大河烏豬火腿中新型α-葡萄糖苷酶抑制肽的分離、鑒定及活性研究

王道滇, 魏光強, 陶繼芳, 李 祥, 趙興文, 黃艾祥,*

(1.云南農業大學 食品科學技術學院, 云南 昆明 650201;2.云南東恒經貿集團有限公司, 云南 曲靖 655000;3.大理農林職業技術學院 食品工程學院, 云南 大理 671000)

糖尿病主要通過口服阿卡波糖、磺脲類和雙胍類藥物進行治療。然而,長期服用阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑會使患者出現肝損傷和腸絞痛等副作用[1]。食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽因較高的酶親和力、特異性、低免疫原性和低毒性備受關注[2]。目前,許多研究已經從各種食品中分離和鑒定出α-葡萄糖苷酶抑制肽。例如:Zhao等[3]從牛乳酪蛋白中鑒定出4條α-葡萄糖苷酶抑制肽;Hu等[4]從米糠皮中鑒定到一條穩定性較好的α-葡萄糖苷酶抑制肽GLLGY;Yang等[5]利用分子對接篩選技術,從熱壓榨花生粕蛋白中鑒定出4條α-葡萄糖苷酶抑制肽。同時,也有從干腌肉制品中分離和鑒定α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究。例如Mora等[6]從伊比利亞干腌火腿中鑒定出2條α-葡萄糖苷酶抑制肽,黃晶晶等[7]從皖浙花豬干腌火腿中鑒定出3條α-葡萄糖苷酶抑制肽。這說明干腌火腿可能是天然α-葡萄糖苷酶抑制肽的來源。目前,干腌火腿α-葡萄糖苷酶抑制肽的制備、鑒定和活性機制表征方面的相關研究較少,有待進一步加強;而且,不同的原料、加工環境及加工工藝都可能導致火腿肽譜及其生物活性的不同。因此,有必要對干腌火腿中肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行深入研究,以提供更多、更高抑制活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽,擴大α-葡萄糖苷酶抑制肽的來源。

大河烏豬是由云南本地的大河豬與“杜洛克”公豬雜交育成的國家級新品種豬,2003年被授予國家農產品地理標志產品(產品編號:AGI01438)[8]。目前,大河烏豬已被用于云南傳統干腌火腿的加工。前期研究,我們通過代謝組學明確了大河烏豬火腿的脂肪酸譜和特征風味物質,結果表明,大河烏豬火腿具有比三元雜交豬火腿更好的風味品質和滋味口感[9]。然而,大河烏豬火腿中是否存在生物活性肽尚不清楚,進一步探究大河烏豬火腿的肽譜,進行大河烏豬火腿中α-葡萄糖苷酶抑制肽的挖掘和活性機制研究,對于完善大河烏豬火腿品質的研究具有重要意義。

肽的分離和純化是一個復雜而耗時的過程。采用計算機輔助設計、在線數據庫比對、分子對接技術和構效關系等生物信息學分析方法,結合體外和體內實驗,不僅能快速、高效、低成本地篩選出具有潛在生物活性的肽序列,還可以從分子結構層面揭示肽的活性機制[10-13]。本研究擬采用超濾分離的方法,從大河烏豬火腿中制備不同分子質量的火腿肽,測定其α-葡萄糖苷酶抑制活性,采用液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectro-metry,LC-MS/MS)結合生物信息學分析方法挖掘出大河烏豬火腿中新型的α-葡萄糖苷酶抑制肽,探究其穩定性和分子作用機制,以期為大河烏豬火腿肽的進一步開發提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大河烏豬火腿[(10±1) kg],云南東恒經貿集團有限公司提供。甲醇、乙腈、甲酸,德國默克公司;α-葡萄糖苷酶(700 000 U/mL),上海源葉生物科技有限公司;對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG),上海寶曼生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA),上海易恩化學技術有限公司;胰酪蛋白胨,美國Sigma-Aldrich公司;硼砂,天津市瑞金特化學品有限公司;哌啶(6-氫吡啶),西隴科學股份有限公司;樹脂,吉爾生化(上海)有限公司;二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶,上海強盛化工有限公司;氨基酸,南京肽業生物科技有限公司;N,N-二異丙基乙胺、二異丙基碳二亞胺,蘇州昊帆生物股份有限公司;β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),國藥集團化學試劑有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;鹽酸、氫氧化鈉,天津風船化學試劑科技有限公司。以上試劑除甲醇、乙腈、甲酸為色譜純外,其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-18N/A型真空冷凍干燥機,上海比朗儀器制造有限公司;Millipore UFSC40001型超濾裝置,上海羽令過濾器材有限公司;Synergy H1型酶標儀,美國Biotek公司;Q-Exactive型四極桿質譜儀、Easy-nLC 1000型液相色譜儀,賽默飛世爾科技公司;豎行玻璃反應器,上海積坤化工科技有限公司;Nano型高效液相色譜儀,上海賽梵科分離技術有限公司;Inertsil ODS-SP型液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),島津(上海)實驗器材有限公司;DAISOPAK型C18制備柱(250 mm×30 mm,8 μm),江蘇智潤科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1大河烏豬火腿的制備

參照Wei等[9]的方法制備大河烏豬火腿。將8月齡豬的新鮮后腿,在溫度為3 ℃,相對濕度為85%的環境下預冷排酸18 h,修割整形。在溫度為3 ℃,相對濕度為85%的環境下,按每只鮮腿質量的5.5%稱取食鹽,上鹽腌制18 d。在溫度為 8 ℃,相對濕度為55%的環境中進行60 d的脫水平衡,最后在溫度為23 ℃、相對濕度為75%的環境下,進行360 d的發酵產香,得到成熟火腿。將成熟火腿的半膜肌和股二頭肌按1∶1的比例混合進行取樣,真空包裝,并保存在-20 ℃以備后續實驗用。

1.3.2肽的提取和肽含量測定

火腿肽的提取參照Mora等[14]的方法略加修改。取制備的火腿,剔除脂肪、剪碎,用液氮充分研磨為火腿粉末。稱取50 g火腿粉末于200 mL 0.01 mol/L HCl中冰浴10 min,均質勻漿3次,離心(4 ℃、8 000 r/min,30 min)。在上清液中加入3倍體積的甲醇溶液,4 ℃環境中冷藏20 h,再次離心除去蛋白質,收集上清液。將上清液經0.45 μm油系膜過濾、旋蒸去除甲醇溶液,得到粗肽提取液。用3 kDa和10 kDa的超濾膜分離出分子質量大于10 kDa、3～10 kDa和小于3 kDa的超濾液。將粗肽提取液和超濾液進行冷凍干燥,保存于-80 ℃冰箱中備用。

根據邢路娟等[15]的方法,采用鄰苯二甲醛分光光度法測定質量濃度為1 mg/mL粗提物和超濾組分樣品的肽含量。采用胰酪蛋白胨(0～1 mg/mL)作為標準品,測定吸光度,繪制標準曲線(y=0.771 5x+0.239,R2=0.998 9,y為吸光值,x為胰酪蛋白胨濃度);按式(1)計算測定樣品的肽含量。

(1)

式(1)中,A1表示經標準曲線計算得出的樣品中肽的質量濃度,mg/mL;A2表示測定樣品的質量濃度,mg/mL。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

參照Zhao等[3]的方法略加修改。吸取100 μL樣品溶液、50 μL α-葡萄糖苷酶溶液(700 U/mL)到96孔板中,37 ℃下反應20 min;加入50 μL 10 mmol/L對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液,混勻并在37 ℃下反應30 min,通過添加50 μL 0.67 mol/L Na2CO3終止反應。以100 μL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)替換樣品作為對照組,150 μL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液作為空白組,100 μL樣品溶液、50 μL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液作為樣品空白對照。使用酶標儀在405 nm處測量溶液的吸光度,每個樣品重復測定3次。α-葡萄糖苷酶抑制率計算方法見式(2)。

(2)

式(2)中,Ac表示對照組的吸光度;Ab表示空白組的吸光度;As表示樣品組的吸光度;An表示樣品空白對照的吸光度。

1.3.4肽的鑒定

參考劉問[16]的方法對分子質量小于3 kDa的火腿粗肽進行LC-MS/MS分析。LC條件:將樣品溶解在Nano-HPLC緩沖液A中,進行液相系統分離(緩沖液A液為0.1%的甲酸水溶液,B液為0.1%的甲酸-乙腈水溶液,其中乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡,樣品由自動進樣器上樣到上樣柱[Acclaim PepMap nano-Viper C18型(100 μm×2 cm, 5 μm),賽默飛世爾科技公司],經過分析柱[C18型(75 μm×10 cm,3 μm),賽默飛世爾科技公司]分離,流速為 300 nL/min,洗脫時間為 30 min。 MS條件:樣品經色譜分離后進行質譜分析。分析時長為60 min,檢測方式為正離子,母離子掃描范圍m/z為300～1 600,一級質譜在m/z為200時的分辨率為70 000,自動增益控制目標為 1×106,一級最大注射時間為40 ms,動態排除時間為 30 s。 多肽和多肽碎片的質量電荷比采集方法:每次全掃描后采集20個碎片圖譜,二級質譜激活類型為高能碰撞解離,隔離窗寬度設置為m/z2,二級質譜在m/z為200時的分辨率為17 500,微碎片圖譜數為1,二級注射時間為50 ms,規一化碰撞能量為 27 eV。 用Proteome Discoverer1.4軟件與數據庫(uniprot-Sus-scrofa-122175-20220218)進行肽的查庫鑒定和比對。

1.3.5活性肽序列的篩選

通過PeptideRanker系統(http:∥distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)對肽序列進行評分,分數越高(0～1),多肽具有生物活性的概率就越高。此外,采用PepDraw系統(https:∥pepdraw.com)評估了多肽在pH值為7時的凈電荷。通過ToxinPred服務器預測每條肽的潛在毒性和關鍵物理化學性質。采用PEPTIDE 2.0(http:∥www.peptide2.com/N_peptide_hydrophobicity_hydrophilicity.php)評估肽的疏水性比例?；贐IOPEP-UWM數據庫(https:∥biochemia.uwm.edu.pl/)檢索已存在的α-葡萄糖苷酶抑制肽。

1.3.6肽的固相合成

采用體外Fmoc固相法,按照C端到N端的順序固相合成FELLKHQK、VATVSLPR、EALELLK、IIAPPERK、IEEALGDK 5條篩選出的肽序列。通過氨基酸連接反應、肽鏈連接反應和肽鏈剪切處理,制備出干燥的粗肽。采用高效液相色譜儀與高分辨質譜儀聯用對化學合成獲得的粗肽進行純化和檢測分析(純化條件:色譜柱以10%的乙腈水平衡5 min后,進行梯度運行;流動相A為0.1% 三氟乙酸水溶液,流動相B為0.1% 三氟乙酸乙腈溶液,流速為12 mL/min),根據質荷比檢測目標肽的離子大小,判斷目標多肽所在的峰域,將分析純度大于95%的樣品凍干,得到最終純品多肽。肽的合成在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.7肽IEEALGDK的穩定性測定

1.3.7.1 IEEALGDK熱穩定性和酸堿穩定性的測定

1)IEEALGDK的熱穩定性測定。配制質量濃度為3 mg/mL的肽溶液,分別置于室溫(25 ℃)、40、60、80、100 ℃環境中保溫2 h,急速冷卻至室溫,評價其α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。

2)IEEALGDK的酸堿穩定性測定。分別用pH值為3、5、7、9、11的水溶液將IEEALGDK稀釋至3 mg/mL;室溫振蕩反應2 h,結束后調節樣品的pH值為7.0,評價其α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。

1.3.7.2 IEEALGDK體外消化穩定性的測定

參照姚軼俊等[17]的方法略加修改。模擬胃消化:取適量肽溶解在NaHCO3(200 mmol/L,pH值為7.0)中,用1 mol/L HCl調節pH值至2.0,加入質量分數為4%的胃蛋白酶,37 ℃條件下震蕩消化2 h,95 ℃水浴15 min滅酶。模擬腸消化:取滅酶后的胃消化液,用1 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.5,添加質量分數為4%的胰蛋白酶,37 ℃下震蕩消化2 h,95 ℃水浴滅酶。將胃消化液和腸消化液分別冷凍干燥,配制質量濃度為3 mg/mL的肽溶液,評價其α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。

1.3.8分子對接模擬

使用AutoDock Vina 1.1.2軟件評估合成肽與α-葡萄糖苷酶的對接模式。α-葡萄糖苷酶(4J5T)的晶體結構來源于蛋白質數據庫(PDB)(https:∥www.rcsb.org/)。使用ChemBio2D Ultra 3.14軟件包預測肽的二維結構,經ChemBio3D Ultra 3.14軟件轉換為3D結構。α-葡萄糖苷酶的X射線結構從RCSB蛋白數據庫獲得。肽被選為配體,酶被選為受體;在分子對接分析中,利用α-葡萄糖苷酶的X射線結構確定的天然配體的位置被用作結合點。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件進行對接模擬。α-葡萄糖苷酶活性口袋的坐標設置為center x:21.383,center y:14.226和center z:16.565;搜索空間坐標設置為sizes x:15,size y:15和size z:15。將搜索精度設置為20。對接后,結合位點的氨基酸側鏈可以根據配體的構象進行優化和調整。根據評分選擇最佳結合模式進行分析,用PyMol 1.7.6軟件(http:∥www.pymol.org/)繪圖和分析。

1.3.9火腿肽對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值測定

將樣品稀釋成不同的5個濃度梯度,采用1.3.3中式(2)的方法測定其α-葡萄糖苷酶抑制率,進行非線性擬合,得出回歸方程,計算α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。用IBM SPSS 25.0軟件分析實驗數據,用Duncan’s多重比較方法進行平均值之間的差異顯著性分析;P<0.05表示數據具有顯著性差異。采用Microsoft Excel 2010和Origin 2019b進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 火腿粗肽的肽含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

2.1.1肽含量分析

超濾可以截留大分子物質,有效地分離和富集出具有較高生物活性的低分子質量肽段[3-5]。本研究通過超濾分離,制備不同分子質量的火腿肽,采用鄰苯二甲醛法測定火腿提取物的肽含量,實驗結果見表1。由表1可知,大河烏豬火腿粗提物中肽的質量分數為72.28%±1.65%,低于金華火腿(74.87%±15.44%)[15],這可能是因為金華火腿(30 d)比大河烏豬火腿(18 d)腌制時間長,導致金華火腿中蛋白質水解得到的多肽含量更高[18]。經超濾分離后,分子質量小于3 kDa組分的肽含量顯著高于其他兩個組分(P<0.05),這說明大河烏豬火腿中的肽主要以分子質量小于3 kDa的短肽為主。Wang等[19]測定了成熟期10個月,分子質量小于3 kDa的羊肉火腿和宣威火腿中肽的質量分數分別為5.68%和4.34%,低于本研究中分子質量小于3 kDa組分的肽的質量分數(38.37%)。羊肉火腿和宣威火腿成熟期為10個月,大河烏豬火腿的成熟期為12個月。在本研究中,分子質量小于3 kDa的大河烏豬火腿肽含量高于羊肉火腿和宣威火腿,這可能是因為大河烏豬火腿較長的成熟期,導致火腿中的蛋白質被內源酶和肽酶更加充分地水解為小肽和游離氨基酸[20]。

表1 火腿提取物中的肽質量分數

2.1.2火腿粗肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

不同超濾組分,大河烏豬火腿肽對α-葡萄糖苷酶抑制活性的分析結果見圖1。由圖1可知,分子質量小于3 kDa組分肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于其他分離組分,這表明低分子質量的火腿肽具有更強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。質量濃度為10 mg/mL時,分子質量小于3 kDa組分肽的α-葡萄糖苷酶抑制率為66.90%,高于同等濃度下,皖浙花豬干腌火腿肽GPAGPQGPRG對α-葡萄糖苷酶的抑制活性(65.83%)[7]。本研究結果表明,分子質量小于3 kDa組分的大河烏豬火腿肽具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖1 火腿粗肽組分的α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.1 Inhibitory rate of crude ham peptide on α-glucosidase

2.2 火腿肽的鑒定結果

采用LC-MS/MS鑒定了大河烏豬火腿中肽的氨基酸序列,分析結果見圖2。經圖2(a)和數據庫(uniprot-Sus-scrofa-122175-20220218)比對分析,從大河烏豬火腿中鑒定出143條肽序列。由圖2(b)和圖2(c)可知,這些肽主要由6～15個氨基酸組成,以分子質量小于1.5 kDa的短肽為主(76.92%)。通過UniProt數據庫將鑒定的肽進行蛋白質來源比對分析,大河烏豬火腿中的肽主要來源于肌球蛋白(32.09%)、肌鈣蛋白(12.69%)和 β-烯醇化酶(11.94%)[圖2(d)]。黃晶晶等[7]從皖浙花豬干腌火腿中鑒定出104條鏈長為8～24個氨基酸的肽序列,其主要來源于平滑肌肌動蛋白α2、肌球蛋白-4、I型膠原蛋白α1鏈、肌酸激酶、肌球蛋白輕鏈1。Li等[20]從盤縣火腿中鑒定出66條含有2～16個氨基酸殘基,主要來源于肌球蛋白和β-烯醇化酶的肽序列。干腌火腿中肽的含量和來源差異與加工時間和內源酶的活性密切相關,較高的酶活性和較長的后熟時間有利于促進蛋白質水解為氨基酸和小肽[18]。在本研究中,大河烏豬火腿中鑒定到的肽數量高于皖浙花豬干腌火腿和盤縣火腿中鑒定到的肽。這可能是較長的后熟時間和較高活性的內源酶導致大河烏豬火腿中的蛋白質充分地降解為更多數量的小肽。

圖2 火腿肽的鑒定和分析Fig.2 Identification and analysis of ham peptides

2.3 新型α-葡萄糖苷酶抑制肽的篩選結果

生物信息學分析方法是一種快捷、可靠的生物活性預測方法,被普遍應用于潛在生物活性肽的篩選和分析[21]。肽的生物活性與其氨基酸組成、理化特性以及分子質量大小密切相關[20]。以往對α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究表明:1)大多數具有較高生物活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽為氨基酸殘基數小于10的寡肽[22],肽鏈C端的精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)是保證活性肽發揮α-葡萄糖苷酶抑制活性的必要氨基酸殘基[23]。2)疏水性氨基酸含量較高的肽對α-葡萄糖苷酶具有更好的抑制活性[3],亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro)等疏水性脂肪族氨基酸能促進胰島素分泌,是構成α-葡萄糖苷酶抑制肽的重要氨基酸殘基[24-26]。3)絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和蛋氨酸(Met)是活性肽發揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的關鍵殘基[23]。4)甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)可以促進胰島素的分泌,改善飲食引起的高血糖癥[27-28]。

本研究根據α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸組成特征,從143條肽序列中篩選出FELLKHQK、VATVSLPR、EALELLK、IIAPPERK、IEEALGDK 5條可能具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽序列,篩選結果見表2。由表2可知,5條肽序列的C端都存在精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys)。肽IEEALGDK帶2個負電荷,序列中含Leu、Gly、Ile、Ala等可以促進胰島素分泌的氨基酸殘基。肽VATVSLPR和IIAPPERK的疏水性氨基酸占比均高達62.50%。IIAPPERK的肽鏈得分值較高(0.33),經BIOPEP-UWM數據庫檢索,IIAPPERK中的片段IIAPPER具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。經ToxiPred服務器預測,所篩選的5條肽都無毒性。對比BIOPEP-UWM數據(https:∥biochemia.uwm.edu.pl/),5條肽均未被研究報道,說明本研究篩選的肽是新穎的。因此,選擇這5條可能具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的新型肽進行下一步研究。

表2 新型肽的理化特性

2.4 合成肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性和穩定性分析

2.4.1合成肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

為明確篩選肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性,采用固相法合成了FELLKHQK、VATVSLPR、EALELLK、IIAPPERK和IEEALGDK共5條肽段,通過α-葡萄糖苷酶抑制實驗進一步測定合成肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性,實驗結果見圖3和表3。由圖3(a1)、(b1)、(c1)、(d1)、(e1)和表3可見,5條合成肽的純度都大于95%。由圖3(a2)、(b2)、(c2)、(d2)、(e2)可知,各合成肽的分子質量測定值與其理論值相近,這表明肽的合成結果可靠,具體數據見表3。5條合成肽中,只有肽段IEEALGDK具有 α-葡萄糖苷酶抑制活性,其IC50值為1.42 mg/mL(回歸方程:y=0.338x+0.021 3,R2=0.910 7)(表3)。本研究中,IEEALGDK對α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于伊比利亞干腌火腿[6]中鑒定到的肽AEEEYPDL(IC50值為5.38 mg/mL)、LGVGG(IC50值為2.55 mg/mL)、GGLGP(IC50值為3.48 mg/mL)以及酸乳清水解物[13]中的肽YPVEPF(IC50值為3.52 mg/mL)、VPYPQ(IC50值為4.13 mg/mL)、LPYPY(IC50值為4.17 mg/mL)。本研究結果表明,IEEALGDK是一條具有較強α-葡萄糖苷酶抑制活性的新型生物活性肽。

圖3 合成肽的色譜及質譜Fig.3 Chromatograms and mass spectroscopy analysis of synthetic peptides

表3 合成肽的色譜、質譜信息及抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值

目標峰峰高由液相色譜輸出的電壓信號轉化而來(1 AU=1 000 mV)。合成肽純度計算公式為合成肽純度=(目標峰的峰面積/總峰面積)×100%;合成肽的分子質量計算公式為m=(M+n)/n,m代表質荷比(m/z),M代表分子質量,n代表離子峰所帶電荷數。No表示目標肽無α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.4.2肽段IEEALGDK的穩定性分析

生物活性肽在到達α-葡萄糖苷酶活性靶點和被人體吸收利用之前,可能會受到酸堿環境、加工溫度和人體胃腸消化環境等的影響[5]。因此,本研究測定了不同pH值、溫度和模擬胃腸消化條件下IEEALGDK的活性變化,分析結果見圖4。

不同小寫字母表示各組數據間差異顯著(P<0.05)。

由圖4(a)可知,IEEALGDK在強酸(pH值為3)和強堿(pH值為11)條件下的α-葡萄糖苷酶抑制率低于中性環境(P<0.05)。這可能是強酸強堿環境下,肽的活性片段發生外水解或脫酰胺反應,導致肽的二級結構改變,從而使活性下降[17],因此,活性肽的加工應該在中性環境中進行。由圖4(b)可知,IEEALGDK的α-葡萄糖苷酶抑制活性隨溫度的升高逐漸降低,90 ℃時,IEEALGDK對α-葡萄糖苷酶抑制率降低至91.15%。這可能是溫度升高,破壞了肽的二級結構和活性氨基酸殘基[5],影響其功能活性。然而,在所有處理溫度下,IEEALGDK對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均保持在90%以上。這表明IEEALGDK具有較高的熱穩定性,能夠在加工熱處理中保持較高的活性,是一種良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

由圖4(c)可知,模擬胃腸消化前后,IEEALGDK的α-葡萄糖苷酶抑制活性先增強后減小,抑制率能很好地保持在90%以上。胃消化階段α-葡萄糖苷酶抑制率增長至95.35%,腸消化階段結束時α-葡萄糖苷酶抑制率下降至92.04%。這可能是胃消化作用暴露出肽與α-葡萄糖苷酶結合的疏水性氨基酸位點[5],增強肽對α-葡萄糖苷酶的抑制活性;再經過腸消化后,肽在胰蛋白酶作用下進一步酶解為游離氨基酸,破壞了肽的二級結構,肽的功能活性降低。Hu等[4]發現,經胃腸道消化后,發酵米糠皮中的寡肽GLLGY對α-葡萄糖苷酶抑制活性降低至83.37%。Hu等[13]發現,經胃腸道消化后,酸乳清中α-葡萄糖苷酶抑制肽YPVEPF的生物活性降低至19.64%。胃腸消化穩定性結果顯示,IEEALGDK的胃腸耐受性高于酸乳清肽段YPVEPF和發酵米糠皮肽段GLLGY。這表明IEEALGDK在胃液和腸液中均能保持較強的抗消化能力。

本研究結果顯示,在高溫、強酸強堿和模擬胃腸消化條件下,IEEALGDK的α-葡萄糖苷酶抑制活性受到一定的影響,但抑制率仍能保持在90%以上。這表明IEEALGDK具有較強的耐酸堿、耐熱和抗消化能力,可以在食品加工和消化吸收過程中發揮有效的生物活性。

2.5 IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶分子對接結果

分子對接技術是識別受體蛋白與活性肽的對接位點和相互作用最有效的方法[12]。本研究采用分子對接技術探究了IEEALGDK抑制α-葡萄糖苷酶的作用機制,實驗結果見圖5和表4。圖5(a)為IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶分子最佳結合模式下的可視化結果圖,經PyMol 1.7.6軟件轉化得到最佳構象模式下的3D圖[圖5(b)]和2D圖[圖5(c)]。由圖5(b)可見,IEEALGDK能夠很好地嵌入α-葡萄糖苷酶分子的內部,這表明IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶對接良好。經AutoDock Tools 1.5.6軟件計算結合能大小,IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的結合能為-30.96 kJ/mol(表4),低于阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的結合能(-28.03 kJ/mol)和發酵米糠皮肽段GLLGY與α-葡萄糖苷酶的結合能(-29.71 kJ/mol)[4-5]。結合能的大小可用于判定復合物的穩定性,肽與α-葡萄糖苷酶結合所需能量越低,形成的復合物越穩定[5]。本研究中,IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的結合能低于阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的結合能和發酵米糠皮肽段GLLGY與α-葡萄糖苷酶的結合能,這說明IEEALGDK可以與α-葡萄糖苷酶形成較高穩定性的復合物。

圖5 IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的分子對接結果Fig.5 Molecular docking results of IEEALGDK and α-glucosidase

表4 IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶分子對接分析

生物活性肽主要通過氫鍵、疏水相互作用和鹽橋與α-葡萄糖苷酶的活性殘基位點結合,從而阻礙酶-底物復合物的形成和糖苷鍵的斷裂[24]。圖5(c)和表4顯示了IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的分子對接位點和分析結果。由圖5(c)和表4可知,IEEALGDK中的7個支鏈殘基(Glu4、Asp3、lle1、Glu1、Leu1、Gly1、Lys1)與α-葡萄糖苷酶的11個殘基(Gln617、Arg594、Tyr728、 Lys665、Asp724、Tyr720、His805、 His803、Ser466、Gln598、Lys597)之間形成15個氫鍵,平均鍵長為3.27 ?。同時,IEEALGDK與α-葡萄糖苷酶的12個氨基酸殘基(Ile667、Glu616、Glu470、Glu463、Leu666、Lys669、Pro668、Val620、Ser802、Arg727、Arg799、Arg467)之間形成疏水相互作用。這些氫鍵和疏水相互作用增強了IEEALGDK和α-葡萄糖苷酶之間結合的作用力和穩定性。Barker等[29]研究發現,精氨酸(Arg)、色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)是α-葡萄糖苷酶主要的活性殘基位點。Zhao等[3]發現,降血糖肽段RNAVPITPTLNR、TKVIPYVRYL、YLGYLEQLLR和FALPQYLK主要通過氫鍵和疏水相互作用與α-葡萄糖苷酶的潛在活性位點Arg387、Arg428、Arg727、Arg801、Arg799和Trp710結合,阻斷α-葡萄糖苷酶與底物復合物間糖基化的形成發揮降血糖作用。本研究結果顯示,IEEALGD主要通過氫鍵和疏水相互作用占據α-葡萄糖苷酶的潛在活性位點Arg594、Arg727、Arg799和Arg467,進而抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

3 結 論

采用LC-MS/MS技術,在大河烏豬火腿中鑒定出143條主要來源于肌鈣蛋白、肌球蛋白和β-烯醇化酶的肽序列?；谏镄畔W分析方法和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析,在143條肽段中篩選出一條新型的α-葡萄糖苷酶抑制肽IEEALGDK(IC50值為1.42 mg/mL)。肽的穩定性研究結果表明,IEEALGDK具有良好的熱穩定性、耐酸堿穩定性及胃腸道消化穩定性。分子對接結果分析表明,IEEALGDK主要通過氫鍵和疏水相互作用占據Arg594、Arg727、Arg799和Arg467等α-葡萄糖苷酶的活性殘基位點發揮酶的抑制作用。本研究表明,大河烏豬火腿肽IEEALGDK是一條穩定性較好的α-葡萄糖苷酶抑制肽,下一步可通過細胞或動物模型實驗進一步驗證肽的毒性和α-葡萄糖苷酶抑制活性,以便將其用于功能性食品的開發。