基于網絡藥理學和實驗驗證探究糖腎寶復方治療糖尿病腎病的作用機制

蘇芳林，羅鑫，唐賽男，黃樂韻，胡維，陸世龍，冉龍嬌，向少偉

1.廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530200；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腎內科，南寧 530011；3.廣西中西醫結合腎臟疾病臨床醫學研究中心，南寧 530011

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）常見的慢性并發癥之一，也是終末期腎病的主要病因，其發病機制復雜，演變過程主要以腎小球基底膜增厚、基質擴張、內皮細胞功能受損等為主要癥狀，最后繼發為腎小球硬化癥、腎小管間質纖維化等。近年來，中醫藥治療DN 療效顯著，但其具體干預機制仍需多方位探究。

糖腎寶復方（TSB）由黃芪、川芎、三七、葛根和大火草制成，在臨床上已廣泛應用于DN 的治療。本課題組前期研究［1-3］發現高糖誘導下腎臟組織過表達的E26 轉錄因子-1（E26 transformationspecific，Ets-1）可致腎小球內皮細胞（Fli-1）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1）表達升高，內皮細胞遷移率、功能下降明顯，并誘導細胞外基質Ⅳ型膠原（ColⅣ）、纖黏蛋白（fibronectin，FN）積聚，促進腎損害發生。

近年來，網絡藥理學作為中醫藥研究領域的一種新型工具，彌補了傳統中藥研發中對藥物靶標治療策略研究的缺陷，開啟了多成分-多靶標的新型研究模式［4］。因此，本研究通過網絡藥理學結合分子對接及體外細胞驗證手段預測并驗證TSB 治療DN 的作用機制，以期為后續深入研究糖腎寶復方防治DN 的確切分子機制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與動物 小鼠腎小球系膜細胞株（SV40-MES-13，貨號：CL-0470，STR 鑒定合格，武漢普諾賽生命科技有限公司）。24 只健康雄性SPF級KM小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），生產許可證號〔SCXK（湘）2019-0004〕。本研究經廣西中醫藥大學倫理委員會批準（DW20221229-304）。

1.1.2 儀器 熒光定量PCR 儀（Roche Light Cycler480 美國）；渦旋混合振蕩器（Scientific Industries Thermo）；全波長酶標儀（德國Thermo Fisher公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；二氧化碳培養箱（德國美墨爾特）；ST 16R 型高速冷凍離心機（德國Thermo Fisher公司）。

1.1.3 試劑 DMEM 高糖培養基（Gibco 美國），胎牛血清（FBS，Gibco 美國），引物（上海生工生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（MCE 公司），總RNA 制備試劑盒（莫納生物科技有限公司），cDNA 合成試劑盒（莫納生物科技有限公司），SYBR Green qPCR Mix 試劑盒（莫納生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 網絡藥理學組方藥物活性成分及靶點篩選 通過中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，TCMSP），對TSB 復方藥材活性成分進行檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 為篩選條件，經知網檢索相關文獻收集補充組方藥味關聯性化合物［5-14］，最后結合Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫得到組方活性成分相關靶點。

1.2.2 TSB-DN 疾病交集靶點分析 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/home/）、OMIM（https：//omim.org/）等數據庫中以“Diabetic nephropathy”為關鍵詞檢索，搜集DN 相關靶蛋白并通過生物信息學和進化基因組學（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）在線作圖軟件得到“TSB-DN”共同作用靶點及其Venn圖。

1.2.3 PPI 網絡構建與分析 TSB 治療糖尿病腎?。―N）的交集作用靶點導入STRING 數據庫中，物種限定“Homo sapiens”設置置信度值大于0.9，結合Cytoscape 3.7.2 軟件進行Cyto NCA 網絡拓撲分析以Degree＞中位數值為條件篩選2 次，并進行結果可視化分析。

1.2.4 交集靶點GO、KEGG 富集分析 將“PPI”分析篩選得到的靶蛋白導入DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，以“P＜0.05”作為標準進行篩選，取前10 數據導入微生信數據可視化平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/）中進行結果可視化分析。

1.2.5 “中藥-成分-靶點-通路”網絡圖構建 將TSB 復方藥物、活性成分、篩選后的靶點、及通路和相關靶點關聯數據導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建得到“中藥-成分-靶點-通路”網絡圖并通過Network Analasisi進行分析。

1.2.6 分子對接 從Pubchem 數據庫中下載經“中藥-成分-靶點-通路網絡圖”分析得到的核心活性成分2D 結構文件，作為對接配體分子，再通過PBD 數據庫下載得到篩選后的核心靶蛋白文件，作為對接蛋白。蛋白與配體分別使用PyMOL 和AutoDock Tools 軟件進行氫化、去除水分子、能量最小化處理，并用AutoDock Vina 軟件來完成核心活性成分配體與核心靶蛋白晶體結構的對接，經PyMOL完成最后的對接結果可視化處理。

1.2.7 體外細胞實驗的藥物制備、動物分組與含藥血清制備 依據前期研究［1-3］，組方分次加蒸餾水1 000 mL 和500 mL，煮沸2 h 和1.5 h，合并藥液，過濾、濃縮至含生藥2.0 g·mL-1，高壓滅菌后置于4 ℃冰箱封存待用。

24 只KM 小鼠適應性飼養7 d 后，隨機區組法分為正常組、糖腎寶低劑量組、糖腎寶高劑量組，每組8 只。分別予以正常組蒸餾水0.3 mL，糖腎寶合劑（按生藥含量計算）11.375 g·kg-1·d-1、22.75 g·kg-1·d-1（蒸餾水稀釋至 0.3 mL）灌胃，連續7 d。末次灌胃2 h 后眼球取血，3 000 r·min-1離心30 min，血清56 ℃水浴30min 滅活補體，0.22 μm 無菌濾器過濾除菌，即得各組含藥血清。

1.2.8 小鼠腎小球系膜細胞培養與分組干預SV40-MES-13細胞常規培養于含10%的胎牛血清培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。實驗分為4 組：正常對照組（5.5 mmol·L-1葡萄糖+正常組含藥血清）、高糖組（25 mmol·L-1葡萄糖+正常組含藥血清）、糖腎寶低劑量組（25 mmol·L-1葡萄糖+糖腎寶低劑量組含藥血清）、糖腎寶高劑量組（25 mmol·L-1葡萄糖+糖腎寶高劑量組含藥血清）。

1.2.9 CCK-8法檢測細胞活性 取處于對數生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，調節細胞濃度，使得細胞以2.5×104·mL-1的密度接種于96 孔培養板，當細胞貼壁后，按實驗分組，于對應孔中加入對應組別的葡萄糖溶液及含藥血清進行干預，每個實驗組設置6 個復孔，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h 后加入CCK-8 顯色。在酶標儀上讀取各孔OD450吸光值。

1.2.10 qPCR檢測靶基因mRNA表達 取處于對數生長期的細胞接種于6孔板中，各組用相應糖腎寶含藥血清進行藥物干預處理，24 h后棄上清，用Monzol Reagent Pro 法提取細胞總RNA，采用Mon-Script試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA。實時定量PCR 反應體系按MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑盒說明書進行配置。以GADPH為內參，采用公式2－△△Ct計算目的基因的相對表達量，各引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.11 統計學方法 用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析。計量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 TSB 活性成分及靶點篩選結果 通過TCMSP數據庫篩選和查閱文獻補充，TSB復方6味中藥材共含有化學成分102個，其中黃芪33個、川芎26 個、三七20 個、葛根22 個、大火草1 個。Swiss Target Prediction 數據庫預測、搜集、合并去重后共獲得TSB 作用靶點835 個，根據OB 值排序，主要活性成分基本信息見表2。

表2 TSB組方藥物主要活性成分信息Table 2 Information of main active ingredients of TSB prescription drugs

2.1.2 TSB-DN 交集靶點結果 GeneCards、Dis-GeNET、OMIM 數據庫分別篩選得到“Diabetic nephropathy”疾病相關靶點2 901、1 058、511 個，通過合并、刪除重復靶基因后共獲得3 584個疾病基因，取TSB 相關藥物靶點構建“TSB-DN Venn 圖”后共獲得443個“TSB-DN ”交集靶點（圖1）。

圖1 TSB組方與糖尿病腎病交集Venn圖Fig.1 Venn diagram of intersection of TSB prescription and diabetic nephropathy

2.1.3 PPI 網絡分析結果 將443 個“TSB-DN”交集靶點導入STRING 數據庫中，物種限定“Homo sapiens”，Score 得分≥0.9，篩選得到蛋白互作關系“TSV”數據，結合Cytoscape 3.7.2 軟件，進行Cyto NCA 網絡拓撲分析，繪制得到TSB 復方治療DN 的相關靶點互作網絡圖，包含340 個節點，339 條邊，通過Degree＞中位數，篩選兩次后共得到86 個關鍵靶點，篩選后的節點用紅色表示（圖2），其中Degree 最高的10 靶點分別為SRC、PIK3R1、STAT3、PIK3CA、HSP90AA1、PIK3CB、AKT1、PIK3CD、GRB2、EGFR，它們可能是TSB復方治療DN 的核心靶點，結果表明這些蛋白可能在治療DN 過程中具有重要的調節作用。

圖2 “TSB-DN”交集靶點PPI網絡圖Fig.2 PPI network diagram of "TSB-DN" intersection target

2.1.4 GO、KEGG 富集分析結果 將86個關鍵靶點導入DAVID 數據庫后進行GO 功能富集，得到742條具有顯著意義的條目（P＜0.05），取前10條目可視化結果（圖3）。TSB復方治療DN可能與蛋白磷酸化（protein phosphorylation）、蛋白磷酸正調節（positive regulation of protein phosphorylation）、細胞信號轉導（intracellular signal transduction）、基因表達正調控（positive regulation of gene expression）、胰島素生長因子信號通路（insulin-like growth factor receptor signaling pathway）、細胞質等離子膜非固有成分（extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（proteins erine/threonine/tyrosine kinase activity）、ATP結合（ATP binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）等功能相關。

KEGG 通路富集，得到126 條通路（P＜0.05），取前10 條通路進行可視化（圖4）。對前20 條通路結果進行分析發現，主要涉及疾?。ㄒ倚透窝?、前列腺癌、脂質和動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染）和信號通路（PI3K-Akt、AGERAGE、FoxO、ErbB、PD-L1/PD-1 等），其中PI3KAkt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB 等可能是TSB 治療DN 發揮主要作用的信號通路，以上結果表明，組方TSB 治療DN 主要是通過多層次生物學過程聯合不同信號通路發揮作用。

2.1.5 “中藥-成分-靶點-通路”網絡圖分析 將TSB 復方治療DN 的86 個關鍵靶點GO、KEGG 富集分析后得到的前20 條通路，與TSB 復方藥物、藥物成分、關鍵靶點、通路靶點關聯數據文件，導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建得到“中藥-成分-靶點-通路”網絡圖（圖5），包含205 個節點，2 066條邊，Network Analasisi 網絡拓撲分析結果表明，依照Degree 排序，TSB 治療DN 的核心活性成分主要為異微凸劍葉莎醇（isomucronulatol）、3，9-di-O-methylnissolin、20（S）-原人參三醇［（20S）-protopanaxatriol）］、香豆雌酚（coumestrol）、甘草素（Liquiritigeni）、華良姜素（jaranol）等。核心靶點主要為 STAT3、CDK1、EGFR、PIK3CD、MAPK8、HSP90AA1、PIK3R1、AR、PIK3CA、PTGS2。該核心靶點與PPI 篩選得到的前10 核心靶點取交集，確定TSB 治療DN 的主要核心靶點為STAT3、EGFR、PIK3CD、HSP90AA1、PIK3R1、PIK3CA 等，表明其治療DN 發揮主要作用的信號通路為PI3KAkt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB等。

2.1.6 對接結果可視化 Pubchem 數據庫下載得到核心活性成分結構文件，PBD 數據庫下載得到核心靶蛋白文件，AutoDock Vina 軟件完成核心活性成分與核心靶蛋白分子對接。結果（表3）顯示，isomucronulatol、3，9-di-O-methylnissolin、（20S）-protopanaxatriol、coumestrol、Liquiritigeni、jaranol 等與核心靶點STAT3、PIK3CD、PIK3R1、PIK3CA 及關聯性靶點ETS-1 等具有較高結合作用（結合能＜-7.9 kcal·mol-1）。其中Liquiritigeni、（20S）-protopanaxatriol 與各靶點結合能相對較優，暗示這二者在TSB 治療DN 的過程中起到重要作用，通過PyMOL 對其部分結果進行可視化，結果見圖6。由圖6 結果可知，甘草素與20(S)-原人參三醇能夠與各靶蛋白結構實現良好結合從而發揮中藥復方多成分、多靶點相互作用的治療效果。

圖6 分子對接可視化結果Fig.6 Molecular docking visualization results

表3 核心活性成分與核心靶點分子對接結果Table 3 Results of docking between core active ingredients and core target molecules

2.2 體外細胞實驗驗證

2.2.1 SV40-MES-13 細胞培養與干預 鏡下可見（圖7），SV40-MES-13 細胞干預前，生長良好，細胞形態呈梭形或類圓形未分化狀，細胞透光性良好，胞質清晰，胞距緊湊。干預24 h 后可見細胞形態發生改變呈梭形凸起及類圓形凸起狀，胞質凸起暗淡，邊界模糊，透光性較差，干預前后細胞狀態差異顯著表明含藥血清干預的有效性。

圖7 SV40-MES-13細胞含藥血清干預前后狀態Fig.7 State of SV40-MES-13 cells before and after treatment with drug-containing serum

2.2.2 SV40-MES-13 細胞活性比較 實驗結果顯示（圖8），SV40-MES-13 細胞在高糖環境下干預24 h后，與正常組相比，高劑量組細胞活性顯著降低（P＜0.001）。高糖組及低劑量組與正常組無統計學差異，與高糖組相比，高劑量與低劑量組細胞活性均具有顯著性差異（P＜0.001，P＜0.01）。結果表明，SV40-MES-13 細胞經高糖刺激后細胞活性相較于給藥組有所增加，這提示TSB 在作用于細胞后或起到抑制、鎮靜作用。

圖8 TSB對SV40-MES-13細胞活性影響Fig.8 Effect of TSB on SV40-MES-13 cell activity

2.2.3 相關信號通路靶基因mRNA表達比較 實驗結果顯示（圖9），與正常組比較，高糖組SV40-MES-13 細胞中PIK3CD、PIK3R1、ETS-1mRNA 表達量顯著升高，高劑量組細胞中PIK3CD、PIK3R1、MAPK8、STAT3mRNA 表達量顯著降低；與正常組比較，低劑量PIK3CD、STAT3mRNA表達量顯著降低；與高糖組比較，高劑量、低劑量組細胞中PIK3CD、PIK3R1、STAT3、ETS-1mRNA 表達量顯著降低。結果表明，TSB 復方可能通過抑制PIK3CD、PIK3R1、MAPK8、STAT3、ETS-1等基因的表達實現調控PI3K-Akt、AGE-RAGE信號通路，進而使得細胞活性在一定程度上降低并發揮對DN的治療作用。與高糖組比較，高劑量組中MAPK8mRNA 表達量顯著降低，而低劑量組中MAPK8mRNA 表達量顯著升高，推測可能是由于低劑量組血清藥物濃度有所不足導致干預后細胞基因抑制度不足。

圖9 TSB治療DN相關信號通路靶基因結果Fig.9 Target gene results of DN-related signaling pathway treated by TSB

3 討論

DN 作為DM 最常見的慢性并發癥之一，由于病因和致病機理復雜及嚴重的糖代謝紊亂，發展到終末期腎病比其他腎臟疾病的治療更加棘手［15］。當前傳統的西醫治療方法往往伴隨著嚴重的不良反應，對患者的病情會產生負面影響。中西醫結合技術因其更好的預防性能夠更快速、更安全地改善患者病情而成為當前的最佳選擇［16］。

DN在中醫中無對應病名，其中醫病機我國醫學各流派見解各異，如柳紅芳［17］認為，DN 病機主要是精損絡痹，核心治法為填精通絡，如《內經·五變篇》中提出五臟虛弱，正氣不足容易患消癉［18］。本課題組［15］認為糖尿病的中醫病機以“氣虛血瘀證”為基本，糖腎寶組方（TSB）以黃芪為君，補氣升陽；川芎三七葛根共為臣行氣活血化瘀通絡；以大火草為佐清熱利濕。五藥共用，攻補兼施，益氣活血。在課題組的前期實驗研究和臨床上均體現出明顯效果［19-23］。然而，糖腎寶復方治療DN 的其他有效活性成分和作用機制目前尚未得知。

基于此，本研究通過網絡藥理學研究方法，構建復方糖腎寶治療DN 的“中藥-成分-靶點-通路”網絡圖，推測TSB 治療DN 可能是通過PIK3R1、STAT3、PIK3CD 等靶基因發揮作用。KEGG 通路富集結果顯示，PI3K-Akt、AGE-RAGE、FoxO、ErbB等信號通路可能是復方糖腎寶治療DN 的重要機制，與上述核心靶點存在一定的聯系。相關靶基因中PIK3CD 是磷酸肌醇-3 激酶（PI3kinase，PI3K）的一個調節亞基，是PI3K-AKT 信號通路的重要組成部分，在細胞增殖、遷移和癌癥進展中發揮著重要作用［24］，磷脂酞肌醇-3 激酶調節亞基1（PIK3R1）是PI3K 的調節亞基之一，主要參與對PI3K/Akt 信號通路的調節。相關研究表明［25］，PIK3R1 通過PI3K/AKT 信號通路緩解肺內皮細胞損傷從而起到調控PI3K/Akt 信號通路的激活與炎癥、細胞凋亡反應［26-28］。而STAT3 是信號轉導與轉錄調控因子之一，具有傳遞信號的作用，在宮頸癌的進展中，宮頸上皮細胞的失衡與STAT3 激活具有直接關系［29］。

此外，糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）及其受體RAGE 介導的內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是引發DN 的經典通路之一。大量研究顯示，長期的高糖環境容易導致腎臟AGEs/RAGE的生成增多，從而引起腎臟組織ERS 激活，啟動PERK 信號通路，導致患者腎組織細胞凋亡，繼而出現腎功能顯著損傷［30-32］。

本研究采用分子對接法、cck8 法、以及qRTPCR 法檢測DN 相關疾病通路基因進行實驗驗證，結果顯示TSB 組方可通過抑制PIK3R1、PIK3CD 和MAPK8、STAT3、ETS-1 等靶基因的mRNA 表達，實現對PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號通路進行調控并發揮對DN的治療作用。

綜上，本研究通過網絡藥理學方法和體外細胞實驗驗證揭示了糖腎寶復方治療DN 的潛在作用機制，一定程度上證明了糖腎寶復方能夠通過多靶點、多通路治療DN。為臨床應用此方治療DN提供一定的理論基礎和技術支持，然而本研究中預測的其他相關靶蛋白量的表達及代謝組學層面表達仍具有進一步檢測驗證價值，后續會盡可能完善糖腎寶復方治療DN的多方面研究。