高溫脅迫對禾谷鐮孢生長和致病力的影響

徐慶 王奧霖 聶曉 劉偉 張昊 曹世勤 范潔茹 周益林

摘要

為探究高溫脅迫對禾谷鐮孢生長和致病力的影響，本研究測定了禾谷鐮孢5株耐高溫菌株和4株溫度敏感型菌株在25℃和30℃下的菌絲生長速率、產孢量、孢子萌發率以及不同脅迫壓力下的生長速率、致病力和DON毒素含量等。結果表明，不論耐高溫菌株還是溫度敏感型菌株，30℃高溫對其菌絲生長均有抑制作用，但對產孢量和孢子萌發有促進作用;30℃高溫能減輕NaCl和CaCl2脅迫對禾谷鐮孢生長的抑制，但是不影響KCl、剛果紅，SDS和H2O2對病原菌的抑制作用;在30℃下，大部分耐高溫菌株的致病力不變或降低，而大部分溫度敏感型菌株的致病力反而增加，30℃對大部分菌株的DON毒素產量有一定促進作用。研究結果可為研究氣候變化下小麥赤霉病的流行和預測提供理論基礎。

關鍵詞

禾谷鐮孢;?高溫脅迫;?滲透脅迫;?致病力;?DON

中圖分類號：

S?432.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022141

The?effect?of?heat?stress?on?the?growth?and?aggressiveness?of?Fusarium?graminearum?isolates

XU?Qing1，2，?WANG?Aolin2，?NIE?Xiao2，?LIU?Wei2，?ZHANG?Hao2，CAO?Shiqin1，3*，?FAN?Jieru2*，?ZHOU?Yilin2

（1.?College?of?Plant?Protection，?Gansu?Agricultural?University，?Lanzhou?730070，?China;?2.?Institute?of?Plant?Protection，?

Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests， 

Key?Laboratory?of?Control?of?Biological?Hazard?Factors?（Plant?Origin）?for?Agricultural?Product?Quality?and?Safety，?

Beijing?100193，?China;?3.?Wheat?Research?Institute，?Gansu?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Lanzhou?730070，?China）

Abstract

In?order?to?explore?the?effect?of?heat?stress?on?the?growth?and?aggressiveness?of?Fusarium?graminearum，?we?measured?the?mycelia?growth，?sporulation，?spore?germination，?osmotic?stress，?aggressiveness?and?DON?production?of?five?heattolerant?isolates?and?four?heatsensitive?isolates?at?25℃?and?30℃.?The?results?showed?that?the?mycelial?growth?was?inhibited?but?the?sporulation?and?spore?germination?were?promoted?at?30℃?for?both?heattolerant?and?sensitive?isolates.?The?high?temperature?（30℃）?treatment?reduced?the?inhibition?caused?by?NaCl?and?CaCl2?osmotic?stress?to?the?growth?of?F.graminearum?isolates，?but?showed?no?effect?on?the?inhibition?caused?by?KCl，?Congo?Red，?SDS?and?H2O2?stress.?Furthermore，?the?aggressiveness?remained?unchanged?or?decreased?at?30℃?in?most?heattolerant?isolates，?while?increased?in?most?heatsensitive?isolates，?and?high?temperature?（30℃）?had?a?certain?promoting?effect?on?the?production?of?DON?toxins?in?most?isolates.?This?study?provides?a?theoretical?basis?for?the?prevalence?and?forecasting?of?Fusarium?head?blight?under?climate?change.

Key?words

Fusarium?graminearum;?heat?tolerance;?osmotic?stress;?aggressiveness;?DON

禾谷鐮孢Fusarium?graminearum?Schwabe是小麥赤霉?。‵usarium?head?blight，FHB）的主要致病菌之一。小麥赤霉病在我國1936年首次報道，近年來，由于氣候、耕作制度變化等的影響，小麥赤霉病在我國長江中下游和黃淮海麥區頻繁發生，近五年，全國年均發病面積300萬～600萬hm2，約占小麥種植面積的20%，對小麥安全生產構成了嚴重威脅［14］。禾谷鐮孢侵染小麥后不僅會導致作物產量降低，還會在感病小麥籽粒中產生一系列真菌毒素，如：脫氧雪腐鐮孢菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、雪腐鐮孢菌烯醇（nivalenol，NIV）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等，造成食品安全問題［5］。

溫度作為重要的環境因素，不僅影響作物生長，也影響病原菌的生存、繁殖。已有研究報道，溫度會影響鐮孢菌在田間分布的種類和菌群結構，進而影響病害的發生，如Saremi等［6］通過研究鐮孢菌田間種群密度和溫度等氣象因子之間的關系，證明了溫度等氣象因子在鐮孢菌的生態學性狀如產孢量、孢子萌發、致病力等方面起重要作用。紀莉景等［7］通過測定不同溫度下假禾谷鐮孢Fusarium?pseudograminearum的生物學性狀，確定了其菌絲生長溫度范圍為4～30℃，最適溫度為28℃;假禾谷鐮孢孢子萌發的溫度范圍為4～35℃，分生孢子萌發的溫度范圍為12～30℃。趙亞男［8］采用菌絲生長速率法，明確了小麥赤霉病菌F.asiaticum和F.graminearum在不同溫度下生長的速率及溫度敏感性，兩個種群生長的最適宜溫度均為25℃，22℃和28℃次之，30℃生長速率降低，32℃下生長速率顯著受到抑制。綜上，溫度對鐮孢菌的生長有影響，但高溫脅迫對禾谷鐮孢產孢、孢子萌發、滲透壓脅迫、致病力和產毒素方面的影響鮮有報道。

因此，本文研究了常溫25℃和高溫30℃脅迫下，不同溫度敏感型禾谷鐮孢菌株在菌絲擴展、產孢量、孢子萌發、滲透壓脅迫、致病力和產DON毒素量等方面的差異，以明確高溫脅迫對病原菌生長發育和致病力的影響，并明確耐高溫菌株抵御高溫的侵染階段和生理特點，為研究氣候變化下小麥赤霉病的流行預測提供理論基礎。

1?材料與方法

1.1?供試材料

禾谷鐮孢菌株：共9株，為2018年采自湖北省襄陽市和荊州市不同區（縣）感染小麥赤霉病的小麥病穗的單孢分離物［8］，由中國農業科學院植物保護研究所和湖北省農業科學院植保土肥所提供。

1.2?供試培養基

SNA培養基：1?g?KH2PO4，1?g?KNO3，0.5?g?MgSO4·7H2O，0.5?g?KCl，0.2?g?葡萄糖，0.2?g?蔗糖，20?g?瓊脂粉，補水至1?L。

PDA培養基：200?g馬鈴薯，20?g葡萄糖，20?g瓊脂粉，補水至1?L。

WA培養基：10?g瓊脂粉，5?g葡萄糖，補水至1?L。

綠豆湯培養基：30?g綠豆用蒸餾水煮沸10?min，4層紗布過濾，補水至1?L。

TBI培養基：30?g?蔗糖，1?g?KH2PO4，0.5?g?MgSO4·7H2O，0.5?g?KCl，10?mg?FeSO4·7H2O，0.871?g?精氨酸，200?μL微量元素［5?g?ZnSO4·7H2O，0.25?g?CuSO4·5H2O，50?mg?MnSO4·H2O，50?mg?H3BO3，5?g檸檬酸，50?mg?Na2MoO4·2H2O，ddH2O定容至100?mL攪拌充分，用直徑?25?mm?的玻璃纖維濾紙及配套過濾器（Whatman?GF/A）過濾除菌，4℃保存］，磁力攪拌器攪拌均勻，蒸餾水定容至1?L。

所有培養基均121℃，高壓滅菌20?min后備用。

1.3?試驗方法

1.3.1?禾谷鐮孢菌株活化和孢子懸浮液的制備

菌株活化：將保存的菌株接種于PDA培養基中央，25℃培養箱中黑暗培養4～5?d，從菌落邊緣打取菌餅接種到新的PDA平板上培養，待用。

孢子懸浮液制備：用直徑5?mm打孔器在活化的菌株菌落邊緣打取數個菌餅，置于30?mL綠豆湯培養基中，25℃，175?r/min振蕩培養5?d，滅菌的4層擦鏡紙過濾，4?000?r/min?3?min濃縮富集，無菌ddH2O清洗兩次，備用。

1.3.2?高溫脅迫對禾谷鐮孢菌絲生長的抑制

采用菌絲生長速率法。在已活化的菌株菌落邊緣打取5?mm菌餅，接種于直徑90?mm的SNA平板上，置于25℃和30℃黑暗培養，每處理重復3次，培養6?d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算高溫脅迫抑制率。

抑制率=25℃菌落直徑-30℃菌落直徑25℃菌落直徑-菌餅直徑×100%。

1.3.3?高溫脅迫下禾谷鐮孢產孢量測定

采用綠豆湯振蕩培養法。在已活化的菌株菌落邊緣打取5?mm菌餅，接種于含30?mL的綠豆湯培養基中，每瓶5個菌餅，分別于25℃和30℃下，175?r/min振蕩培養3?d，血球計數板計數，計算單位體積產孢量，每個溫度處理3個重復，以25℃培養為對照，用t測驗比較25℃和30℃下產孢量的差異顯著性。

1.3.4?高溫脅迫下禾谷鐮孢的孢子萌發

將孢子懸浮液濃度調節為5×104個/mL，取200?μL均勻涂布于直徑9?cm的水瓊脂平板上，分別置于25℃（對照）和30℃下黑暗培養，每個溫度處理3次重復，于培養6、8、10、12?h時，在顯微鏡下觀察孢子萌發率，每個重復至少觀察100個孢子，當芽管長度超過分生孢子短徑一半即為萌發，直至萌發率達90%及以上。

1.3.5?高溫下多種脅迫對禾谷鐮孢生長的影響

在已活化的菌株菌落邊緣打取5?mm菌餅，分別接種到終濃度為1?mol/L?NaCl，1?mol/L?KCl，0.25?mol/L?CaCl2，0.05%?剛果紅，0.05%?SDS或0.05%?H2O2的PDA平板上，以添加等體積無菌水為對照，每處理重復3次，置于25℃（溫度對照）和30℃黑暗培養，6?d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。采用t檢驗法分別比較同一菌株同一脅迫處理下25℃和30℃下菌落直徑的差異顯著性，同一菌株相同溫度下各脅迫處理與無菌水對照之間的差異顯著性。

1.3.6?高溫脅迫下禾谷鐮孢的致病力測定

致病力測定采用小麥胚芽鞘室內接種法［9］。將‘京雙16’用1%次氯酸鈉溶液消毒1?min，無菌水沖洗至無味，置于鋪有4層濾紙的發芽盒里，種子腹溝朝下，粒與粒之間保持一定間距，盒內保持濕潤，盒上蓋濕潤紗布，轉移至人工氣候培養箱，25℃，L∥D=12?h∥12?h，培養2～3?d至胚芽鞘長到2～3?cm，選取長勢較一致的胚芽鞘置于鋪有2層濾紙的?9?cm?培養皿中，每皿10個，并設置2個重復。剪去鞘尖2～3?mm，戴上用濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液浸濕的濾紙帽，以無菌水浸濕的濾紙帽接種為對照，培養皿上倒置經紫外線滅菌的500?mL燒杯，封口膜封口，留燒杯嘴供加水和植株呼吸，置于人工氣候培養箱，分別于25℃（對照）和30℃，L∥D=12?h∥12?h條件下培養，接種3?d后，去除燒杯和濾紙片，7?d后測量25℃和30℃下培養的胚芽鞘莖基部的褐色病斑長度，用t檢驗法進行差異顯著性分析，并計算30℃下病斑長度和25℃病斑長度的比值（R）。當R>1且30℃和25℃下病斑長度有顯著性差異，表明高溫下致病力顯著增加，當R<1且30℃和25℃下病斑長度有顯著性差異，表明高溫下致病力顯著降低。

1.3.7?高溫脅迫下禾谷鐮孢的DON毒素產量

將孢子懸浮液接種于20?mL/瓶TBI培養基［10］中，每瓶大約5×104個孢子，于25℃（對照）和30℃黑暗條件下，175?r/min振蕩培養7?d，過濾收集濾液于?2?mL?離心管，每處理3個重復，用嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮孢菌烯醇，DON）酶聯免疫試劑盒（涿州凱斯科生物技術有限公司）測定濾液中DON毒素含量，t檢驗法進行差異顯著性分析，并計算30℃和25℃下DON含量的比值（R）。當R>1且30℃和25℃下DON含量有顯著差異，表明高溫下產毒量顯著增加，當R<1且30℃和25℃下DON含量有顯著性差異，表明高溫下產毒量顯著降低。

1.3.8?數據分析

數據分析使用R語言采用RGui?4.1.2進行統計分析，選擇獨立樣本t檢驗法進行差異顯著性分析。

2?結果與分析

2.1?高溫脅迫對禾谷鐮孢菌絲生長的影響

供試的9株菌株在25℃和30℃下的菌落直徑和抑制率如表1所示，9個菌株在高溫下的抑制率分布在21%～34%之間，根據抑制率將9個菌株分為兩組，抑制率>30%時歸類為溫度敏感型菌株，包括菌株Fg47、Fg39、Fg180590和Fg180621;抑制率<30%時，歸類為耐高溫菌株，包括Fg180664、Fg180663、Fg180680、Fg180730和Fg180673。

2.2?高溫脅迫對禾谷鐮孢產孢量的影響

溫度對禾谷鐮孢的產孢量有一定的影響（表2），5株耐高溫菌株中，Fg180664和Fg180673在25℃和30℃下產孢量沒有顯著差異，但是菌株Fg180663、Fg180680、Fg180730在30℃的產孢量顯著高于25℃（P<0.05）。而4株溫度敏感型菌株中，除了菌株Fg47產孢量在兩個溫度間沒有顯著差異外，菌株Fg39、Fg180590、Fg180621在30℃條件下的產孢量顯著低于25℃下的產孢量（P<0.05）。綜上，溫度升高有3株耐高溫菌株的產孢量顯著增加，3株溫度敏感型菌株的產孢量顯著降低，表明耐高溫菌株可能通過增加產孢量來抵御高溫，因此，產孢階段是耐高溫菌株抵御高溫的一個關鍵發育階段。

2.3?高溫脅迫對禾谷鐮孢孢子萌發的影響

供試菌株在25℃和30℃下培養，分生孢子萌發率如圖1所示，除菌株Fg180664在30℃條件下，培養6?h時孢子萌發率低于25℃培養下的孢子萌發率外，其他8個菌株在30℃條件下，培養6?h的孢子萌發率均高于25℃培養下的孢子萌發率，部分達到顯著水平;但是培養至10?h時，除菌株Fg180673和Fg180730外，其余菌株的孢子萌發率在25℃和30℃下一致，均在80%以上，且耐高溫菌株與敏感菌株間沒有明顯差異。以上研究結果表明，30℃高溫脅迫能夠促進菌株的孢子萌發，但不影響最終孢子的萌發率，且高溫脅迫對耐高溫菌株和敏感菌株的孢子萌發的影響沒有差異。

2.4?高溫對禾谷鐮孢應答環境脅迫的影響

25℃和30℃下，5株耐高溫禾谷鐮孢菌株和4株溫度敏感型菌株對鹽脅迫因子（NaCl、KCl、CaCl2）、細胞壁脅迫因子（剛果紅、SDS）及氧化脅迫因子（H2O2）的應答能力測定結果顯示，25℃下，所有供試菌株在各鹽脅迫因子的脅迫下，菌落直徑均顯著小于無菌水對照組的直徑（P<0.05）;30℃下各鹽脅迫因子對所有供試菌株生長的抑制的程度低于25℃，甚至有的菌株菌落直徑會超過30℃下無脅迫對照組的直徑（表3）。具體而言，在含有NaCl?和CaCl2的培養基上，30℃下各菌株菌落直徑與25℃下菌落直徑相當，或者大于25℃下菌落直徑;而在含有KCl的培養基上，除菌株Fg180664外，所有供試菌株的菌落直徑在30℃和25℃條件下并沒有顯著差異（P>0.05）。30℃下，耐高溫菌株與溫度敏感型菌株對鹽脅迫的反應沒有明顯差異（F=3.84，P=0.06）。以上研究結果表明，30℃高溫會減輕NaCl和CaCl2脅迫對禾谷鐮孢生長的抑制，但是不影響KCl脅迫對禾谷鐮孢生長的抑制，表明高溫（30℃）下禾谷鐮孢對NaCl和CaCl2脅迫有一定的耐受性，但是不同溫度敏感型菌株之間沒有差異（NaCl：?F=3.41，P=0.08;CaCl2：?F=0.14，P=0.71）。

在細胞壁脅迫（剛果紅和SDS）培養下，不論是在25℃還是30℃下，所有供試菌株的菌落直徑均小于同一溫度下對照的菌落直徑。就同一脅迫而言，所有供試菌株在30℃下的菌落直徑也均小于25℃下的菌落直徑，且大多差異顯著（表4，P<0.05）。30℃下，耐高溫菌株與溫度敏感型菌株對剛果紅和SDS脅迫反應沒有明顯差異（剛果紅：F=0.97，P=0.33;SDS：F=0.83，P=0.37）。表明高溫使禾谷鐮孢對細胞壁脅迫因子剛果紅和SDS更加敏感，但不同溫度敏感型菌株之間沒有差異。

25℃和30℃下，在含0.05%?H2O2的培養基上所有供試菌株的菌落直徑均小于同一溫度下對照的菌落直徑。且在0.05%?H2O2脅迫下，所有菌株在30℃下的菌落直徑均顯著低于25℃（表5，P<0.05）。30℃下，耐高溫菌株與溫度敏感型菌株對H2O2氧化脅迫反應沒有明顯差異（F=3.94，P=0.06）。表明，30℃高溫使禾谷鐮孢對氧化脅迫因子H2O2的脅迫更加敏感，但不同溫度敏感型菌株之間沒有差異。

2.5?高溫脅迫對禾谷鐮孢致病力和產DON毒素的影響

禾谷鐮孢在25℃和30℃下對小麥胚芽鞘致病力結果如表6所示，?不同禾谷鐮孢菌株在不同溫度下對小麥胚芽鞘的致病力不同，與25℃相比，30℃高溫下5株耐高溫菌株處理的小麥胚芽鞘的病斑長度分別表現為增加（Fg180664，?P<0.05）、降低（Fg180663和Fg180680，P<0.05）和沒有差異（Fg180730和Fg180673），而4株溫度敏感型菌株中除菌株Fg180590侵染小麥胚芽鞘引起的病斑長度小于25℃外，菌株Fg47，Fg39和Fg180621的病斑長度均顯著長于25℃（P<0.05），且30℃與25℃病斑長度的比值都大于5。以上研究結果表明，大部分耐高溫菌株在30℃下致病力不變或降低，而大部分敏感菌株在30℃下致病力反而增加。

供試的9株禾谷鐮孢菌株在25℃和30℃條件下產DON毒素量見表6，溫度對不同菌株產毒量的影響不同。耐高溫菌株Fg180663

在30℃條件下產生的DON毒素量顯著低于25℃，而Fg180664、Fg180680和Fg180673在30℃條件下的毒素含量是25℃下的5倍以上；溫度敏感型菌株Fg39、Fg180590和Fg180621在30℃條件下的毒素含量僅為25℃下的2倍左右?？傮w而言，高溫（30℃）對大部分菌株的DON毒素的產量有一定促進作用，多數菌株在30℃條件下產生的毒素量顯著增加。

綜上，高溫對禾谷鐮孢對小麥胚芽鞘致病力的影響與對DON毒素含量的影響因菌株不同而有差異（表6），對于菌株Fg180664、Fg180663、Fg180730、Fg39和Fg180621，高溫對致病力和產毒素量的影響一致，在30℃條件下，其毒素含量增加，對小麥胚芽鞘的致病力也增加;毒素含量降低，致病力也減弱。而菌株Fg180680、Fg180673、Fg47和Fg180590則恰好相反。

3?結論與討論

溫度對病原菌生長、繁殖和致病力都有很大的影響。本研究分析了25℃和30℃對多個禾谷鐮孢株的產孢量、孢子萌發速率、脅迫以及致病力和產毒能力等生物學性狀方面的影響，結果表明，相對高溫（30℃）對于9種禾谷鐮孢的菌絲生長均有明顯的抑制作用，這與已有的報道和實驗室前期研究結果一致，25℃是禾谷鐮孢最適生長溫度，溫度升高菌絲生長速率下降［11］。與之相反，30℃的相對高溫對于供試禾谷鐮孢菌株的孢子萌發有一定的促進作用，但是不影響最終的孢子萌發率。由于孢子萌發過程是一個能量需求過程，適當的高溫能夠提供更多的能量，從而使孢子的萌發進程加快。同時，高溫促進部分耐高溫菌株的產孢量顯著增加，降低部分溫度敏感型菌株的產孢量，表明產孢階段是耐高溫菌株抵御高溫的一個關鍵發育階段。

對供試禾谷鐮孢菌株的三類脅迫研究表明，相對高溫（30℃）使菌株對鹽脅迫（NaCl和CaCl2）的耐受能力提高，該研究結果與對酵母的研究結果類似，酵母通過Na+、K+、Ca2+的外流，囊泡中的區隔化、增加質膜對某種離子的吸收來限制其他離子的吸收等來抵御鹽脅迫，也可能是溫度誘導使酵母對鹽脅迫條件產生交叉保護［1112］。

高溫對禾谷鐮孢的致病力和DON毒素產量都產生了一定的影響，大部分耐高溫菌株在30℃下的致病力不變或降低，而大部分敏感菌株在30℃下的致病力反而增加。但是，溫度對不同菌株致病力的影響與對DON毒素產生量的影響并不一致。這與已報道的結果吻合，禾谷鐮孢的產孢量與致病力沒有相關性［1314］。

以上研究結果明確了溫度對禾谷鐮孢生長、致病力及毒素產生的影響，明確了耐高溫菌株可能通過增加產孢量來抵御高溫，因此，產孢階段是耐高溫菌株抵御高溫的一個關鍵發育階段。且部分耐高溫菌株在高溫下毒素的產生會增加，該研究結果為禾谷鐮孢溫度適應性規律的研究奠定了基礎，對進一步深入認識該菌的溫度適應性進化的分子機理，研究氣候背景下小麥赤霉病的流行及預測預報和病害防控策略的制定具有重大意義。

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（責任編輯：楊明麗）