我國梅樹上病毒及類病毒的檢測和鑒定

張煜泓 徐惠媛 戰斌慧 盧美光 李世訪 張志想

摘要

目前，我國梅樹上的病毒種類及發生情況仍不完全清楚。本研究從北京、武漢、南京和無錫的梅園中采集了64份疑似感染病毒的葉片樣品，通過RTPCR和斑點雜交，對7種病毒和2種類病毒進行了檢測。共檢測到6種病毒和1種類病毒。其中，李屬壞死環斑病毒（prunus?necrotic?ringspot?virus，PNRSV）和桃潛隱花葉類病毒（peach?latent?mosaic?viroid，?PLMVd）為我國梅樹上的首次檢出。PNRSV、亞洲李屬病毒2號（Asian?prunus?virus?2，?APV2）、桃葉痘伴隨病毒（peach?leaf?pittingassociated?virus，?PLPaV）的檢出率高于30%。綜合考慮病毒的分布及檢出率，PLPaV、APV2、PNRSV和李樹皮壞死莖痘伴隨病毒（plum?bark?necrosis?stem?pittingassociated?virus，PBNSPaV）是武漢、南京和無錫梅樹上的主要病毒。此外，通過克隆和測序，獲得了PLMVd和梅樹病毒A（mume?virus?A，?MuVA）的基因組，PLPaV的RNA1組分和PNRSV外殼蛋白（CP）基因序列。序列比較分析顯示，我國PLMVd梅分離物和PNRSV梅分離物與我國桃分離物親緣關系最近，表明PLMVd和PNRSV可能在梅和桃樹間交互侵染;我國MuVA梅分離物序列與日本梅分離物序列的相似性高達98.56%;PLPaV梅分離物與我國桃分離物之間序列變異較大。上述結果不僅進一步明確了我國梅樹上的病毒及類病毒種類和分布情況，而且有助于深入了解它們的流行與傳播。

關鍵詞

梅樹;?核果類果樹;?病毒;?類病毒;?檢測

中圖分類號：?S?436.619

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022690

Detection?and?identification?of?viruses?and?viroids?in?Prunus?mume?Siebold?&?Zucc?in?China

ZHANG?Yuhong，?XU?Huiyuan，?ZHAN?Binhui，?LU?Meiguang，?LI?Shifang，?ZHANG?Zhixiang*

（State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，?

Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

The?occurrence?and?distribution?of?viruses?and?viroids?infecting?Prunus?mume?Siebold?&?Zucc.?in?China?remain?partially?understood.?In?this?study，?we?collected?64?suspected?leaf?samples?infected?by?virus?from?P.mume?gardens?in?Beijing，?Wuhan，?Nanjing?and?Wuxi，?and?performed?detection?of?seven?viruses?and?two?viroids?using?RTPCR?and?dotblot?hybridization.?Six?virus?species?and?one?viroid?species?were?detected?from?these?samples.?Among?them，?prunus?necrotic?ringspot?virus?（PNRSV）?and?peach?latent?mosaic?viroid?（PLMVd）?were?first?identified?in?P.mume?in?China.?PNRSV，?Asian?prunus?virus?2?（APV2），?and?peach?leaf?pittingassociated?virus?（PLPaV）?had?a?high?infection?rate?of?more?than?30%.?Based?on?geographic?distribution?and?detection?rates，?PLPaV，APV2，PNRSV?and?plum?bark?necrosis?stem?pittingassociated?virus?（PBNSPaV）?should?be?the?main viruses?in?P.mume?in?Wuhan，?Nanjing，?and?Wuxi.?Furthermore，?the?nucleotide?sequences?of?PLMVd?and?mume?virus?A?（MuVA）?genomes，?RNA1?of?PLPaV，?and?coat?protein?（CP）?of?PNRSV?were?obtained?by?cloning?and?sequencing.?The?results?of?sequence?alignment?showed?that?Chinese?isolates?of?PLMVd?and?PNRSV?were?individually?closest?to?their?corresponding?Chinese?peach?isolates，?suggesting?possible?transmission?between?P.mume?and?peach?trees.?Moreover，?Chinese?P.mume?isolate?of?MuVA?had?the?highest?similarity?with?Japanese?isolate.?Chinese?isolate?of?PLPaV?markedly?differed?from?Chinese?peach?isolate.?These?findings?further?clarify?the?occurrence?and?distribution?of?viruses?and?viroids?in?P.mume?in?China，?and?are?helpful?for?understanding?the?epidemic?and?transmission?of?these?viruses?and?viroids.

Key?words

Prunus?mume;?stone?fruit?tree;?virus;?viroid;?detection

梅Prunus?mume?Siebold?&?Zucc.原產于我國南方，具有三千多年的栽培歷史。川、黔、滇、藏交界處的橫斷山區和云貴高原一帶不僅是梅的自然分布中心，也是梅的變異中心［1］。按用途梅可分為果梅與花梅（梅花）。果梅不僅營養豐富，而且可入藥;花梅具有很高的觀賞價值［1］。

梅是桃、李、杏等核果類果樹的近緣種，在演變過程中，桃、李、杏的種質不同程度地摻入其間［1］。這些近緣的核果類果樹可被一些相同病毒侵染［2］，常見的如亞洲李屬病毒（Asian?prunus?virus，?APV）［3］、李痘病毒（plum?pox?virus，?PPV）［4］、李樹皮壞死莖痘伴隨病毒（plum?bark?necrosis?stem?pittingassociated?virus，?PBNSPaV）［5］、李屬壞死環斑病毒（prunus?necrotic?ringspot?virus，?PNRSV）［6］等。此外，這些病毒可在不同的核果類果樹間交互侵染。因此，梅樹病毒的研究對核果類果樹病毒的防控及生態學研究具有重要意義。然而，同其他核果類果樹相比，梅樹病毒的研究較少。目前，已報道的侵染桃樹的病毒（含類病毒）有30多種，而侵染梅樹的僅有10余種［2］。

此前，利用RTPCR和高通量測序技術，從我國不同地區的梅樹上檢測到了APV1和APV2、PBNSPaV、PPV、蘋果莖溝病毒（apple?stem?grooving?virus，?ASGV）、櫻桃病毒A?（cherry?virus?A，?CVA）、梅病毒A?（mume?virus?A，?MuVA）和桃葉痘伴隨病毒（peach?leaf?pittingassociated?virus，?PLPaV）［79］。但是，仍不確定我國梅樹上是否存在國外已報道的其他病毒，如APV3、PNRSV、桃潛隱花葉類病毒（peach?latent?mosaic?viroid，?PLMVd）和啤酒花矮化類病毒（hop?stunt?viroid，?HSVd）等。

在已報道的侵染我國梅樹的病毒中，MuVA屬乙型線狀病毒科Betaflexiviridae發樣病毒屬Capillovirus，最早發現于日本梅樹［10］，新疆桃樹上也有發生［11］。目前僅有日本梅分離物pm14（NC040568）和新疆桃分離物pp（MN412555）的基因組序列，而我國梅分離物的基因組序列仍未被測定。PLPaV屬伴生豇豆病毒科Secoviridae蠶豆病毒屬Fabavirus，最早發現于我國桃樹［12］，韓國桃樹上也有發生［13］。PLPaV的基因組包含兩條RNA（RNA1和RNA2）。我國桃分離物XJ6（KY867750）和韓國桃分離物BC（MK460243）的基因組序列已完成測定。梅是PLPaV的新寄主［8］，但我國PLPaV梅分離物的基因組序列仍未被測定。

本研究對我國武漢、無錫、南京和北京梅樹進行了7種病毒和2種類病毒檢測，進一步豐富了侵染我國梅樹的病毒種類。此外，分別測定了MuVA?和PLPaV的梅分離物的基因組序列，為這兩種病毒的傳播及生態學研究提供了基礎數據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試供植物

從武漢、無錫、南京和北京的梅園中疑似感染病毒病的梅樹上采集64份葉片樣品，主要表現為葉片褪綠、花葉、脈明等癥狀［7，?9］。

1.1.2?主要試劑

PCR擴增所需的試劑購自北京全式金生物技術股份有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學有限公司;pMD18T和pTOPOBlunt載體購自北京冰達生物科技有限公司;SMARTer?RACE?5′/3′?試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2?方法

1.2.1?疑似感病梅樹樣品的RNA提取及RTPCR

取新鮮疑似感染病毒的葉片0.1?g，采用CTAB法提取總RNA［14］。利用RTPCR技術檢測7種侵染梅樹的病毒和2種類病毒，引物信息見表1。

逆轉錄反應（RT）：10?mmol/L?dNTPs?2?μL，5×MMLV緩沖液4?μL，MMLV?逆轉錄酶0.5?μL，RNA酶抑制劑?（50?U/μL）?0.5?μL，Oligo?（dT）1?μL，隨機引物（N6）1?μL，RNA模板2?μL，滅菌去離子水補足至20?μL，混勻、短暫離心后，42℃溫育60?min。

PCR：2×SanTaq?PCR混合液10?μL，10?μmol/L上、下游引物各1?μL，cDNA模板1?μL，滅菌去離子水補足至20?μL。反應程序為：95℃預變性3?min;95℃變性30?s，退火溫度下退火30?s，72℃延伸1?min，35個循環;72℃延伸10?min，12℃保存。

1.2.2?擴增產物的克隆及測序

使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段與pMD18T或pTOPOBlunt載體連接后轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞。通過PCR鑒定陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3?MuVA和PLPaV的基因組擴增

基于高通量測序從我國梅樹樣品中獲得這兩種病毒部分基因組序列［8］，以及已報道的基因組設計引物（表2），利用RTPCR擴增獲得除末端外的序列;利用RACE獲得末端序列（具體步驟參考SMARTer?RACE?5′/3′試劑盒說明書）。MuVA的3′末端無poly（A），擴增末端序列前，需在3′末端添加poly（A）。反應體系為：10×poly（A）聚合酶緩沖液5?μL，MnCl2?（1?mol/L）?5?μL，DTT?（100?mmol/L）?5?μL，0.1%?BSA?10?μL，ATP?（10?mmol/L）?0.5?μL，RNA?10?μmol/L，poly（A）聚合酶2.5?μL，無RNA酶水補至50?μL?；靹蚝?，37℃孵育30?min，反應結束后，通過乙醇沉淀的方法純化產物。

1.2.4?斑點雜交

通過體外轉錄［14］，合成地高辛標記的PLMVd負義鏈RNA，以此為探針檢測梅樹樣品中的PLMVd。將提取的RNA直接滴加至雜交膜上，待膜干燥后，通過紫外線照射，交聯固定RNA。然后進行雜交反應并采集圖像，具體操作參考文獻［14］。

2?結果與分析

2.1?梅樹病毒的RTPCR檢測

使用RTPCR對64份梅葉片樣品進行7種病毒和2種類病毒的檢測。除APV3和HSVd外，其余病毒均能檢測到。其中，APV2、PLPaV和PNRSV的檢出率較高，分別為39.1%、50.0%和37.5%;APV1、MuVA和PLMVd的檢出率較低，分別為7.8%、7.8%和4.7%;PBNSPaV的檢出率為17.2%（表3）。值得注意的是，南京、武漢、無錫的梅園中均檢出APV2、PLPaV、PNRSV和PBNSPaV，且檢出率較高。表明它們是這些地區梅樹上發生的主要病毒。另外，10%的樣品被2種及以上的病毒復合侵染。其中，武漢梅園的4個樣品被MuVA、PLPaV、APV1和APV2復合侵染。

2.2?PLMVd的檢出情況及序列分析

使用RTPCR從南京、北京和無錫的梅樣品中檢測到了PLMVd（圖1a）。這是首次從我國梅樹上檢出PLMVd。斑點雜交檢測進一步驗證了該結果（圖1b），說明我國梅樹上的確存在PLMVd。

通過克隆和測序，從無錫、北京和南京的樣品中各獲得1條PLMVd基因組序列（OL854072～OL854074），長度均為338?nt，相互之間的核苷酸序列相似性為97.06%。與已報道的序列相比較，無錫、北京和南京的序列分別與我國桃分離物PLMVdT041（MH974835）、PLMVdT052（MH974838）和PLMVdG（EF591868）最接近，序列相似性分別為99.41%、99.70%和96.13%。表明我國梅樹上的PLMVd與我國桃樹上的PLMVd具有較近的親緣關系。

2.3?PNRSV的檢出情況及序列分析

通過RTPCR從我國梅樹上檢測到了PNRSV。這是首次從我國梅樹上檢出PNRSV。為進一步驗證該結果，通過克隆和測序，從不同的梅葉片樣品中獲得了12條PNRSV外殼蛋白（CP）的基因序列，

它們之間的核苷酸序列相似性高達99.14%。與已報道的序列相比較，這12條序列與我國桃分離物Pcha（HQ833194）的核苷酸序列相似性最高，為99.56%～100%。表明我國梅樹上的PNRSV與我國桃樹上的PNRSV具有較近的親緣關系。

2.4?我國梅樹上MuVA分離物的基因組序列

獲得了我國梅樹上MuVA分離物（MuVABJ）的基因組序列。全長7?644?nt，包含兩個開放閱讀框（open?reading?frame，?ORF）（圖2），ORF1（147-7?148?nt）編碼多聚蛋白（polyprotein），含2?333個氨基酸，分子量約為265.4?kD;ORF2（5?465-6?856?nt）編碼移動蛋白（putative?movement?protein，MP），含463個氨基酸，分子量約為51.3?kD（圖2）?；蚪M結構與日本梅分離物MuVApm14（NC040568）［10］的一致。

將MuVABJ的基因組序列與日本梅分離物MuVApm14和我國新疆桃分離物MuVApp（MN412555）進行比較（表4），其與日本梅分離物

的核苷酸序列相似性高達98.56%，而與新疆桃分離物的核苷酸序列相似性僅為79.72%。ORF1和ORF2的核苷酸和氨基酸序列比較的結果與此相似。表明MuVA可能具有寄主特異性。

2.5?我國梅樹上PLPaV分離物的基因組序列

經克隆和測序，獲得了PLPaV武漢梅分離物（PLPaVJM3）的RNA1組分的序列，長度為6?085?nt，包含1個ORF（3-5?765?nt），編碼一個多聚蛋白，由1?920個氨基酸組成，分子量約為217.3?kD。將其與已報道的兩個分離物——我國桃分離物PLPaVXJ6（KY867750）和韓國桃分離物PLPaVBC（MK460243）的RNA1組分相比較，核苷酸序列相似性分別為86.62%和85.46%，氨基酸序列相似性分別為96.87%和96.08%。此外，還獲得了PLPaVJM3的RNA2的部分序列，長度為848?nt。其與我國桃分離物PLPaVXJ6和韓國桃分離物PLPaVBC的?RNA2組分的核苷酸序列相似性分別為96.00%和84.14%。

3?結論與討論

本研究通過RTPCR和斑點雜交檢測，不僅從我國梅樹上首次檢測到了PNRSV和PLMVd，而且分析了6種病毒（APV1、APV2、MuVA、PBNSPaV、PLPaV、PNRSV）和1種類病毒（PLMVd）在北京、武漢、南京和無錫梅園的檢出情況，發現APV2、PLPaV、PNRSV和PBNSPaV在武漢、南京和無錫梅園中有發生，且檢出率較高，應該是這些地區梅樹上的主要病毒。此外，首次測定了我國梅樹上的PLMVd、MuVA和PLPaV的基因組序列。這些結果不僅進一步明確了我國梅樹上病毒的分布情況，而且為親緣關系相近的核果類果樹病毒的遺傳及生態學研究提供了數據。

目前，已報道的侵染梅樹的病毒有16種［2，89，1517］。此前，已經從我國梅樹上檢測到8種病毒（APV1、APV2、ASGV、CVA、MuVA、PBNSPaV、PLPaV和PPV）［79］，本研究中又檢測到PLMVd和PNRSV。由此可知我國梅樹上至少存在9種病毒和1種類病毒。我國梅樹上是否存在國外已報道的其余6種病毒及類病毒——蘋果褪綠葉斑病毒（apple?chlorotic?leaf?spot?virus，?ACLSV）、桃花葉病毒（peach?mosaic?virus，?PcMV）［2］、油桃莖痘伴隨病毒（nectarine?stem?pitting?associated?virus，NSPaV）、杏脈明伴隨病毒（apricot?vein?clearing?associated?virus，?AVCaV）［18］、APV3［3］和HSVd［16］，仍有待檢測和驗證。

本研究發現APV2、PLPaV和PNRSV的檢出率高于30%，且在武漢、無錫和南京的梅園中均有發生。此前的調查發現ASGV的檢出率也高于30%，且在武漢、無錫、上海和南京的梅園均有發生［9］;PPV的檢出率更高且分布更廣泛［7］。綜上，我國梅樹上的主要病毒有APV2、ASGV、PLPaV、PNRSV和PPV。

在侵染我國梅樹的主要病毒中，ASGV是侵染我國蘋果的主要病毒之一［19］，PLPaV和PNRSV是侵染我國桃樹的主要病毒［20］。推測梅樹可能是這些病毒在我國核果類果樹中傳播和擴散的重要寄主。此外，本研究首次從我國梅樹上檢測到了PLMVd，其也是我國桃樹上的主要類病毒［20］，而且梅樹分離物與我國桃樹分離物的親緣關系最近。表明PLMVd在我國梅樹和桃樹間可能存在交互侵染。因此，防控這些病毒或類病毒不能忽略梅樹病毒的研究。

雖然本研究檢測的梅樹樣品大多來自花梅，但仍有部分樣品來自果梅，而且從中檢測到了不同的病毒。因為病毒侵染會危害果梅的生產［6，?21］，不僅會引起葉斑、壞死等癥狀，還會降低產量。即使目前國內尚未有果梅上的病毒病危害的報道，仍需加強病毒的檢測和監測。

參考文獻

［1］?褚孟嫄.?中國果樹志梅卷［M］.?北京：?中國林業出版社，?1999.

［2］?RUBIO?M，?MARTINEZGOMEZ?P，?MARAIS?A，?et?al.?Recent?advances?and?prospects?in?Prunus?virology?［J］.?Annals?of?Applied?Biology，?2017，?171（2）：?125138.

［3］?MARAIS?A，?SVANELLADUMAS?L，?FOISSAC?X，?et?al.?Asian?prunus?viruses：?New?related?members?of?the?family?Flexiviridae?in?Prunus?germplasm?of?Asian?origin?［J］.?Virus?Research，?2006，?120（1/2）：?176183.

［4］?RODAMILANS?B，?VALLI?A，?GARCIA?J?A.?Molecular?plantplum?pox?virus?interactions?［J］.?Molecular?PlantMicrobe?Interactions，?2020，?33（1）：?617.

［5］?NAKAUNE?R，?TAKEDA?T，?NUMAGUCHI?K，?et?al.?Ampeloviruses?associated?with?incomplete?flower?syndrome?and?leafedge?necrosis?in?Japanese?apricot?［J］.?Journal?of?General?Plant?Pathology，?2018，?84（3）：?202207.

［6］?KURIHARA?J，?TOMARU?K，?OTSUBO?T，?et?al.?A?new?disease?of?Prunus?mume?（Japanese?apricot）?caused?by?multiple?infection?with?cucumber?mosaic?cucumovirus?and?prunus?necrotic?ringspot?related?ilarvirus?［J］.?Acta?Horticulturae，?1998，?472：?183193.

［7］?ZHOU?Ju，?XING?Fei，?WANG?Hongqing，?et?al.?Occurrence，?distribution，?and?genomic?characteristics?of?plum?pox?virus?isolates?from?common?apricot?（Prunus?armeniaca）?and?Japanese?apricot?（Prunus?mume）?in?China?［J］.?Plant?Disease，?2021，?105（11）：?34743480.

［8］?ZHANG?Yuhong，?ZHOU?Jun，?ZHAN?Binhui，?et?al.?First?report?of?peach?leaf?pittingassociated?virus，?plum?bark?necrosis?stem?pittingassociated?virus，?and?mume?virus?A?from?mei?（Prunus?mume）?in?China?［J］.?Plant?Disease，?2021，?105（8）：?2259.

［9］?王程安，?周俊，?陳夢婷，?等.?我國部分地區梅樹病毒病的病原初步檢測［J］.?植物保護，?2018，?44（2）：?170176.

［10］MARAIS?A，?FAURE?C，?THEIL?S，?et?al.?Molecular?characterization?of?a?novel?species?of?Capillovirus?from?Japanese?apricot?（Prunus?mume）?［J/OL］.?Viruses，?2018，?10（4）：?144.?DOI：?10.3390/v10040144.

［11］ZHENG?Yinying，?BU?Fangdi，?WU?Caijie，?et?al.?First?report?of?mume?virus?A?infection?of?Prunus?persica?in?China?［J］.?Plant?Disease，?2020，?104（10）：?2741.

［12］HE?Yan，?CAI?Li，?ZHOU?Lingling，?et?al.?Deep?sequencing?reveals?the?first?Fabavirus?infecting?peach?［J/OL］.?Scientific?Reports，?2017，?7（1）：?11329.?DOI：?10.1038/s41598017117437.

［13］JO?Y，?CHOI?H，?BACK?C?K，?et?al.?First?report?of?peach?leaf?pittingassociated?virus?in?peach?trees?exhibiting?calico?in?Korea?［J］.?Plant?Disease，?2019，?103（11）：?29712972.

［14］張志想，?葛蓓孛，?潘嵩，?等.?菊花矮化類病毒的分子檢測與序列分析［J］.?園藝學報，?2011，?38（12）：?23492356.

［15］CANDRESSE?T，?FAURE?C，?THEIL?S，?et?al.?First?report?of?nectarine?stem?pittingassociated?virus?infecting?Prunus?mume?in?Japan?［J］.?Plant?Disease，?2017，?101（2）：?393.

［16］JO?Y，?LIAN?S，?CHO?J K，?et?al.?First?report?of?hop?stunt?viroid?in?Japanese?apricot?（Prunus?mume）?in?Korea?［J］.?Plant?Disease，?2017，?101（7）：?1332.

［17］OSAKI?H，?YAMAGUCHI?M，?SATO?Y，?et?al.?Peach?latent?mosaic?viroid?isolated?from?stone?fruits?in?Japan?［J］.?Annals?of?the?Phytopathological?Society?of?Japan，?1999，?65（1）：?38.

［18］AL?RWAHNIH?M，?SOLTANI?N，?SOLTERO?B?R，?et?al.?First?report?of?apricot?vein?clearingassociated?virus?infecting?flowering?apricot?（Prunus?mume）?in?the?United?States?［J］.?Plant?Disease，?2021，?105（9）：?2739.

［19］郝璐，?葉婷，?陳善義，?等.?我國北方部分蘋果主產區病毒病的發生與檢測［J］.?植物保護，?2015，?41（2）：?158161.

［20］周俊.?桃及其野生近緣種中病毒組研究［D］.?北京：?中國農業科學院，?2020.

［21］NUMAGUCHI?K，?TAKEDA?T，?TSUCHIDA?Y，?et?al.?Largescale?field?survey?reveals?overall?yield?loss?in?Japanese?apricot?possibly?caused?by?two?ampeloviruses?［J］.?Journal?of?General?Plant?Pathology，?2019，?85（2）：?116121.

（責任編輯：楊明麗）