桃蚜組織蛋白酶基因CTSB 16D和CTSB 348的克隆、表達譜及對不同環境脅迫的響應

姜萬千 楊磊 孟建玉 楊昌利 張長禹

摘要

為了探索組織蛋白酶基因CTSB16D和CTSB348在桃蚜Myzus?persicae（Sulzer）響應高低溫和UVB脅迫中的作用，通過RTPCR技術克隆了桃蚜CTSB16D和CTSB348基因，利用生物信息學方法分析了它們的序列特征;采用實時熒光定量PCR（quantitative?realtime?PCR，RTqPCR）技術檢測了2個基因在桃蚜不同發育階段的相對表達量及經高溫、低溫和UVB脅迫不同時長的無翅成蟲中的相對表達量?？寺～@得了桃蚜CTSB16D（GenBank登錄號：MZ962352）和CTSB348（GenBank登錄號：MZ962353）基因，序列長度分別為1?096?bp和1?101?bp，開放閱讀框（ORF）分別為1?017?bp和1?023?bp，分別編碼338個和340個氨基酸，蛋白相對分子量為38.14?kD和37.52?kD，等電點（pI）為5.46和5.99。系統發育分析表明，桃蚜CTSB16D和CTSB348均與豌豆蚜Acyrthosiphon?pisum?（XP_003246386.1、NP_001119608.1）?CTSB親緣關系最近。RTqPCR分析表明，CTSB16D和CTSB348在桃蚜不同發育階段均有表達，分別在1齡若蟲和無翅成蟲中的表達量最高。高、低溫和UVB脅迫對CTSB16D和CTSB348基因的表達具有明顯的誘導作用，且表達量均隨時間的延長呈先上升后下降的趨勢;4℃脅迫下，CTSB16D和CTSB348表達量均在90?min時達到峰值;36℃脅迫下，CTSB16D和CTSB348表達量均在30?min時達到峰值;UVB脅迫下，CTSB16D和CTSB348表達量分別在60?min和120?min時達峰值。桃蚜CTSB16D和CTSB348基因在不同發育階段差異表達，且響應溫度和UVB的脅迫，推測兩個基因參與桃蚜的生長發育并在桃蚜響應環境脅迫中發揮了重要作用。

關鍵詞

桃蚜;?組織蛋白酶;?基因克隆;?表達分析

中圖分類號：

S?433

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022811

Cloning?and?expression?profiling?of?the?cathepsin?genes?CTSB16D?and?

CTSB348?and?their?response?to?different?environmental?stresses?in?

Myzus?persicae?（Hemiptera：?Aphididae）

JIANG?Wanqian1，?YANG?Lei2，?MENG?Jianyu3，?YANG?Changli1，?ZHANG?Changyu1*

（1.?Guizhou?Provincial?Key?Laboratory?for?Agricultural?Pest?Management?in?the?Mountainous?Region，?Institute?of?

Entomology，?Guizhou?University，?Guiyang?550025，?China;?2.?China?Tobacco?Hunan?Industrial?Co.，?Ltd.，?

Changsha?410007，?China;?3.?Guizhou?Research?Institute?of?Tobacco?Science，?Guiyang?550081，?China）

Abstract

To?explore?the?role?of?CTSB16D?and?CTSB348?of?Myzus?persicae?（Sulzer）?in?response?to?high?and?low?temperature?and?UVB?stresses，?they?were?cloned?by?RTPCR?and?their?sequence?characteristics?were?analyzed?using?bioinformatics?approaches.?The?relative?expression?levels?of?the?two?genes?in?aphids?at?different?developmental?stages?and?in?wingless?adults?exposed?to?high?temperature，?low?temperature?and?UVB?stresses?for?different?durations?were?detected?by?quantitative?realtime?PCR?（RTqPCR）.?The?sequences?of?CTSB16D?and?CTSB348?（GenBank?acc.?nos.?MZ962352?and?MZ962353）?were?1?096?bp?and?1?101?bp?in?length，?with?an?open?reading?frame?of?1?017?bp?and?1?023?bp，?encoding?338?and?340?amino?acids，?respectively.?The?relative?molecular?weight?of?the?proteins?are?38.14?kD?and?37.52?kD，?with?an?isoelectric?point?of?5.46?and?5.99，?respectively.?Phylogenetic?analysis?showed?that?both?CTSB16D?and?CTSB348?had?the?closest?relationship?with?CTSB?of?Acyrthosiphon?pisum?（XP_003246386.1，?NP_001119608.1）.?RTqPCR?analysis?showed?that?the?two?genes?were?expressed?at?different?developmental?stages，?with?the?highest?expression?levels?of?CTSB16D?and?CTSB348?in?the?1stinstar?nymph?and?wingless?adults，?respectively.?Low?and?high?temperature?and?UVB?stresses?obviously?induced?the?expression?of?CTSB16D?and?CTSB348?genes，?and?the?expression?increasing?first?and?then?decreased?with?increasing?exposure?time.?Under?4℃，?the?expression?levels?of?CTSB16D?and?CTSB348?reached?the?peak?after?90?min?exposure，?respectively，?but?under?36℃，?their?expression?reached?the?peak?after?30?min?exposure.?Under?UVB?stress，?the?expression?levels?of?CTSB16D?and?CTSB348?peaked?after?60?min?and?120?min?exposure，?respectively.?The?different?expressions?of?CTSB16D?and?CTSB348?at?different?developmental?stages?and?their?different?responses?to?temperature?and?UVB?stresses?suggested?that?the?two?genes?were?involved?in?the?growth?and?development?of?M.persicae?in?response?to?environmental?stresses.

Key?words

Myzus?persicae;?cathepsin;?gene?cloning;?expression?analysis

組織蛋白酶（cathepsin，CTS）是一類存在于溶酶體中的胞內蛋白酶，以酶原形式在核糖體中合成，并通過高爾基體糖基化和磷酸化后轉運至溶酶體內［12］。根據活性中心的氨基酸殘基可將組織蛋白酶分為3大類：半胱氨酸蛋白酶（CTSB、CTSF、CTSH、CTSL、CTSK、CTSO、CTSS、CTST、CTSV、CTSX和CTSW）、天冬氨酸蛋白酶（CTSD和VE）、絲氨酸蛋白酶（CTSA和CTSG）［3］。組織蛋白酶作為一種多功能蛋白酶系，在昆蟲的生長發育、細胞凋亡、免疫和生物及非生物脅迫等過程中發揮作用［4］。例如饑餓條件下，水稻二化螟Chilo?suppressalis?CTSO和CTSL基因表達量上調，表明兩基因編碼的酶參與了腸道內蛋白質的消化［5］。家蠶Bombyx?mori?CTSL參與應對大腸桿菌、球孢白僵菌和蠟樣芽胞桿菌的應激反應，推測其在昆蟲的先天免疫系統中具有重要作用［6］。Song等［7］發現菜蛾盤絨繭蜂Cotesia?vestalis寄生的小菜蛾Plutella?xylostella體內CTSB水平會顯著升高，推測CTSB可能參與免疫響應。

溫度作為一種重要的非生物環境脅迫因子，會對昆蟲的生長發育、生物學特性和種群動態造成影響［810］。極端溫度（高溫和低溫）脅迫可能導致昆蟲的發育歷期延長、壽命縮短和繁殖力降低［1113］。為了減小由環境熱或冷脅迫而造成的損傷，昆蟲已經進化出了多種保護策略來增加它們的耐受性，進而適應多變的環境［14］。高溫誘導家蠶5齡幼蟲CTSB和CTSD的高表達，導致幼蟲期縮短提前化蛹［1516］。柑橘木虱Diaphorina?citri成蟲在高溫（40℃）脅迫下CTSB的表達水平顯著上調，表明其積極參與柑橘木虱對高溫脅迫的防御響應［17］。

紫外線B（UVB）（280～320?nm）是到達地球的最強光波，能夠被大氣中的臭氧層有效吸收，但仍約有10%穿透臭氧層并到達地球［18］。研究表明，CTSB在UV誘導下作為一種促凋亡介質，從溶酶體釋放到細胞質基質，從而誘導細胞凋亡［19］。UVB輻射可導致昆蟲體內活性氧（ROS）的形成和積累，從而對DNA、蛋白質、碳水化合物和脂質等造成破壞，并影響生長發育、生理生化和種群結構［2021］。如UVB輻射可提高白紋伊蚊Aedes?albopictus和淡色庫蚊Culex?pipiens的代謝率，其存活率顯著降低［22］。UV輻射誘導家蠶CTSL表達水平顯著增加，并使其胚胎細胞程序性死亡，表明CTSL參與了胚胎細胞的程序性死亡［23］。然而，目前關于CTSB在桃蚜Myzus?persicae（Sulzer）響應UV脅迫中的作用尚未見報道。

桃蚜屬半翅目Hemiptera蚜科Aphididae，是煙區常見的害蟲，其危害程度較大，世界各地均有分布。桃蚜寄主范圍廣，除為害煙草外，還取食十字花科、薔薇科、豆科和茄科等400多種植物，是典型的多食性昆蟲［24］。近年來，隨著大氣臭氧層被破壞，導致到達地面的紫外線輻射增強，以及全球氣候變暖等問題，對昆蟲的生長發育帶來影響。然而，CTSB在抵御溫度和UV脅迫中的作用尚不清楚。本研究通過克隆桃蚜CTSB16D和CTSB348基因并分析它們的序列特征，采用RTqPCR技術檢測2個基因在不同發育階段、高低溫脅迫以及UVB脅迫下的表達情況，探索CTSB基因在桃蚜生長發育過程中的作用，為進一步揭示CTSB基因在昆蟲應對環境脅迫中的功能奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

供試蟲源：試驗所用桃蚜采集于貴陽市花溪區（106.68°E，26.43°N）周邊煙田，在人工氣候箱用煙苗飼養，每7?d更換1次煙苗，保證寄主新鮮，室內溫度為（25±1）℃，光周期L∥D=14?h∥10?h（光期6：00-20：00;暗期：20：00-6：00），相對濕度（70±5）%。

試劑和儀器：Eastep?Super?RNA提取試劑盒，上海普洛麥格生物產品有限公司;HiFiScript?cDNA第一鏈合成試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司;2×Taq?PCR?StarMix預混液，北京康潤誠業生物科技有限公司;pMD19T載體、大腸桿菌Escherichia?coli?DH5α感受態細胞、TB?Green?Premix?DimerEraser熒光試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司;其余試劑均為國產分析純。RXZ型智能人工氣候箱，寧波江南儀器廠;58B01型UVB紫外燈（波長280～320?nm，強度300?μW/cm2），南京華強電子有限公司;UVB紫外輻照計，北京師范大學光電儀器廠;NanoPhotometerTMPClass超微量紫外分光光度儀，美國賽默飛世爾科技公司;T100?Thermal?Cycler?PCR儀、CFX96Touch熒光定量PCR儀、Imaging?System?PowerPac系列電泳儀，美國BioRad公司。HZ2111KB搖床，太倉市華利達實驗設備有限公司。

1.2?方法

1.2.1?樣品采集和脅迫試驗

試驗設置參照周呂等［25］和Yang等［26］的研究，并做了進一步優化。不同發育階段材料：取桃蚜1、2齡若蟲80頭，3、4齡若蟲60頭，無翅和有翅成蟲各30頭，3次生物學重復;4、36℃和UVB脅迫試驗材料：取桃蚜1日齡無翅成蟲在培養箱中以4℃和36℃分別處理0（CK），30，60，90，120?min和150?min;取桃蚜1日齡無翅成蟲暗適應2?h后，以UVB（280～320?nm）紫外燈為光源進行輻射處理0（CK），30，60，90，120?min和150?min，輻射強度為300?μW/cm2，在UVB輻射期間溫濕度和正常飼養條件相同。每處理30頭，3次生物學重復，所有樣品處理后立即裝入1.5?mL?EP管，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2?桃蚜CTSB16D和CTSB348基因cDNA序列克隆

使用Eastep?Super?Total?RNA?Extraction?Kit提取桃蚜總RNA，使用NanoPhotometerTM?PClass分光光度儀檢測其濃度，按照HiFiScript?cDNA第一鏈合成試劑盒說明書完成cDNA第1鏈的合成。通過對已知同源昆蟲CTSB序列比對，在保守區各設計1對引物CTSB16DF/CTSB16DR和CTSB348F/CTSB348R（表1），以合成的?cDNA?第1鏈為模板擴增桃蚜CTSB16D和CTSB348基因的中間片段。PCR反應體系（25?μL）為：2×Taq?PCR?StarMix?（Dye）?12.5?μL，cDNA?模板（200?ng/μL）1.5?μL，正、反向引物（10?μmol/L）各1.5?μL，DEPC水8?μL。反應條件：94℃?3?min;94℃?30?s，55℃?30?s，72℃?1?min，35個循環;72℃?5?min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒回收目的片段，連接到pMDTM19T載體上并轉化至感受態細胞DH5α，于LB培養基37℃條件下培養12?h，挑取單菌落做菌落PCR鑒定后進行擴大培養，菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3?桃蚜CTSB16D和CTSB348基因的序列分析

應用在線網站NCBI（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST程序對桃蚜CTSB16D和CTSB348進行氨基酸序列分析，利用ORF?Finder（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）查找其開放閱讀框;使用ExPASy?ProtParam?Tool（https：∥web.expasy.org/protparam/）和ExPASyTools中的NetNGlyc預測蛋白質的理化性質;使用TMHMM?Server?2.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM2.0）預測蛋白跨膜結構;應用SMART（http：∥smart.emblheidelberg.de/）進行保守結構域的預測;應用網站（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析磷酸化位點。系統發育樹由MEGA?6.0軟件以鄰接法（neighborjoining）構建，重復運行1?000次，進化樹的節點處數值表示置信度。

1.2.4?桃蚜CTSB16D和CTSB348基因的表達分析

選用Actin基因作為內參基因，引物見表1，桃蚜各發育階段和經4℃、36℃和UVB脅迫的無翅成蟲RNA提取和cDNA合成同1.2.2，參照TB?Green?Premix?DimerEraser熒光試劑盒說明書進行RTqPCR擴增。20?μL RTqPCR反應體系：cDNA模板1?μL，TB?Green?Premix?DimerEraser?10?μL，上、下游引物（10?μmol/L）各1?μL，DEPC水?7?μL。反應條件：95℃?3?min;95℃?30?s，退火溫度（表1）?30?s，39個循環;95℃?10?s，65℃?5?s。

1.3?數據分析

采用2-ΔΔCt法［27］計算桃蚜CTSB16D和CTSB348基因相對表達量。應用SPSS?19.0軟件對數據進行單因素方差分析（Tukey氏法），采用Excel?2010軟件繪圖。

2?結果與分析

2.1?桃蚜CTSB16D和CTSB348基因克隆與序列分析

克隆桃蚜CTSB基因并命名為CTSB16D（GenBank登錄號：MZ962352）和CTSB348（GenBank登錄號：MZ962353），CTSB16D和CTSB348長度分別為1?096?bp和1?101?bp，開放閱讀框（ORF）為1?017?bp和1?023?bp，編碼338和340個氨基酸。蛋白相對分子量為38.14?kD和37.52?kD，等電點（pI）為5.46和5.99。計算得到不穩定性指數（Ⅱ）為27.31和25.79，即蛋白質均穩定，預測親水性的平均值（GRAVY）為-0.537和-0.298，表明蛋白質均表現親水性。兩個蛋白質分別含有2個和1個N糖基化位點，均無跨膜結構域，SMART分析發現分別在86-334和89-338氨基酸處含有木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶Pept_C1保守結構域。

2.2?桃蚜CTSB16D和CTSB348系統進化分析

以軟體動物長牡蠣Crassostrea?gigas?CTSB為外群，從NCBI數據庫搜索鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和半翅目昆蟲的CTSB氨基酸序列，與推導的桃蚜CTSB氨基酸序列采用鄰接法構建系統發育樹（圖1）。結果表明，昆蟲綱鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和半翅目昆蟲CTSB各聚為一個分支，軟體動物長牡蠣聚為另一分支;從目以下的分類階元來看，桃蚜CTSB16D與豌豆蚜Acyrthosiphon?pisum、豆蚜Aphis?craccivora、玉米蚜Rhopalosiphum?maidis和棉蚜Aphis?gossypii聚為一支;桃蚜CTSB348與豌豆蚜、玉米蚜和棉蚜及煙粉虱Bemisia?tabaci和褐飛虱Nilaparvata?lugens聚為一支，說明同一分支中的昆蟲親緣關系較近，并且發現桃蚜CTSB16D和CTSB348均與同屬的豌豆蚜親緣關系最近，與其他目昆蟲的同源性較低，分屬不同支，表明CTSB的聚類結果能較好地反映昆蟲種間的親緣關系。

2.3?桃蚜CTSB16D和CTSB348基因的表達分析

CTSB16D和CTSB348在桃蚜整個生長發育階段均有表達（P<0.05）（圖2），其中CTSB16D在1齡若蟲中表達量最高，在2齡若蟲期的表達量最低;CTSB348在無翅成蟲期的表達量最高，在2齡、4齡若蟲和有翅成蟲中表達量較低。

4℃脅迫下，桃蚜CTSB16D和CTSB348的表達量均隨時間呈先上升后下降的趨勢（P?<0.05）（圖3），其中CTSB16D在60、90?min和120?min時顯著高于對照（0?min），在90?min時達到峰值，為對照的1.56倍;CTSB348的表達量在30、90、120?;min?和150?min時顯著高于對照，在90?min達到峰值，為對照的3.52倍。

36℃脅迫下，桃蚜CTSB16D和CTSB348表達量均隨時間延長呈先上升后下降的趨勢（P<0.05）（圖4）。CTSB16D在30?min和60?min表達量顯著高于對照，在30?min達到峰值，為對照的1.92倍。CTSB348在30?min時達到峰值，為對照的9.11倍，此后CTSB348相對表達量開始下降，至90、120?min和150?min時穩定表達，且均顯著高于對照水平。

UVB脅迫下，桃蚜CTSB16D和CTSB348表達量隨時間延長呈先上升后下降的趨勢（P?<0.05）（圖5），CTSB16D表達量均顯著高于對照，在60?min達到峰值，為對照的15.16倍，此后的表達量隨時間延長逐漸降低;CTSB348相對表達量在60、90?min和120?min均顯著高于對照，在120?min達到峰值，為對照的4.66倍。

3?結論與討論

組織蛋白酶是生物體內溶酶體中重要的水解酶系，本研究克隆獲得了桃蚜2個組織蛋白酶基因CTSB16D和CTSB348，序列長度分別為1?096?bp和1?101?bp，ORF為1?017?bp和1?023?bp，序列分析表明，2個基因編碼的氨基酸分別含有2個和1個N糖基化位點，無跨膜結構域，均具有組織蛋白酶保守結構域Pept_C1［2］。系統發育分析結果表明，桃蚜CTSB與半翅目蚜科昆蟲的CTSB聚為一支，說明它們在進化關系上同源關系更近，這與棉蚜的研究結果一致［28］。

組織蛋白酶參與昆蟲的細胞凋亡，在其個體發育和變態反應等生命活動中具有重要作用［29］。本研究發現，CTSB16D和CTSB348基因在桃蚜不同發育階段均有表達，CTSB16D在1齡若蟲中的表達量最高，之后表現為下降趨勢，發育到3齡若蟲時達到第2個峰值。CTSB348表達量在無翅成蟲期達到峰值。這與扶桑綿粉蚧Phenacoccus?solenopsis?CTSB基因在不同發育階段表達模式不同［30］?？赡蹸TSB基因在不同昆蟲生長發育過程中發揮的作用不同，如赤擬谷盜Tribolium?castaneum?CTSB在高齡幼蟲中的表達量最高，柑橘木虱CTSB在若蟲和成蟲中高表達［3132］。棉鈴蟲Helicoverpa?armigera?CTSB活性隨著胚胎發育逐漸降低，在蛹后期表達量升高，推測其參與棉鈴蟲組織分化［33］。這表明組織蛋白酶在不同物種發育階段的表達具有不同的規律，CTSB在昆蟲發育過程中表現出階段特異性［4］。

昆蟲屬于變溫動物，極端低溫或高溫都會影響其生存和生長發育［3435］。組織蛋白酶作為一種多功能水解酶系，在昆蟲響應溫度脅迫過程中發揮重要作用［4］。例如柑橘木虱、長角血蜱Haemaphysalis?longicornis和家蠶在不同溫度脅迫后，其體內的組織蛋白酶表達顯著上調，推測組織蛋白酶響應溫度的脅迫［1617，36］。本研究發現，高低溫脅迫下桃蚜CTSB16D和CTSB348基因的表達被顯著誘導，且表達量隨時間延長整體呈先上升后下降的變化趨勢，4℃脅迫下，CTSB16D和CTSB348表達量均在90?min時達到峰值;36℃脅迫下，CTSB16D和CTSB348表達量均在30?min達到峰值。在棉蚜CTSB基因響應不同溫度脅迫時也得到了類似的結果［37］。我們推測短時間的極端溫度刺激，能有效誘導桃蚜2個CTSB基因的表達，激發體內的保護機制，從而提高桃蚜對溫度脅迫的耐受力。隨著極端溫度脅迫時間的延長，CTSB基因表達量下降，這可能與半胱氨酸蛋白酶對昆蟲響應極端溫度脅迫的保護作用存在閾值有關，當超過保護閾值后會導致CTSB的表達水平下降［38］。

UVB是環境中影響生物的重要脅迫因子［39］。UVB輻射會引起昆蟲相關基因的差異表達，如氧自由基（ROS）、熱激蛋白HSP70、細胞色素氧化酶和蛋白酶基因等，從而響應UVB脅迫［4042］。本研究發現，UVB能夠誘導CTSB16D和CTSB348的表達，推測CTSB參與桃蚜對UVB脅迫的應激反應。二斑葉螨Tetranychus?urticae在UVB脅迫下，體內CTSB基因的表達量也顯著上調［43］。本研究還發現UVB脅迫下，CTSB16D和CTSB348相對表達量隨時間呈先增高后降低的趨勢，分別在60?min和120?min到達峰值，這可能與短時間的UVB脅迫對桃蚜細胞造成的損傷，能夠通過其體內CTSB的上調表達來修復有關;而隨著UVB脅迫時間的延長，CTSB16D和CTSB348表達量均顯著下降，可能長時間的UVB脅迫對機體造成的損傷超出CTSB基因的閾值，導致表達量下降，這與Yoon等［44］的研究結果相符。

綜上，本研究克隆了桃蚜CTSB16D和CTSB348基因，發現低溫、高溫和UVB脅迫會誘導桃蚜成蟲CTSB基因的表達，該結果初步闡明了CTSB基因在桃蚜響應環境脅迫中具有重要的作用，為進一步深入研究桃蚜CTSB功能及其在響應環境脅迫中的作用機制等方面奠定了基礎。

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（責任編輯：楊明麗）