜效果。含硫化合物主要來自美拉德反應的產物或者氨基酸的熱解,是決定肉味的關鍵物質,酶解液制備的熱反應牛骨香精中產生了2-甲基-3-呋喃硫醇、糠基甲基硫醚和甲基糠基二硫醚這幾種典型的肉香味化合物。含硫化合物閾值一般較低,因此這些化合物的產生對香精整體的肉香味特征形成具有重要的作用,這也是酶解液比牛骨素制備的熱反應牛骨香精肉香味更濃郁突出的原因之一。呋喃類化合物通常在焦糖化和糖降解過程中產生,能增加熱反應牛骨香精的焦糖味,對整體香氣有較好的修飾作用。噻吩和噻唑類主要由硫胺素降解產生,是肉制品中主要的香氣化合物。

表4 牛骨素和酶解液制備的熱反應牛骨香精中的揮發性氣味化合物

續表4

表5 牛骨素和酶解液制備的熱反應牛骨香精中關鍵氣味化合物的OAV Tab.5 OAV of key odor compounds of thermal reaction bovine bone flavoring prepared by BBE and enzymatic hydrolysate

此外,由表5可知,牛骨素和酶解液所制備熱反應牛骨香精產物中OAV>1的關鍵氣味化合物共有22種,包括醛類6種、酮類2種、醇類1種、酯類2種、吡嗪類3種、呋喃類2種、烯類2種、含硫化合物4種。主要差異為牛骨素制備的熱反應牛骨香精產物以果味、焦糖、烤香味為主,酶解液制備的熱反應牛骨香精具有更多的脂肪、肉味氣息,含硫化合物種類較多且貢獻較高,主要貢獻硫黃味、肉味和蔥香味。其次是醛類化合物,主要貢獻果香、花香、脂肪味。此外,酶解液制備的熱反應牛骨香精產物中新產生了β-石竹烯,OAV>1,增強了香料、辛香味,使美拉德反應產物香氣的豐富度與整體強度得以提升。

3 結 論

本研究通過單因素實驗和響應面試驗優化熱反應牛骨香精的酶解工藝,較佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、時間4 h、復合酶加酶量1 250 U/g、復合風味蛋白酶與復合蛋白酶的加酶比例為1∶1。利用高效液相色譜分析牛骨素、酶解液和熱反應牛骨香精中的游離氨基酸,發現酶解液中釋放出大量的呈味氨基酸,酶解液中谷氨酸、纈氨酸、精氨酸和酪氨酸的TAV大于1,鮮味和甜味突出;熱反應牛骨香精中的所有苦味氨基酸質量比減少,使熱反應牛骨香精的滋味得到改善。通過電子鼻和電子舌分析牛骨素、酶解液的氣味和滋味輪廓,發現酶解液中氮氧化物的氣味特征增強,且酶解液中的鮮味、濃厚味、咸味響應值更高。利用GC×GC-O-MS測定牛骨素、酶解液所制備熱反應牛骨香精中的揮發性氣味化合物,共鑒定出164種揮發性化合物,牛骨素制備的熱反應牛骨香精有145種揮發性氣味化合物, OAV>1的關鍵氣味化合物有17種,主要貢獻烤香味、果味和甜香味;酶解液制備的熱反應牛骨香精中共鑒定出129種揮發性化合物,有17種關鍵氣味化合物,但脂肪味、肉香味和蔥香味更明顯,與牛骨素制備的熱反應牛骨香精中的關鍵氣味化合物相比,酶解液制備的熱反應牛骨香精中新產生了(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-甲基-3-呋喃硫醇、甲基糠基二硫醚、己酸甲硫醇酯和β-石竹烯5種關鍵氣味化合物。后續將進一步研究酶解液中的其他呈味物質,分離鑒定其滋味肽,探索風味的形成機制,為牛骨素在呈味調味料中的開發提供參考。