對銅綠麗金龜具有高致病力的昆蟲病原線蟲的篩選

白勇章 王文杰 王志敏 李朔涵 李克斌 曹雅忠 王森山 宋麗雯 尹姣

摘要

為篩選對銅綠麗金龜Anomala?corpulenta幼蟲具有生防潛力的昆蟲病原線蟲品系，測定了9個昆蟲病原線蟲品系對銅綠麗金龜1?齡幼蟲的致病力，以及不同施用劑量、環境溫度及土壤相對濕度條件對線蟲致病力的影響。生測結果表明，櫻桃異小桿線蟲品系Heterorhabditis?beicherriana?D266對銅綠麗金龜幼蟲致病力最高，處理11?d后的校正死亡率達到了98.3%;對線蟲D266致病力的單因子測定發現，侵染銅綠麗金龜幼蟲的最佳劑量為150?IJs/頭、最佳溫度范圍為20～30℃、最佳土壤濕度為18%，有較好的開發應用潛力。

關鍵詞

銅綠麗金龜;?昆蟲病原線蟲;?Heterorhabditis?beicherriana;?致病力

中圖分類號：

S?476

文獻標識碼：?B

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022805

Screening?of?entomopathogenic?nematodes?with?high?virulence?to?Anomala?corpulenta

BAI?Yongzhang1，2#，?WANG?Wenjie2#，?WANG?Zhimin2，?LI?Suohan2，?LI?Kebin2，?CAO?Yazhong2，WANG?Senshan1，?SONG?Liwen1*，?YIN?Jiao2*

（1.?College?of?Plant?Protection，?Gansu?Agricultural?University，?Lanzhou?730070，?China;?2.?State?Key?Laboratory?

for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，Institute?of?Plant?Protection，?Chinese?Academy?of?Agricultural?

Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

In?order?to?screen?the?strains?of?entomopathogenic?nematodes?that?have?effective?biocontrol?potential?against?Anomala?corpulenta?larvae，?the?virulence?of?nine?entomopathogenic?nematodes?strains?against?the?1st?instar?of?A.corpulenta?was?determined?and?the?effects?of?nematodes?under?different?infection?doses，?ambient?temperature?and?soil?humidity?were?measured.?The?results?showed?that?Heterorhabditis?beicherriana?D266?had?the?highest?virulence?against?the?A.corpulenta，?and?the?corrected?mortality?reached?98.3%?on?the?11th?day?after?infection.?The?single?factor?determination?of?the?virulence?of?nematode?D266?showed?that?the?best?optimal?dose，?temperature?and?soil?humidity?of?infecting?A.corpulenta?larvae?were?150?IJs/individual，?20-30℃?and?18%，?respectively.?H.beicherriana?D266?has?a?good?potential?for?beetle?pests?controlling.

Key?words

Anomala?corpulenta;?entomopathogenic?nematode;?Heterorhabditis?beicherriana;?virulence

銅綠麗金龜Anomala?corpulenta?Motschulsky屬鞘翅目Coleoptera，麗金龜科Rutelidae，其幼蟲俗稱蠐螬，寄主范圍廣，為害隱蔽，且為害時間長，是我國地下害蟲的優勢種群之一［15］。銅綠麗金龜成蟲以多種果樹、林木、麻類和農作物的葉片為食;幼蟲主要為害植物的地下根莖及莢果，嚴重時導致植物枯萎死亡［6］。近年來，由于高毒農藥的禁用、害蟲抗藥性的產生及耕作制度的變化，導致蠐螬為害程度加重［711］。因此，生產中迫切需要對蠐螬的高效、綠色防控技術［1214］。

昆蟲病原線蟲（entomopathogenic?nematodes，EPN）具有主動搜索寄主、殺蟲范圍廣、殺蟲能力強、對人畜和環境安全以及規?；a相對簡單等優點，是一種新型的高效生物殺蟲劑，尤其適用于地下害蟲，在蠐螬生物防治研究中備受關注［1516］。目前國內外對昆蟲病原線蟲防控地下害蟲開展了大量的研究工作，如用Steinernema?longicaudum?X7?和Heterorhabditis?bacteriophora?H06兩種線蟲防治花生地蠐螬，防治田花生可增產70%［17］。H.bacteriophora滄州品系對暗黑鰓金龜Holotrichia?parallela幼蟲的致病力達到93.3%［18］。盡管昆蟲病原線蟲防治蠐螬成效顯著，但其防治效果受線蟲種類、施用劑量、環境溫度和土壤濕度等因素影響［19］。因此，充分了解昆蟲病原線蟲的生物學特性，是蠐螬防治成功的重要條件。

本研究通過室內生物測定9種（品系）昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力，篩選出對銅綠麗金龜幼蟲具有高致病力的昆蟲病原線蟲品系，并確定該線蟲在不同條件下的致病力，以期為銅綠麗金龜的生物防治提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試線蟲與昆蟲

供試昆蟲病原線蟲：櫻桃異小桿線蟲Heterorhabditis?beicherriana（簡寫為H2，下同）、H.beicherriana?D266品系（D266）、H.beicherriana?LF品系（LF）、印度異小桿線蟲H.indica（H1）、擬雙角斯氏線蟲Steinernema?ceratophorum（XH4）、斯氏線蟲Steinernema?sp.?YNb33?D715（D715）、蕪菁夜蛾斯氏線蟲S.feltiae?SFSN?（SFSN）、小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsae?ALL（ScALL）和長尾斯氏線蟲S.longicaudum（S2）共9種（品系）昆蟲病原線蟲，其中H.beicherriana（H2）、H.indica（H1）、S.longicaudum（S2）由南開大學提供，其他均由中國農業科學院植物保護研究所地下害蟲實驗室提供。試驗所用昆蟲病原線蟲均為大蠟螟Galleria?mellonella活體擴繁而獲得的最新侵染期線蟲（infective?juveniles，IJs）。

供試昆蟲：2021年從河北廊坊田間采集銅綠麗金龜成蟲，在塑料養蟲箱（70?cm×50?cm×50?cm）中集中飼養，每箱200頭，土壤厚30?cm左右，相對濕度18%～20%、溫度（25±1）℃、飼喂新鮮榆樹葉片，待其產卵后，每隔3?d分批將待孵化卵挑出，放在相對濕度18%～20%土中孵化，幼蟲飼喂萌芽的小麥種子和玉米種子，待幼蟲長到10～12?日齡（1齡）后備用。

1.2?不同昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜幼蟲致病力的測定

選取10～12日齡銅綠麗金龜幼蟲為供試昆蟲，測定不同昆蟲病原線蟲對其的致病力。在六孔板各孔內放入1粒萌發的玉米種子，每孔接入10～12日齡健康、個體均勻的幼蟲1頭，覆蓋相對濕度約18%～20%的無菌土（過40目篩，20?g）;將線蟲濃度配制成1?000?IJs/mL，每孔加入200?μL線蟲懸浮液，蓋上蓋子;每個處理30頭供試昆蟲，在品系篩選試驗中，以LF作為陽性對照，劑量為200?IJs/頭，以滴加200?μL無菌水作為陰性對照，將各處理置于同一人工氣候箱中，溫度為（25±1）℃、相對濕度為70%～80%。處理后3、5、7、9?d和11?d分別統計幼蟲死亡數并計算校正死亡率，試驗設3次重復。

1.3?劑量對D266侵染銅綠麗金龜幼蟲能力的影響

將線蟲D266配制成250、375、500、625、750?IJs/mL?和1?000?IJs/mL?6個濃度，每孔加入200?μL線蟲懸浮液，即6個處理的線蟲劑量分別為50、75、100、125、150?IJs/頭和200?IJs/頭，同時以滴加200?μL無菌水作為對照。其他試驗條件、觀察記錄方法同1.2。

1.4?溫度對D266侵染銅綠麗金龜幼蟲能力的影響

D266線蟲劑量150?IJs/頭，在10、15、20、25、30℃和35℃共6個不同溫度條件下處理銅綠麗金龜幼蟲，同時以滴加相同劑量無菌水作為對照，將各處理置于相應溫度人工氣候箱中。其他試驗條件、觀察記錄方法同1.2。

1.5?土壤濕度對D266侵染銅綠麗金龜幼蟲能力的影響

D266線蟲劑量為150?IJs/頭，用無菌水和200?μL線蟲（750?IJs/mL）配制3%、8%、13%、18%和23%?5個土壤濕度梯度;六孔板用保鮮膜覆蓋后，再用鑷子扎1個小孔以保證一定的空氣流通，同時以滴加相同劑量無菌水作為對照，將各處理置于相應濕度人工氣候箱中。其他試驗條件、觀察記錄方法同1.2。

1.6?數據統計分析

試驗中昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力均用校正死亡率表示。先對百分數進行反正弦轉換，然后對不同處理進行單因素方差分析（Oneway?ANOVA），用Duncan氏新復極差法進行顯著性分析。數據分析均在Excel?2010?與SPSS?19.0?統計分析軟件上完成。

校正死亡率＝（處理組死亡率－對照組死亡率）/（1－對照組死亡率）×100%。

2?結果與分析

2.1?不同昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力

不同昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力結果如表1。隨著線蟲處理時間的增加，幼蟲校正死亡率逐漸增大，其中D266品系處理銅綠麗金龜幼蟲11?d后的校正死亡率達到最高（98.3%）;且不同昆蟲病原線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力差異較大，在侵染后的前7?d，D266、H2和LF等3個品系間的校正死亡率無顯著差異，而顯著高于其他線蟲品系;侵染后的9～11?d，D266與H2的校正死亡率產生了顯著差異，但與LF的校正死亡率差異不顯著，其中D266處理銅綠麗金龜幼蟲的校正死亡率最高（98.3%），XH4處理幼蟲的校正死亡率最低（33.9%），顯著低于其他線蟲處理。因此，后續試驗線蟲品系均選用D266。

2.2?不同施用劑量的D266對銅綠麗金龜幼蟲的致病力

在相同的溫度和土壤濕度條件下，不同施用劑量的D266對銅綠麗金龜幼蟲的致病力結果如表2。相同處理時間下，隨著線蟲劑量的增加，幼蟲校正死亡率呈上升趨勢。150、200?IJs/頭劑量處理銅綠麗金龜幼蟲11?d后的校正死亡率均達到95%以上，在整個觀察期間，相同處理時間下，150、200?IJs/頭劑量處理銅綠麗金龜幼蟲校正死亡率顯著高于其他劑量處理，但兩者之間無顯著差異;處理11?d后，50?IJs/頭劑量處理銅綠麗金龜幼蟲校正死亡率最低（56.7%），而顯著低于除75?IJs/頭劑量（65.0%）外的其他劑量處理。因此，后續試驗均采用最適的線蟲劑量?150?IJs/頭侵染幼蟲。

2.3?D266在不同溫度下對銅綠麗金龜幼蟲的致病力

研究結果（表3）表明，當溫度為10℃和35℃時，線蟲處理11?d后的校正死亡率分別為36.7%和41.2%，顯著低于其他溫度處理;當溫度為20～30℃時，線蟲處理11?d后校正死亡率可達80%以上，其中，25℃時校正死亡率顯著高于其他溫度處理，但與20℃無顯著差異，同時20℃和30℃時校正死亡率也無顯著差異。由此可知，溫度會顯著影響昆蟲病原線蟲的致病力，昆蟲病原線蟲D266侵染銅綠麗金龜幼蟲的適宜溫度范圍為20～30℃。

2.4?D266在不同土壤濕度下對銅綠麗金龜幼蟲的致病力

表4結果表明，當土壤濕度為18%時，線蟲處理3、5、7、9、11?d后幼蟲校正死亡率均顯著高于其他處理;土壤濕度為3%時，處理11?d后校正死亡率僅為32.1%，顯著低于其他處理，土壤濕度為13%時校正死亡率為78.4%，僅顯著低于18%的土壤濕度處理。8%與23%的土壤濕度處理3～11?d后，

無顯著差異。綜上所述，土壤濕度過低或過高均會顯著影響該線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力，D266侵染銅綠麗金龜幼蟲的最佳土壤濕度為18%。

3?結論與討論

本研究結果表明，供試的9種昆蟲病原線蟲品系對銅綠麗金龜幼蟲的致病力存在著差異性，其中櫻桃異小桿線蟲D266、LF和H2對銅綠麗金龜幼蟲的致病力較高，其校正死亡率分別為98.3%、94.7%和84.7%。李根等［20］測定了5種不同昆蟲病原線蟲對小地老虎Agrotis?ipsilon?3齡幼蟲的致病力，篩選出小卷蛾斯氏線蟲ScAll對小地老虎的致病力最強，處理72?h后校正死亡率達到86.7%;梁銘榮等［21］測定小卷蛾斯氏線蟲ScAll和蕪菁夜蛾斯氏線蟲SFSN處理草地貪夜蛾2齡幼蟲36?h后死亡率分別為92%和88%;李而濤等［2223］室內生測櫻桃異小桿線蟲LF處理華北大黑鰓金龜Holotrichia?oblita?1齡幼蟲7?d后校正死亡率達100%，處理暗黑鰓金龜H.parallela?1齡幼蟲9?d后校正死亡率達100%;櫻桃異小桿線蟲D266處理暗黑鰓金龜幼蟲11?d后校正死亡率達100%［24］。由此可見，不同昆蟲病原線蟲品系對不同昆蟲的致病力不同，篩選出致病力強的昆蟲病原線蟲品系是防治害蟲的關鍵。

不同劑量櫻桃異小桿線蟲D266對銅綠麗金龜幼蟲的致病力結果說明，在相同的處理時間下，幼蟲校正死亡率隨線蟲施用劑量的增加而升高，200?IJs/頭施用劑量與50?IJs/頭施用劑量對幼蟲校正死亡率相差一倍。楊淋凱等［25］的研究表明，在蕪菁夜蛾斯氏線蟲Steinernema?feltiae?0663PG和草地貪夜蛾Spodoptera?frugiperda幼蟲數量比為160∶1時，對草地貪夜蛾幼蟲的致死率達到100%。小卷蛾斯氏線蟲和嗜菌異小桿線蟲Heterorhabditis?bacteriophora?在4?000?IJs/mL劑量下對云斑天牛Batocera?lineolata幼蟲的校正防效分別達93.8%和82.4%［26］。因此，在生產應用中，選擇最佳的線蟲施用劑量不僅能得到理想的控制效果，而且可以降低防治成本［2728］。

環境溫、濕度也是影響昆蟲病原線蟲侵染寄主能力的重要因素［2930］。昆蟲病原線蟲適宜的侵染溫度是25℃左右［3136］，這與本研究結果櫻桃異小桿線蟲D266侵染銅綠麗金龜幼蟲的適宜溫度范圍為20～30℃一致。濕度過低或過高均會顯著影響線蟲對銅綠麗金龜幼蟲的致病力，如11%～20%的土壤濕度為嗜菌異小桿線蟲滄州品系的適宜侵染濕度［37］，本研究中昆蟲病原線蟲D266侵染銅綠麗金龜幼蟲的最佳土壤濕度為18%。

本研究從9種昆蟲病原線蟲品系中初步篩選得出櫻桃異小桿線蟲D266線蟲品系對銅綠麗金龜1齡（10～12日齡）幼蟲最佳施用劑量為150?IJs/頭，最佳侵染溫度范圍為20～30℃，最佳土壤濕度為18%。該研究結果可為后續利用櫻桃異小桿線蟲生防制劑防治銅綠麗金龜提供理論參考依據。

參考文獻

［1］?郭予元，?吳孔明，?陳萬權.?中國農作物病蟲害：中冊［M］.?3版.?北京：?中國農業出版社，?2015：?14991501.

［2］?魏鴻鈞，?張治良，?王蔭長.?中國地下害蟲［M］.?上海：?上?？茖W技術出版社，?1989：?98104.

［3］?趙瑩，?成巨龍，?袁治理，?等.?陜西煙田地下害蟲種類初步調查［J］.?中國煙草科學，?2014，?35（3）：?4145.

［4］?劉福順，?馮曉潔，?劉春琴，?等.?河北滄州花生田蠐螬發生動態及影響因素分析［J］.?中國植保導刊，?2022，?42（4）：?3337.

［5］?宮慶濤，?武海斌，?姜莉莉，?等.?銅綠麗金龜生物學特性及防控技術［J］.?落葉果樹，?2019，?51（2）：?3739.

［6］?周文智.?銅綠麗金龜發生規律及防治效果試驗研究［J］.?現代農村科技，?2018?（7）：?7172.

［7］?羅宗秀，?李克斌，?曹雅忠，?等.?河南部分地區花生田地下害蟲發生情況調查［J］.?植物保護，?2009，?35（2）：?104108.

［8］?聶紅民，?李國生.?花生田蠐螬發生原因及防治措施［J］.?農業科技通訊，?2005（6）：?18.

［9］?王丙麗，?王洪亮.?花生田蠐螬的成災原因及綜合治理［J］.?河南農業科學，?2006（7）：?6668.

［10］劉愛芝，?李素娟，?武予清，?等.?河南省蠐螬爆發原因淺談及防治對策［J］.?河南農業科學，?2001（4）：?1920.

［11］李耀發，?黨志紅，?安靜杰，?等.?河北省主要作物田地下害蟲種類及其分布［J］.?中國農學通報，?2018，?34（28）：?114119.

［12］雷雪萍.?我國地下害蟲綠色防控技術研究進展［J］.?現代農業科技，?2022（24）：?9194.

［13］張美翠，?尹姣，?李克斌，?等.?地下害蟲蠐螬的發生與防治研究進展［J］.?中國植保導刊，?2014，?34（10）：?2028.

［14］顏珣，?郭文秀，?趙國玉，?等.?昆蟲病原線蟲防治地下害蟲的研究進展［J］.?環境昆蟲學報，?2014，?36（6）：?10181024.

［15］李而濤，?李建一，?李曉峰，?等.?昆蟲病原線蟲防治蠐螬增效措施概述［C］∥陳萬權.?綠色植保與鄉村振興.?北京：中國農業科學技術出版社，?2018：?199206.

［16］JAVED?S，?KHANUM?T?A，?ALI?A.?Storage?and?efficacy?of?entomopathogenic?nematode?species?as?a?biocontrol?agent?against?the?armyworm，?Spodoptera?litura?（Fabricius）?（Lepidoptera：?Noctuidae）?［J］.?Egyptian?Journal?of?Biological?Pest?Control，?2022，?106（3）：?11121117.

［17］GUO?Wenxiu，?ZHAO?Guoyu，?WANG?Congli，?et?al.?Efficacy?of?entomopathogenic?nematodes?for?the?control?of?white?grub，?Anomala?corpulenta?Motschulsky，?in?laboratory?and?field?［J］.?Nematology，?2020，?106（3）：?11121117.

［18］劉樹森，?李克斌，?劉春琴，?等.?河北異小桿線蟲一品系的分類鑒定及其對蠐螬致病力的測定［J］.?昆蟲學報，?2009，?52（9）：?959966.

［19］武海斌，?劉海峰，?宮慶濤，等.?昆蟲病原線蟲防治地下害蟲的應用及影響因子［J］.?落葉果樹，?2015，?47（5）：?2427.

［20］李根，?許文君，?王新中，?等.?不同品系昆蟲病原線蟲對煙草小地老虎的致病力［J］.?環境昆蟲學報，?2017，?39（5）：?10251031.

［21］梁銘榮，?李子園，?戴釬萱，?等.?4種昆蟲病原線蟲對草地貪夜蛾的致死作用［J］.?生物安全學報，?2020，?29（2）：?8289.

［22］李而濤，?曹雅忠，?張帥，?等.?昆蟲病原線蟲Heterorhabditis?beicherriana?LF品系與Bt?HBF18菌株混用對華北大黑鰓金龜幼蟲的防治效果［J］.?昆蟲學報，?2019，?62（5）：?602614.

［23］LI?Ertao，?ZHANG?Shuai，?LI?Kebin，?et?al.?Efficacy?of?entomopathogenic?nematode?and?Bacillus?thuringiensis?combinations?against?Holotrichia?parallela?（Coleoptera：?Scarabaeidae）?larvae?［J/OL］.?Biological?Control，?2021，?152.?DOI：?10.1016/j.biocontrol.2020.104469.

［24］張彩鈴，?王志敏，?王思雨，?等.?昆蟲病原線蟲對暗黑鰓金龜的致病力［J/OL］.?中國生物防治學報：?110.?［20221221］.?DOI：?10.16409/j.cnki.2095039x.2022.03.025.

［25］楊淋凱，?朱小芳，?錢秀娟，?等.?甘肅省5種昆蟲病原線蟲對草地貪夜蛾的致病力測定［J］.?草業科學，?2021，?38（10）：?20692076.

［26］陳賢群，?劉奇志，?曹景富，?等.?兩種昆蟲病原線蟲防治核桃云斑天牛田間效果評價［J］.?中國生物防治學報，?2016，?32（4）：?456461.

［27］劉樹森.?昆蟲病原線蟲的篩選鑒定及其對蠐螬的致病性研究［D］.?北京：?中國農業科學院，?2009.

［28］武海斌，?范昆，?辛力，?等.?昆蟲病原線蟲對小地老虎的致病力測定及防治效果［J］.?植物保護學報，?2015，?42（2）：?244250.

［29］孫瑞紅，?李愛華，?韓日疇，?等.?昆蟲病原線蟲Heterorhabditis?indica?LN2品系防治韭菜遲眼蕈蚊的影響因素研究［J］.?昆蟲天敵，?2004，?26（4）：?150155.