紅花龍膽枯萎病病原菌鑒定及培養特性研究

嚴凱 李樹江 李敏 張曉勇

摘要

枯萎病是紅花龍膽栽培中發生最普遍，危害最嚴重的病害之一。為明確引起紅花龍膽枯萎病的病原種類及其侵染特性，本研究采用組織分離法獲得2個菌株，結合形態學特征以及ITS和Mcm7序列鑒定，?2個菌株被鑒定為Clarireedia?jacksonii，這是該菌在龍膽科植物上引起枯萎病的首次報道。致病性測定表明，該菌在15～35℃可侵染紅花龍膽健康葉片，最佳侵染溫度為25℃。生長特性研究表明，該菌最適生長溫度為25℃，最適pH為5，菌絲致死溫度為50℃處理10?min。

關鍵詞

紅花龍膽;?枯萎病;?病原菌鑒定;?侵染特性;?生長特性

中圖分類號：

S?435.672

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022646

Identification?and?biological?characteristics?of?Clarireedia?jacksonii?causing?wilt?disease?on?Gentiana?rhodantha?in?Guizhou

YAN?Kai，?LI?Shujiang，?LI?Min，?ZHANG?Xiaoyong*

（School?of?Biological?Science?and?Technology，?Liupanshui?Normal?University，?Liupanshui?553004，?China）

Abstract

Wilt?disease?is?one?of?the?most?common?and?serious?diseases?of?Gentiana?rhodantha?in?the?field?in?Guizhou?province.?In?order?to?identify?the?pathogen?causing?wilt?disease?on?G.rhodantha，?two?strains?were?isolated?from?diseased?leaves?by?tissue?separation?method.?Based?on?morphological?characteristics?and?analyses?of?ITS?and?Mcm7?sequences，?the?pathogen?was?identified?as?Clarireedia?jacksonii.?This?is?the?first?report?of?C.jacksonii?causing?wilt?disease?on?Gentianaceae?plants.?Pathogenicity?test?showed?that?the?pathogen?could?infect?the?healthy?leaves?at?15-35℃，?and?the?optimal?infection?temperature?was?25℃.?In?culture?tests，?the?optimum?conditions?for?mycelial?growth?were?25℃?and?pH?5，?and?the?lethal?temperature?for?mycelium?was?50℃?for?10?min.

Key?words

Gentiana?rhodantha;?wilt?disease;?pathogen?identification;?infection?characteristics;?culture?characteristics

紅花龍膽Gentiana?rhodantha是龍膽科Gentianaceae的多年生草本植物，分布在我國四川、陜西、廣西、云南、河南、甘肅等地區，全草可入藥，具有較高的藥用價值［1］。紅花龍膽一般通過種子穴盤育苗和組織培養，種植2～3年可采收，采收時間一般在每年的8月－10月［23］。由Pestalotiopsis?trachicarpicola引起的葉斑?。╨eaf?spot）常給紅花龍膽生長造成嚴重影響，該病早期在紅花龍膽葉片的中部或葉緣形成淡黃色小斑，之后迅速擴大至圓形或橢圓形大斑，病斑周圍有紫色暈圈，最終葉片全部干枯［4］。近年來在貴州紅花龍膽栽培田間普遍發生枯萎?。╳ilt?disease），該病主要在6月－9月高溫季節發生，從移栽的幼苗到成熟植株各個發育階段均能染病，一年生小苗發病尤為嚴重，病株近基部大段莖稈和葉片壞死，地上部分干枯，植株不倒伏，形成典型的枯萎癥狀。目前紅花龍膽枯萎病還未見報道，病原菌也尚不明確，不利于該病的田間識別和防控。

為明確紅花龍膽枯萎病傳播、發病規律及病原菌種類，本文采用形態學結合多基因分子生物學鑒定的方法對病原菌進行鑒定，并對病原菌生物學特性和侵染特性進行研究，旨在為紅花龍膽枯萎病的田間識別及防治提供理論及實踐參考。

1?材料與方法

1.1?病害標本采集與病原菌分離純化

供試的紅花龍膽枯萎病典型病害材料于2020年8月采自貴州省六盤水市水城區楊梅鄉臺沙村（104°50′E，?26°35′N，海拔2?158?m）。采用組織分離法對患病葉片進行病原菌分離和純化。純化菌株在PDA斜面上培養7～10?d后置于4℃保存備用。

1.2?病原菌的鑒定

1.2.1?形態學鑒定

菌種在PDA平板活化后，在菌落邊緣打取4?mm菌餅，分別接種于PDA平板中央，在25℃、自然光照下培養3?d?后觀察菌落形態，以十字交叉法測量菌落直徑（mm），重復3次。并將菌株接種于含2.5?mmol/L?乙酸的PDA平板中，于25℃、連續光照條件下培養20?d誘導菌株的不育子囊盤［5］，并用無菌水制備裝片于顯微鏡下觀察菌絲及不育子囊盤的形態特征。

1.2.2?分子生物學鑒定

菌株接種于PDA平板上，于25℃的恒溫培養箱中培養4?d后刮取菌絲，用改良的CTAB法提取菌株DNA［6］。擴增內轉錄間隔區ITS?（rDNA?internal?transcribed?spacer）和DNA復制準許因子基因Mcm7?（DNA?replication?licensing?factor）序列。ITS引物選用ITS4?（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）和ITS5（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′）;Mcm7的引物選用Mcm7709?for?（5′ACIMGIGTITCVGA

YGTHAARCC3′）和Mcm71348rev（5′GAYTTDGCIACICCIGGRTCWCCCAT3′）?［78］。采用25?μL?PCR反應體系：正、反向引物各1?μL，2×Taq?PCR?Master?Mix?12.5?μL，DNA模板2?μL，超純水8.5?μL。

擴增ITS的PCR反應條件為：95℃預變性2?min;95℃變性30?s，50℃退火30?s，72℃延伸30?s，35個循環;72℃延伸2?min。擴增Mcm7的PCR反應條件為：94℃預變性10?min;94℃變性40?s，56℃退火50?s，72℃延伸60?s，38個循環;72℃延伸5?min［78］。擴增產物由北京擎科生物科技有限公司進行純化和測序。

將所得的ITS、Mcm7序列與?GenBank中菌株所對應的基因序列用MEGA?11比對，用Sequence?Matrix?1.7.8?軟件拼接，最后在MEGA?11軟件中用極大似然法（maximum?likelihood）構建系統發育樹，確定菌株的分類地位，系統發育樹各個分支的支持強度通過1?000次重復自展檢驗數值進行評估。

1.3?致病性測定

取新鮮、健康、無損傷的帶3～4片成熟葉片的紅花龍膽枝條，用75%乙醇擦拭葉片，無菌水輕輕沖洗3次，無菌吸水紙吸干水珠后放置于超凈工作臺中晾干表面水分。枝條切口處用無菌濕棉球包裹后平置于培養皿內保濕培養。用灼燒冷卻的針頭在葉片上集中打取4個小針孔進行微損傷處理，設置不損傷接種處理，取1塊直徑2?mm菌塊接種于微傷口處，并在未損傷處理葉片相同部位接種菌塊，菌絲面緊貼葉片，以在損傷部位接種相同大小PDA培養基為對照，每處理6片葉片，重復3次，于25℃、連續光照的培養箱中培養3?d后觀察葉片的發病情況，統計發病率，并用游標卡尺以十字交叉法測量病斑大小。

1.4?病原菌適宜生長溫度及pH測定

打取4?mm菌餅接于PDA平板中央，分別在0、5、10、15、20、25、30、35℃和40℃，培養箱中培養3?d后通過十字交叉法測量菌落直徑（mm），重復3次。

用0.1?mol/L的HCl或NaOH將PDA培養基的pH調為4、5、6、7、8、9、10和11等8個pH梯度，滅菌后備用。打取4?mm菌餅接到培養基中央，并在25℃、自然光照培養箱中培養3?d后以十字交叉法測量菌落直徑（mm），重復3次。

1.5?病原菌致死溫度測定

取直徑4?mm菌餅裝入盛有1?mL無菌水的2?mL離心管中，分別在30、40、42、45、47、50℃和55℃恒溫水浴中加熱10?min。待試管冷卻后取出菌餅，無菌濾紙吸干表面水珠后接種于PDA平板中央，在25℃培養3?d后觀察菌落生長情況。重復3次。

1.6?病原菌最適侵染溫度測定

選取完整、健康的紅花龍膽成熟葉片，用滅菌針頭在紅花龍膽葉片上進行微損傷處理，取直徑2?mm菌塊接種于微傷口處，并用無菌濕棉球包裹住葉柄保濕，后分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40℃和45℃的連續光照培養箱中培養，3?d后統計葉片發病情況，并用游標卡尺測量病斑直徑（mm），以接種空白PDA為對照，重復3次。

1.7?數據分析

采用DPS?7.05軟件對數據進行方差分析，以LSD法進行多重比較。

2?結果與分析

2.1?紅花龍膽枯萎病癥狀

病害初期，紅花龍膽基部的莖稈和葉片邊緣、葉尖上形成水漬狀不規則壞死病斑，病健交界明顯，莖稈頂端幼葉正常生長;后期隨著病斑快速擴展，整株葉片和莖部干枯壞死，干燥時壞死部位呈棕褐色，干枯植株不倒伏（圖1a，1b）。

2.2?病原菌分離與菌株的致病性

采用組織分離法從紅花龍膽枯萎病典型病樣的病健交界處分離得到2個菌株（菌株編號為SB0629011和SB062903），經損傷處理的紅花龍膽葉片接種菌株SB0629011后3?d葉片上出現直徑6.3～8.7?mm?的不規則水漬狀壞死病斑，發病率為100%，與田間早期發病癥狀相似（圖1c）;未經微損傷處理的葉片接種病原菌后，在接種部位形成4.5～5.6?mm不規則水漬狀壞死病斑，發病率為72.22%?（圖1d），而在葉片的微損傷部位接種空白PDA則未表現出明顯癥狀（圖1e）。從發病葉片的病健交界處重新分離所得菌株形態特征與原菌株相同。說明病原菌對寄主地上部分的侵染能力極強，可從傷口和健康部位侵入紅花龍膽使其發病。

2.3?紅花龍膽枯萎病病原菌鑒定

2.3.1?病原菌的形態學鑒定

菌株在PDA中生長速度快，25℃培養3?d菌落直徑（85.24±5.43）?mm（n=3），菌落表面蓬松，白色棉絮狀，正反面顏色一致，培養3周后菌落中央菌絲顏色逐漸加深為棕褐色（圖2a～b）。菌株在含2.5?mmol/L乙酸的PDA培養基中生長緩慢，25℃培養6?d菌落直徑（81.52±8.24）?mm（n=3），培養20?d后菌絲體老化、塌陷，菌落底部形成扁平、深褐色或黑色的表面（圖2c），在深色的下層基質表面形成不育子囊盤，杯狀到盤狀，棕色、肉桂色或淺黑色，大小為（3.15±1.21）?mm×（2.05±0.73）?mm（n=10）（圖2d～e）。不育子囊盤由老化、深色的菌絲聚合而成（圖2f）?；谛螒B學特征，初步將2株菌株鑒定為Clarireedia?jacksonii［5］。

2.3.2?病原菌的分子生物學鑒定

2個菌株的ITS和Mcm7序列長度分別為584?bp和633?bp，相關序列已上傳至GenBank并獲得登錄號（圖3）。與GenBank中下載的18個菌株相關基因序列進行同源性比對，以Monilinia?vacciniicorymbosi?SSI1為外群菌株，用MEGA?11?構建的ML系統發育樹。如圖3所示，菌株SB0629011和SB062903與Clarireedia?jacksonii以99%的高支持率聚為一支。因此基于形態學及ITS和Mcm7序列分析，將菌株SB0629011和SB062903鑒定為Clarireedia?jacksonii。

2.4?溫度和pH對紅花龍膽枯萎病病原菌生長的影響

不同溫度對紅花龍膽枯萎病病原菌菌絲生長的

影響達到顯著水平，該病原菌在5～35℃的溫度范圍內均可生長，0～25℃溫度范圍之間菌絲的生長速度隨著溫度的升高而加快，溫度超過25℃后菌絲的生長速率減慢，25℃時菌絲生長速率顯著高于其他溫度處理（圖4a）。病原菌對pH的適應范圍較廣，在pH?4～11均能生長，但在pH為5時生長速率顯著高于其他pH條件。說明紅花龍膽枯萎病病原菌最適生長溫度為25℃，最適pH為?5（圖4b）。

2.5?紅花龍膽枯萎病病原菌的致死溫度

紅花龍膽枯萎病病原菌在不同溫度下處理?10?min?后菌絲生長活性差異達到顯著水平（圖5）。隨著處理溫度的升高，菌絲生長活性隨之顯著降低。當處理溫度達到50℃及以上時菌絲完全失活，說明病原菌致死溫度為50℃處理10?min。

2.6?溫度對病原菌侵染紅花龍膽的影響

將病原菌接種到紅花龍膽葉片上并在不同溫度下培養3?d，如圖6所示，15～35℃的溫度范圍內病原菌能夠侵染紅花龍膽，并且25℃的環境下病原菌侵染的速率最快，溫度過高和過低都不利于病原菌的侵染。說明25℃為病原菌最佳侵染溫度。

3?結論與討論

植物真菌性枯萎病可由多種病原菌引起，其中鐮孢屬Fusarium致病菌最為常見，如尖孢鐮F.oxysporum、層出鐮孢F.proliferatum、厚垣鐮孢F.chlamydosporum引起甘藍、苦瓜、綠豆、豇豆、辣椒和茄子等的枯萎?。?13］。輪枝孢屬Verticillium部分真菌是很多茄科農作物枯萎病的病原菌［1415］。本研究基于形態學和ITS、Mcm7序列分析，將貴州紅花龍膽枯萎病病原菌鑒定為?Clarireedia?jacksonii，這是該菌引起龍膽科植物枯萎病的首次報道。

Clarireedia是SalgadoSalazar等在2018年從核盤菌屬Sclerotinia中分出的獨立類群，目前在分類系統中Clarireedia位于蠟盤菌科Rutstroemiaceae［5］。截至目前，已報道的Clarireedia真菌已有13個種（www.mycobank.org）。C.jacksonii是西伯利亞翦股穎Agrostis?stolonifera、草地早熟禾Poa?pratensis、紫羊茅?Festuca?rubra、結縷草Zoysia?japonica和狗牙根?Cynodon?dactylon等草坪植物幣斑?。╠ollar?spot）的主要病原菌之一［1617］。

病原菌培養特性和侵染特性研究結果表明，C.jacksonii最適生長溫度和侵染紅花龍膽的溫度一致，均為25℃，病原菌在適宜溫度下快速增殖，為侵染奠定了良好的條件［18］;其最適pH為5，表明該菌喜歡酸性環境，與?Townsend等的研究結果一致，Townsend等認為將草坪草葉片表面pH調至中性至堿性環境可能是防治C.jacksonii所致幣斑病的重要策略［19］。

本研究對紅花龍膽枯萎病田間識別和防治提供了理論和實踐參考。今后要開展紅花龍膽枯萎病田間發病規律、病原菌田間越冬場所調查以及化學防控和土壤消毒技術的研究，以完善紅花龍膽枯萎病的防治技術體系，實現紅花龍膽綠色、優質、高效栽培。

參考文獻

［1］?沈濤，?張霽，?楊慶，?等.?云貴高原紅花龍膽生態適宜性區劃研究［J］.?中國藥學雜志，?2017，?52（20）：?18161823.

［2］?張興艷，?張綢生，?何詩琪，?等.?不同移栽方式對紅花龍膽幼苗生長的影響［J］.安徽農學通報，?2020，?26（11）：?4445.

［3］?鐘世浚，?張碧東，?賴世婷，?等.?紅花龍膽組培快繁體系研究［J］.?植物研究，?2021，?41（5）：?753759.

［4］?ZHANG?Xiaoyong，?YANG?Youlian，?LI?Shujiang，?et?al.?First?report?of?leaf?spots?on?Gentiana?rhodantha?caused?by?Pestalotiopsis?trachicarpicola?［J］.?Journal?of?General?Plant?Pathology，?2021，?87：?316321.

［5］?SALGADOSALAZAR?C，?BEIRN?L?A，?ISMAIEL?A，?et?al.?Clarireedia?：?A?new?fungal?genus?comprising?four?pathogenic?species?responsible?for?dollar?spot?disease?of?turfgrass?［J］.?Fungal?Biology，?2018，?122（8）：?761773.

［6］?張穎慧，?魏東盛，?邢來君，?等.?一種改進的絲狀真菌DNA提取方法［J］.?微生物學通報，?2008，?35（3）：?466469.

［7］?WHITE?T?J，?BRUNS?T?D，?LEE?S?B，?et?al.?Amplification?and?direct?sequencing?of?fungal?ribosomal?RNA?genes?for?phylogenetics?［M］∥INNIS?M?A，?GELFNAD?D?H，?SNINSKY?J?J，?et?al.?PCR?protocols，?a?guide?to?methods?and?applications.?San?Diego：?Academic?Press，?1990：?315322.

［8］?SCHMITT?I，?CRESPO?A，?DIVAKAR?P?K，?et?al.?New?primers?for?promising?singlecopy?genes?in?fungal?phylogenetics?and?systematics?［J］.?Persoonia，?2009，?23：?3540.

［9］?楊宇紅，?呂紅豪，?楊翠榮，?等.?甘藍枯萎病苗期抗性鑒定技術及抗源篩選［J］.?植物保護學報，?2011，?38（5）：?425431.

［10］趙秀娟，?唐鑫，?胡開林.?苦瓜枯萎病抗性鑒定與抗性遺傳規律研究［J］.?園藝學報，?2013，?40（4）：?685692.

［11］朱琳，?孫素麗，?孫菲菲，?等.?綠豆尖鐮孢枯萎病抗性鑒定方法［J］.?植物遺傳資源學報，?2017，?18（4）：?696703.

［12］MISHRA?R?K，?MISHRA?M，?BOHRA?A，?et?al.?First?report?of?Fusarium?proliferatum?causing?wilt?and?root?rot?disease?on?wild?accessions?of?pigeonpea?from?India?［J］.?Journal?of?Plant?Pathology，?2021，?104（1）：?405.

［13］PARIHAR?T?J，?SOFI?M?Y，?RASOOL?R?S，?et?al.?Fusarium?chlamydosporum，?causing?wilt?disease?of?chili?（Capsicum?annum?L.）?and?brinjal?（Solanum?melongena?L.）?in?Northern?Himalayas：?a?first?report?［J/OL］.?Scientific?Reports，?2022，?12：?20392.?DOI：?10.1038/s4159802223259w.

［14］JOHNSON?D?A.?Verticillium?wilt?of?potatothe?disease，?pathogen，?and?management?［J］.?Canadian?Journal?of?Plant?Pathology，?2009，?31（4）：?503504.

［15］NAKAHARAH，?MORI?T，?MATSUZOE?N.?Screening?of?phenotypic?conversion?mutant?strains?of?Ralstonia?solanacearum?for?effective?biological?control?of?Verticillium?wilt?in?eggplant?［J/OL］.?Crop?Protection， 2021，?142：?105530.?DOI：?10.1016/j.cropro.2020.105530.

［16］SAPKOTA?S，?CATCHING?K?E，?RAYMER?P?L，?et?al.?New?approaches?to?an?old?problem：?dollar?spot?of?turfgrass?［J］.?Phytopathology，?2022，?112（3）：?469480.

［17］SAPKOTA?S，?MARTINEZESPINOZA?A?D，?ALI?E，?et?al.?Taxonomical?identification?of?Clarireedia?species?causing?dollar?spot?disease?of?turfgrass?in?Georgia?［J/OL］.?Plant?Disease，?2020，?104（11）：?3063.?DOI：?10.1094/PDIS03200603PDN.

［18］紀莉景，?栗秋生，?王亞嬌，?等.?溫度對假禾谷鐮刀菌生長、侵染及莖基腐病發生的影響［J］.?植物病理學報，?2020，?50（6）：?723730.

［19］TOWNSEND?R?V，?RIOUX?R?A，?KABBAGE?M，?et?al.?Oxalic?acid?production?in?Clarireedia?jacksonii?is?dictated?by?pH，?host?tissue，?and?xylan?［J/OL］.?Frontiers?in?Microbiology，?2020，?11：?1732.?DOI：?10.3389/fmicb.2020.01732.

（責任編輯：楊明麗）