羊源性基因組DNA標準物質研制

紀藝，王凱莉，余卉茹，趙新，丁霖，彭城，徐俊鋒，陳笑蕓

1.浙江省農業科學院，農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，農業農村部農業轉基因生物溯源重點實驗室，杭州 310021；2.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 215211；3.湘湖實驗室，杭州 311231；4.天津市農業科學院，種質資源與生物技術研究所，天津 300384

肉制品是人類膳食結構的重要組成部分，是優質蛋白和優質脂肪的重要來源，也是人體微量營養素和礦物質主要攝取渠道之一［1］。然而，伴隨著日益增長的生產量和消費量，肉制品成為食品生產、加工、流通及餐飲領域中造假摻假的主要目標。一些不法企業和商販用低價肉或非肉成分冒充高價肉，摻雜在牛肉、羊肉等高價肉制品中，這些造假摻假的欺詐違法行為存在著巨大的公共衛生健康安全風險，嚴重侵犯了消費者權益［2-4］，因此應該廣泛關注肉制品安全問題［5］。對于肉類摻假，傳統的檢測主要依賴于解剖學、組織學、感官判斷［6-7］、酶聯免疫吸附法［8］、色譜法［9］等方法，但是這些方法的準確性和靈敏性存在局限性。而基于物種基因組DNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）在動物源性成分檢測中有明顯優勢。目前主流的分子檢測技術主要有凝膠PCR［10］、實時熒光定量PCR［11］、數字PCR［12］、等溫核酸擴增［13-15］和其他PCR技術［16-17］。國內外羊源性物質的檢測有標準化檢測方法（國家標準、行業標準和地方標準）和快速檢測方法，但是，要保障這些檢測結果的準確性與一致性需要標準物質作為衡量標準。目前，我國羊源性有證標準物質還處于空白狀態，因此，羊源性有證標準物質的研制刻不容緩。

根據JJF1001—2011《通用計量術語及定義》［18］的定義，標準物質是具有足夠均勻和穩定的特定特性的物質，適用于測量或標稱特性檢查中的預期用途，使檢測結果具有可靠性、可比性和可追溯性［19-20］。目前已經開發了幾種基于DNA的標準物質，用于轉基因生物［20-22］、癌癥診斷［23-25］、食源性病原體［26］和法醫學［27］檢測。

但現階段，國內外肉類標準物質的缺乏已經嚴重影響了肉類及肉制品檢測技術的標準化和已有標準的采用。為確保肉類中羊源性成分監測質量控制的準確性和一致性，以及保障消費者的知情權，亟需建立羊源性成分的檢測標準和研制羊源性國家有證標準物質［28］，從而實現各實驗室間數據可比和量值統一，為研制分子診斷即時檢測（point of care testing，POCT）技術提供計量溯源［18］，進而為我國肉類及肉制品的檢測和安全評價提供技術、信息和標準物質服務，為構筑生物安全防線提供重要的質量基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用羊肉來源于浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所十月齡湖羊（Ovis aries）羊腿肉，ddPCR Master Mix 購自伯樂公司（貨號186-3010）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取與檢測 用手術刀切取羊腿肉（≤2.5 g），根據杭州新景生物提取試劑盒說明書進行基因組DNA 提取，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。同時采用紫外吸收法（NanodropTM 2000，Thermo Fisher，DE，USA）和Qubit 2.0 檢測基因組DNA的濃度和純度。

1.2.2 數字PCR 方法 目的基因序列位于綿羊1號染色體（62334224-62334300）HELZ基因的1 個內含子上，用于特異性檢測的引物和探針為：F：5′-AGGTTGCGCCATGCTGTAG-3′；R：5′-CAGGACTTCTAATTTCGCCAGTAAC-3′；P：5′-FAMAGGAGGAATCCCCATCATCACGGCC-BHQ1-3′。

優化后HELZ基因的微滴數字PCR 體系為（20 μL）：2× ddPCR Master Mix 10 μL，1.0 μmol·L-1正反向引物各2 μL，1.0 μmol·L-1探針1 μL，DNA模板2 μL。微滴式數字PCR 反應程序如下：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃延伸1 min，40個循環；98 ℃酶滅活10 min，4 ℃保存，溫度速率2 ℃·s-1。使用軟件QuantaSoft Version 1.7.4分析實驗數據，獲得絕對定量結果。

1.2.3 標準物質制備和均勻性初檢 將提取的羊源性基因組DNA 標準物質分別稀釋10 倍和100倍，配置成高、低2個濃度，并在4 ℃環境下緩慢混勻24 h 后檢測HELZ拷貝數是否均勻。選擇標椎物質儲存管的上、中、下不同的部位取樣，每個部位各取2份樣品（分別標記為1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1），采用數字PCR 進行均勻性結果檢驗，對均勻性初檢結果進行單因素方差分析判斷標準物質的均勻性。

1.2.4 均勻性評估 對分裝完畢的200瓶樣品隨機選取12 管，每管取樣3 次，每次取樣2 μL，共36份樣品。采用數字PCR 方法分別對兩種羊源性HELZ基因DNA 標準物質進行均勻性評估。對檢測數據及兩種標準物質（高、低濃度）的拷貝數進行單因素方差分析，計算統計量F值，評估標準物質的均勻性。

1.2.5 穩定性評估 穩定性是標準物質的一個重要參數。穩定性評估包括短期穩定性（運輸穩定性）、長期穩定性和凍融穩定性。短期穩定性檢驗設置4 ℃和25 ℃兩個溫度，每個溫度分別放置0、3、7、14 d。每個溫度和時間處理隨機抽取3管，每管重復取樣3 次（N=3，n=3）。長期穩定性檢驗在-20 ℃下分別放置0、1、2、4、6 個月。每個溫度和時間處理隨機抽取3 管，每管重復取樣3 次（N=3，n=3）。凍融穩定性檢驗是隨機抽取3 管-20 ℃儲存的兩種標準物質反復凍融10 次并取樣標記在重復條件下對提取的基因組DNA 進行檢驗。短期穩定性、長期穩定性、凍融穩定性均采用數字PCR方法進行檢測，并依據《標準物質的定值及均勻性、穩定性評估》（JJF 1343—2022）［18］進行評估。對短期穩定性和長期穩定性檢驗數據繪制特性值隨時間變化曲線的線性模型（Y=β0+β1X），根據斜率是否顯著，判斷特性值在儲存期內是否穩定。對凍融穩定性檢驗數據進行t檢驗。

1.2.6 標準物質聯合定值 9家實驗室采用數字PCR對標準物質特性量值進行合作定值，每個實驗室分發每個濃度的標準物質2管，每管標準物質重復檢測4次。檢測完成后，將數據反饋給組織方匯總。依據《標準物質的定值及均勻性、穩定性評估》（JJF 1343—2022），對聯合定值數據先后進行實驗室內異常值檢驗數據正態分布和等精度檢驗。

1.2.7 數據處理及不確定度評估 依據《標準物質的定值及均勻性、穩定性評估》（JJF 1343—2022）［29］，分別評定均勻性相對不確定度（urel，bb）、短期穩定性相對不確定度（urel，ss）、長期穩定性相對不確定度（urel，ls）和定值相對不確定度（urel，c）。4個不確定度分別按公式計算出相對不確定度urel,CRM。

在95%置信度下，取包含因子k=2，計算標準值的相對擴展不確定度UCRM，Y表示標準值。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的鑒定與評價

提取的DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V 電泳20 min 后在凝膠成像分析系統拍照留存（圖1）。結果顯示，本批提取的基因組DNA 條帶單一、明亮、無彌散現象，質量符合要求。采用NanoDrop 和Qubit 進行純度和濃度的測定，其純度OD260/OD280置值為1.82，A260/A230為2.04，濃度為135 ng·μL-1，證明DNA 標準物質純度滿足制備要求。

圖1 羊源性DNA電泳檢測圖Fig.1 Electrophoretic detection of sheep DNA

2.2 均勻性初檢與分裝

采用數字PCR 進行均勻性結果檢驗，計算統計F值。檢測分析結果如表1所示，由于F＜F0.05（5，12），因此HELZ基因的拷貝數無統計學差異，表明溶液已混合均勻，最終作為羊源性基因組DNA 標準物質候選物，每種標準物質分裝200管，每管100 μL。為保證DNA不被降解，分裝完成后，將分裝的DNA置于100格冷凍冰盒中，-20 ℃冰箱保存。

表1 均勻性初檢統計分析結果Table 1 Results of statistical analysis of the uniformity

2.3 均勻性評估

對分裝完畢的200 管樣品隨機選取12 管，每管取樣3次，每次取樣2 μL。采用數字PCR方法對提取樣品中的拷貝數進行定量檢測。對檢測數據進行F檢驗，計算兩種標準物質統計量F值。均勻性評估中兩種羊源性HELZ基因DNA 標準物質分析結果見表2。由于F＜F0.05（11，24），表明羊源性HELZ基因DNA 標準物質（高濃度）以及羊源性HELZ基因DNA標準物質（低濃度）均勻性良好。

表2 均勻性統計分析結果Table 2 Uniformity statistical analysis results

2.4 穩定性評估

短期穩定性測試旨在考察標準物質的運輸穩定性，在運輸過程中不能排除高溫的情況，因此將樣品分別存儲在4、25 ℃，儲存0、3、7、14 d。2 種羊源性HELZ基因DNA 標準物質拷貝數的短期穩定性結果見表3，趨勢圖見圖2。檢測其標準物質HELZ拷貝數在4 ℃和25 ℃隨著儲存時間變化曲線（Y=β0+β1X）的斜率β1以及β1的標準偏差S（β1），并對S（β1）進行t檢驗。結果顯示，由于│β1│＜t0.95，3×S（β1），回歸曲線斜率不顯著。結果表明兩種標準物質在4 ℃和25 ℃至少能夠穩定保存14 d。

表3 短期穩定性評估結果Table 3 Short-term stability assessment results

圖2 標準物質在4、25 ℃短期穩定性趨勢圖Fig.2 Short-term stability trend of reference material at 4 and 25 ℃

長期穩定性考察是將樣品置于-20 ℃，分別放置0、1、2、4、6 個月后，檢測樣品在較低儲存溫度、長時間保存的穩定情況。兩種標準物質長期穩定性統計分析結果見表4，趨勢圖見圖3。通過檢測其HELZ基因拷貝數隨儲存時間的曲線變化，對S（β1）進行t檢驗，│β1│＜t0.95，2×S（β1）說明斜率不顯著。以上結果表明樣品在-20 ℃儲存6 個月后，基因拷貝數未發生顯著變化，因此兩種標準物質在-20 ℃至少可穩定保存6個月。

表4 -20 ℃長期穩定性評估結果Table 4 Evaluation results of long-term stability at -20 ℃

圖3 標準物質-20 ℃長期穩定性趨勢圖Fig.3 Long-term stability trend of reference material at -20 ℃

反復凍融可能會對標準物質穩定性造成影響。本研究對該批標準物質進行10 次反復凍融，檢驗2～10 次凍融樣品的拷貝數與第一次拷貝數的一致性，并進行t檢驗，兩種標準物質反復凍融穩定性統計分析結果見表5。統計結果顯示tβ1＜t0.95，8，兩種羊源性HELZ基因DNA 標準物質在反復凍融10 次后，使用過程中拷貝數無明顯上升或下降趨勢，且變化范圍均在特性量值及其不確定度范圍內。因此，兩種羊源性HELZ基因DNA標準物質在反復凍融10次后仍然是穩定的。

表5 凍融穩定性評估結果Table 5 Evaluation results of freeze-thaw stability

2.5 聯合定值結果

本研究組織9 家實驗室按照統一的定值程序在規定時間進行標準物質聯合定值。用狄克遜法和格拉布斯法分別檢驗9 家實驗室兩個濃度標準物質的定值數據，未發現實驗室內異常數據；用達戈斯提諾法對聯合定值數據進行正態性分布檢驗，當置信概率為95%時，統計值Y均落在達戈斯提諾法檢驗臨界區間，接收9 家實驗室對兩個濃度標準物質的聯合定值數據為正態分布；用狄克遜準則對兩個標準物質的9 家實驗室定值數據平均值進行統計檢驗，未發現異常平均值；采用科克倫法檢驗兩個標準物質的9 家實驗室間定值數據平均值是否等精度，統計量C 值均小于臨界值C（0.05，9，8），表明9家實驗室定值數據平均值間為等精度。聯合定值的數據實驗室內和實驗室間均無異常值，實驗室間數據等精度，且定值數據呈正態分布，定值數據符合標準JJF 1343—2022 的要求。計算定值數據的總平均值，作為標準物質特性量值拷貝數的標準值，聯合定值結果見表6。RSD值＜25%，表明9家實驗室間重復性較好。

表6 9家實驗室聯合定值數據分析Table 6 Analysis of joint setting data from 9 laboratories

2.6 測量不確定度評定

標準物質的不確定度主要來源于均勻性引起的不確定度、穩定性引起的不確定度和定值過程帶來的不確定度。根據標準物質的均勻性評估和穩定性評估數據，分別評定均勻性相對不確定度（urel，bb）、短期穩定性相對不確定度（urel，ss）、長期穩定性相對不確定度（urel，ls）。

標準物質定值過程帶來的合成不確定度由兩個部分組成，第一部分是通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置信水平按統計方法計算出A類不確定度。第二部分是通過對測量影響因素的分析，以非統計分析的方法評定出其大小的B類不確定度。

將均勻性相對不確定度（urel，bb）、短期穩定性相對不確定度（urel，ss）、長期穩定性相對不確定度（urel，ls）和定值相對不確定度（urel，c）4 個分量合成標準物質的相對不確定度（urel，CRM）。在95%置信度下，取包含因子k=2，計算兩種標準物質標準值的擴展不確定度。兩種標準物質的標準值及擴展不確定度見表7。

表7 不確定度評定結果Table 7 Uncertainty evaluation results

3 討論

在本研究中，我們制備了羊源性DNA 標準物質，利用數字PCR 對其均勻性、穩定性及其不確定度進行評估。數字PCR 是一項較為成熟的PCR 擴增技術，不需要像熒光定量PCR 建立標準曲線即可實現絕對定量。數字PCR 廣泛應用于轉基因植物成分檢測［30］、動物疫病檢測［31］、病毒檢測［32-33］等，并且通過多重通道進行擴增，得出最終絕對定量的結果，目前數字PCR 成本較高，實驗時間較長，因此對于部分科研檢測人員來說進行數字PCR 實驗成為了難點［34］。但目前國產數字PCR 品牌數量及種類逐漸增多，降低了實驗成本同時縮短了實驗時間，使良好應用數字PCR 成為可能，為絕對定量檢測提供了優質平臺。

方差分析是用來統計檢驗均勻性、穩定性等最常用的方法，通過組間方差和組內方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統性差異。因此，本研究采用方差分析的方法進行定值。結果表明標準物質的均勻性和穩定性良好，標準物質在冷鏈運輸條件下可穩定14 d，在-20 ℃條件下可以穩定保存6 個月以上。通過9 家實驗室采用數字PCR 合作確定了HELZ基因拷貝數濃度。具體特性量值為：羊源性DNA標準物質（高濃度）HELZ基因標準值及擴展不 確定度為（5.44±0.45）×103copies·μL-1；羊源性DNA 標準物質（低濃度）HELZ基因標準值及擴展不確定度為（5.68±0.54）×102copies·μL-1。

基因組DNA 標準物質可直接用于實驗研究，由于肉類基因組DNA 標準物質的缺失，市場監管部門缺少對于諸多檢測方法的準確性和一致性的把控。因此，研制羊源性標準物質刻不容緩，本標準物質的研制可用于動物源性產品中羊源性成分的定性和定量檢測、試劑盒質控、評價和實驗室能力驗證和質量控制等領域。