羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001 培養方法優化及改善睡眠功能研究

宋 佳，李雪龍，林欣 梅，余萍，楊思 程，彭永振，矯艷平，陳雪嬌

1.江西仁仁健康微生態科技有限公司，江西 樟樹 331200；2.仁仁微生物科技研究（沈陽）有限公司，沈陽 110170；3.杭州民生健康藥業股份有限公司，杭州 310000

失眠是一種較為常見的健康問題，主要表現為入睡困難，并帶有煩躁和疲勞癥狀［1］。失眠的病因受多方面影響，如環境因素導致入睡困難，身體不適或者存在焦慮等情緒導致的難以入睡等。另外，伴隨著年齡增長，體內的褪黑素分泌減少，中樞神經系統發生變化，導致睡眠功能下降［2-4］。失眠的治療方法繁多，主要為藥物治療和非藥物治療［5］。藥物治療效果好、見效快，但是長時間服用藥物會產生依賴性，導致不良反應［6］。非藥物治療如物理療法和膳食療法等，沒有不良反應，但見效較慢，需要長期治療［7］。因此，亟需開發能夠高效改善睡眠質量、無不良反應的產品。

γ 氨基丁酸（GABA）是哺乳動物中樞神經系統的主要神經傳遞物質，具有抑制興奮、抗焦慮、催眠的作用［8-9］。GABA 可以提高葡萄糖磷脂酶的活性，使大腦內的血流得到活化，加速大腦的能量代謝，提升腦部供氧能力，改善神經功能，從而達到促眠的作用［10-11］。人體胃、腸道內存在著大量的益生菌，已有研究發現腸道菌群和中樞神經系統之間存在密切關系［12］。睡眠受到大腦調控，人體腸道內的微生物及其代謝物同樣對睡眠起到調節作用，從而形成了菌-腸-腦軸的關系，其中GABA是益生菌發揮改善睡眠效果的途徑之一［13-14］。

本實驗室前期篩選、鑒定了1 株高產GABA的羅伊氏粘液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）HCS02-001［15］。本研究通過響應面試驗優化L.reuteriHCS02-001 高產GABA 的最佳培養方法，并通過直接睡眠試驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗等小鼠實驗，驗證L.reuteriHCS02-001 對睡眠的改善作用，以期為其在助睡眠領域的應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

恒溫培養箱（DHP-500BS）購自北京市永光明醫療儀器有限公司；滅菌鍋（LDZX-50KBS）購自上海申安醫療器械廠；無菌操作臺（SW-CJ-1D）購自上海滬凈醫療器械有限公司；高速冷凍離心機（TGL-16M）購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；分析天平（京制00000246 號）購自賽多利斯科學（北京）有限公司；純水儀（UPT-II-20T）購自四川優普超純科技有限公司；酶標儀（EPOCH2NSC-SN）購自美國伯騰儀器有限公司；水浴鍋（XMTD-7000）購自北京市永光明醫療器械有限公司。

1.2 實驗材料

1.2.1 試劑 酵母蛋白胨購自安琪酵母股份有限公司；番茄汁由本實驗室自制；牛肉粉（生化試劑）購自上海緣肽生物技術有限公司；酵母粉（生化試劑）購自安琪酵母股份有限公司；磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸（均為分析純）購自江蘇科倫多食品配料有限公司；葡萄糖（分析純）購自石藥集團圣雪葡萄糖有限責任公司；吐溫-80購自江蘇四新界面劑科技有限公司。

1.2.2 培養基 改良的MRS培養基：葡萄糖10 g、酵母蛋白胨20 g、酵母浸出物6 g、牛肉粉3 g、磷酸二氫鉀2 g、一水檸檬酸15 g、乙酸鈉5 g、七水合硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、吐溫-80 0.6 g、L-谷氨酸鈉15 g，定容至含1%番茄汁的1 L蒸餾水中，調pH至6.5，115 ℃滅菌30 min后室溫冷卻備用。

GABA 標準品（B21979）購自上海源葉生物科技有限公司；L-谷氨酸鈉（生化試劑）、碳酸鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司；苯酚（分析純）購自天津市大茂化學試劑廠；次氯酸鈉（分析純）購自天津市富宇精細化工有限公司；硼砂（分析純）購自天津市瑞金特化學品有限公司；羅伊氏粘液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）益生菌凍干粉由本實驗室自制，規格2×1011CFU·g-1；戍巴比妥鈉和巴比妥那（純度＞99%）均購自上?；瘜W試劑公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單因素試驗 將保藏于-80 ℃的L.reuteriHCS02-001 菌株室溫解凍并混勻，取1 環菌液于MRS 固體平板劃線，37 ℃靜置培養48 h。挑單菌落至5 mL MRS 液體培養基中，37 ℃培養20 h 得種子液。以5%的接種量將種子液接種至改良MRS液體培養基中培養。

以GABA 質量濃度為考察指標，優化培養溫度、培養時間和初始pH。固定培養時間24 h，初始pH 為6.5，優化培養溫度水平分別為35、36、37、38、39 ℃；固定初始pH為6.5，培養溫度為37 ℃，優化培養時間水平分別為20、22、24、26、28 h；固定培養時間24 h，培養溫度為37 ℃，優化初始pH 分別為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9。

1.3.2 響應面試驗 采用3 因素3 水平響應面試驗，以GABA 質量濃度為響應值，對培養溫度、培養時間、初始pH 3個工藝參數進行優化，確定L.reuteriHCS02-001最優培養方法，試驗設計見表1。

表1 響應面各因素水平Table 1 The levels of response surface factors

1.3.3 GABA質量濃度的測定 標準曲線的繪制：分別取0.4 mL 配制好的標準溶液，加入0.1 mL 0.1 mol·L-1碳酸鈉、0.5 mL 0.2 mol·L-1pH 9.0 的硼酸鹽緩沖液、1 mL 6%苯酚和1 mL 10%次氯酸鈉溶液，混勻后放置4～8 min，沸水浴10 min 后冰浴20 min，待溶液出現藍綠色后，加入2 mL 60%的乙醇溶液，混勻后靜置30 min，于640 nm 處測定吸光度值。以GABA 濃度為橫坐標，OD640為縱坐標繪制標準曲線。

樣品檢測：培養好的菌液5 000 r·min-1離心20 min 后取上清液1 mL，用超純水稀釋20 倍后，經0.22 μm 濾膜過濾備用，檢測步驟同標準曲線的繪制。

1.3.4 改善睡眠實驗及動物實驗分組 實驗參照《保健食品檢驗與評價技術規范（2003 版）》中改善睡眠功能規范部分進行評價［16］。將50 只SPF級6周齡雄性小鼠動物根據體重隨機分為5組，每組10 只，分為空白對照組、GABA 溶液組、L.reuteriHCS02-001低劑量組、中劑量組和高劑量組。在環境適宜的條件下飼喂小鼠1 周后，開始灌胃處理?？瞻讓φ战M每天灌胃無菌生理鹽水，GABA 溶液組灌胃8.33 mg·kg-1·bw 的GABA，L.reuteriHCS02-001 實驗組按照成人益生菌食用量（2×1010CFU·d-1）的5 倍、10 倍、20 倍設置低劑量組灌胃濃度為8.33 mg·kg-1·bw、中劑量組灌胃濃度為16.67 mg·kg-1·bw、高劑量組灌胃濃度為33.33 mg·kg-1·bw，每天灌胃1次，小鼠的灌胃量為20 mL·kg-1·bw，連續灌胃4 周。環境溫度維持在25 ℃左右，濕度控制在50%左右［17］。

1.3.5 直接睡眠實驗 當日灌胃后觀測并記錄小鼠出現直接入睡的情況。將小鼠處在背臥位置，立即翻身時出現的現象為翻正反射。小鼠是否進入睡眠通過是否出現翻正反射判斷，如果小鼠30～60 s 內不能翻回身位，說明翻正反射現象消失，小鼠進入睡眠；當小鼠翻回正常身位，說明小鼠結束睡眠恢復清醒［18］。

1.3.6 延長戊巴比妥鈉催眠小鼠的睡眠時間實驗 小鼠經過灌胃后，30 min 后向小鼠注射戊巴比妥鈉誘導睡眠，注射量為10 mL·kg-1·bw，以翻正反射消失后再次出現的時間為小鼠的睡眠時間，記錄各組小鼠睡眠時間是否延長［19］。

1.3.7 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 動物的給藥方式同1.3.6，以翻正反射消失達到1 min以上的小鼠被認為進入睡眠狀態，記錄各組小鼠30 min內入睡數量和入睡率［20］。

1.3.8 巴比妥那睡眠潛伏期實驗 動物的給藥方式同1.3.6，注射巴比妥那腹腔注射劑后，小鼠的潛伏期為小鼠注射巴比妥那到翻正反射消失的時間，觀察受試物對巴比妥那潛伏期的影響［21］。

1.3.9 結果判定 延長戊巴比妥鈉催眠小鼠的睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗、巴比妥那睡眠潛伏期實驗，3 項實驗中有2 項為陽性，且無明顯直接睡眠的作用，即可認為該樣品具有改善睡眠的作用。

1.4 統計學分析

每個試驗進行3 次平行測定，得到的數據使用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan's 法進行多重比較，結果使用Origin 8.0進行圖形繪制。數據以平均值±標準誤表示，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 三級培養溫度對GABA 產量的影響 溫度是影響胞內酶的產生和生物合成等相關代謝的重要因素之一?？疾觳煌囵B溫度對L.reuteriHCS02-001 產GABA 量的影響，結果如圖1 所示。GABA 質量濃度隨著溫度的升高先升高后下降，在發酵溫度為37 ℃時GABA 質量濃度最高達到5.62 g·L-1。這說明溫度過高或過低都會影響菌體內部的代謝活動，影響著菌體內部谷氨酸脫羧酶的活性，進而降低GABA 的產量。因此，L.reuteriHCS02-001的最佳培養溫度為37 ℃。

圖1 培養溫度對羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001中GABA產量的影響Fig.1 Effect of culture temperature on GABA production by Limosilactobacillus reuteri HCS02-001

2.1.2 三級培養時間對GABA 產量的影響 選擇培養溫度為37 ℃，培養初始pH 為6.5，考察不同培養時間對L.reuteriHCS02-001 中GABA 產量的影響，結果如圖2 所示。隨著培養時間的增加，GABA 的產量先升高后達到平穩的狀態，培養時間為24 h時GABA質量濃度最高，達到5.61 g·L-1。這說明發酵后期菌體進入穩定生長期，菌體將培養基中的底物轉化為GABA，因此選擇培養時間24 h為最佳。

圖2 培養時間對羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001中GABA產量的影響Fig.2 Effect of culture time on GABA production by Limosilactobacillus reuteri HCS02-001

2.1.3 三級培養初始pH對GABA產量的影響 pH是微生物發酵的重要因素之一，偏低時抑制了菌體的正常生長，谷氨酸脫羧酶的量降低不能滿足GABA 的轉化。選擇培養時間為24 h，培養溫度為37 ℃，考察不同初始pH 對L.reuteriHCS02-001中GABA產量的影響，結果如圖3所示。在初始pH為6.5時GABA質量濃度最高，達到5.53 g·L-1。當pH 超過6.5時，谷氨酸脫羧酶的活性降低，因此選擇最適pH為6.5。

圖3 初始pH對羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001中GABA產量的影響Fig.3 Effect of initial pH on GABA production by Limosilactobacillus reuteri HCS02-001

2.2 響應面實驗

在單因素試驗的基礎上，以GABA 產量為響應值，選擇培養溫度（A）、培養時間（B）、初始pH（C）為3 種因素，應用Box-Behnken 設計方案進行3因素3水平響應面試驗，并將結果列于表2。

表2 響應面設計方案和結果Table 2 Response surface design scenarios and results

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 根據表3 的試驗結果，應用Design-Expert V 8.0.6 軟件對其進行多元回歸擬合，從而得到回歸方程為：Y=5.59+0.028A-2.500×10-3B-0.088C-7.500×10-3AB+0.028AC+0.058BC-1.26A2-0.73B2-0.43C2。經軟件分析可知，該模型的相關系數R2=0.996 5，接近于1，表明模型數據的擬合程度較高，能夠較好的描述各因素與響應值GABA 之間的真實關系，模型的校正決定系數Radj2=0.991 9，表明該模型能夠解釋99.19%的響應值GABA變化。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model ANOVA

由表3可知，影響L.reuteriHCS02-001中GABA產量的順序為：初始pH＞發酵溫度＞發酵時間?；貧w方程模型P＜0.000 1 極顯著，失擬項P=0.172 6不顯著，表明該模型具有極顯著性意義，且未知因素對試驗干擾性小。

2.2.2 響應面兩兩因素交互作用 由圖4 可知，GABA 產量隨初始pH、培養溫度和培養時間的增加呈非線性的增加，達到頂點后又隨其增加下降。通過Design Expert 軟件分析預測其最佳工藝參數為：培養時間24 h、培養溫度37 ℃、初始pH 6.5時，模型預測GABA 產量為5.56 g·L-1。為驗證試驗的可靠性，選取最優添加量培養L.reuteriHCS02-001測定其GABA的產量，取3組平行，GABA產量的平均值為5.58 g·L-1，與預測值相符，表明響應面優化L.reuteriHCS02-001培養方案的可靠性較高。

圖4 培養時間、培養溫度和初始pH對GABA產量的影響交互作用Fig.4 Interaction of culture time,culture temperature and initial pH on GABA production

2.3 小鼠睡眠實驗

2.3.1 直接睡眠實驗 小鼠飼喂生理鹽水、GABA溶液和羅伊氏粘液乳桿菌低劑量組、中劑量組和高劑量組后，5組小鼠均正?；顒游闯霈F睡眠現象，說明所飼喂的物質未對小鼠起到直接催眠作用。

2.3.2 延長戊巴比妥鈉催眠小鼠的睡眠時間實驗 小鼠的睡眠時間如圖5 所示，與空白對照組對比，服用中劑量和高劑量的L.reuteriHCS02-001 的小鼠睡眠時間顯著高于空白對照組（P＜0.05），高劑量組的睡眠時間顯著高于GABA組（P＜0.05）。結果表明L.reuteriHCS02-001 對于小鼠的睡眠起到延長作用。

圖5 羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001對小鼠睡眠持續時間的影響（n=10）Fig.5 Effects of Limosilactobacillus reuteri HCS02-001 on sleep duration in mice（n=10）

2.3.3 戊巴比妥那閾下劑量催眠實驗 由于戊巴比妥鈉通過肝酶代謝，想要排除通過影響肝酶進而延長戊巴比妥鈉睡眠時間，需要進行戊巴比妥鈉的閾下劑量實驗。實驗結果如表4 所示，高劑量組的小鼠入睡率達到40%，與空白對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。中劑量組的小鼠經過灌胃后入睡率達到20%，說明戊巴比妥鈉的催眠實驗對于小鼠睡眠效果顯著。

表4 羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001對小鼠睡眠率的影響Table 4 Effects of Limosilactobacillus reuteri HCS02-001 on sleep duration in mice

2.3.4 巴比妥那睡眠潛伏期實驗 小鼠在腹腔注射巴比妥那后，當小鼠縮短了潛伏期更快入睡時，說明灌胃的L.reuteriHCS02-001 與巴比妥那起到協同的作用。小鼠的入睡潛伏期實驗結果如圖6所示，與空白對照組相比，羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001 的低、中、高劑量組的睡眠潛伏時間顯著降低（P＜0.05），說明受試物可以縮短小鼠的睡眠潛伏期，使小鼠可以更快入睡。

圖6 巴比妥那小鼠睡眠潛伏實驗Fig.6 Sleep latency experiment of barbital sodium mice

綜上，根據《保健食品檢驗與評價技術規范（2003 版）》中改善睡眠功能評價規范的要求，3 個睡眠實驗中有2 項結果呈陽性，且無直接睡眠作用，可判定L.reuteriHCS02-001 具有改善睡眠的作用。

3 討論

睡眠是機體必不可少的復雜生理過程，對維持身心健康起著至關重要的作用。睡眠不足對人類的生活質量、情緒、認知功能和健康都有負面影響，如引起免疫力下降、認知障礙、增加抑郁癥和心血管疾病風險等。睡眠作為一個動態的生物過程，是通過多種內部和外部因素的相互作用實現的，包括且不限于：①大腦對睡眠的直接調節；② 周圍器官通過循環系統和外周神經系統傳遞信號到大腦以調節睡眠；③腸道中的微生物群產生代謝物，如GABA、多巴胺、5-羥色胺（5-HT）和其他能夠影響睡眠的物質［22］。

睡眠與腸道微生物群落有著復雜的相互作用，失眠可能是由腸道中促進睡眠的神經化學因子相對減少和促進清醒的神經化學因子增加引起的。因此，可以產生睡眠和覺醒相關神經遞質的微生物在失眠領域應該引起更多的關注。GABA是一種抑制性神經遞質，在人體中發揮著重要的生理作用，包括降低神經元活動、調節心率、增強記憶力和調節激素分泌，有助于防止失眠焦慮、壓力和平衡情緒等。乳酸菌被認為是GABA 的主要生產者［23］。Yunes 等［24］從135 株菌株中篩選出58株能夠產生GABA 的菌株，并確定L.brevis和L.plantarum是產生GABA 的主要乳桿菌屬，產率最高可達6 g·L-1。同樣，我們通過對羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001 進行單因素實驗和響應面實驗，優化出最佳的培養條件為培養溫度37 ℃培養時間24 h、初始pH 6.5 時，羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001 表現出最高的GABA 生產能力，產量達5.58 g·L-1。

在睡眠改善測試中，羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001 有效地延長了小鼠的睡眠時間，提高了入睡率，縮短了睡眠潛伏期，可與巴比妥那協同發揮作用。同樣地，Lin等篩選出一種特定的發酵乳桿菌PS150TM，該菌株能夠改善由咖啡因引起的睡眠障礙小鼠的睡眠，以及在小鼠的第一夜效應期間增加非快速眼動期［25-26］。Yu 等［27］認為GABA 對神經系統的間接影響是通過腸道介導的。首先，GABA 會改變腸道微生物群，并促進某些影響睡眠的神經遞質的產生。其次，胃腸道組織和迷走神經的傳入神經元表達大量的GABA受體。GABA刺激后，迷走神經向外傳遞信號，從而調節腦內神經遞質的分泌，影響睡眠。綜上所述，羅伊氏粘液乳桿菌HCS02-001 具備助睡眠的作用，這為開發助睡眠的產品提供了依據。