HPLC法測定骨傷跌打康復凝膠貼膏劑中7種成分含量

吳謀，莫楚銘，蓬展鵬，劉淑芳，陳繼英

（1.東莞市中醫院，廣東 東莞 523000；2.東莞市中藥制劑重點實驗室，廣東 東莞 523000）

外用中藥制劑在骨科診療過程中起著重要的作用，特別是治療急性軟組織損傷獨具特色，臨床療效滿意，常用的劑型有敷貼藥、涂擦藥、熱熨藥及熏洗濕敷藥等[1]。近年來，凝膠貼膏劑因具有不容易過敏、容易貼敷、不污染衣服等獨特優勢，備受患者歡迎。

骨傷跌打康復凝膠貼膏劑是我院根據臨床需求研發的新制劑，處方由牛膝、大黃、黃柏、骨碎補等27味中藥組成，以逐瘀通經、補肝腎、強筋骨的牛膝和同樣具有逐瘀通經并可以涼血解毒的大黃為君藥；補血活血的當歸尾，清熱解毒療瘡的黃柏，破血行氣的三棱莪術，活血散瘀、定痛的乳香，和消腫生肌的沒藥為臣藥；行氣利濕、舒筋活絡的五指毛桃、絡石藤、雞骨香、骨碎補等為佐使藥，增強君臣藥的消腫止痛、通絡之功。具有活血散瘀、消腫止痛功效，用于跌打扭傷、筋骨損傷、積瘀腫痛等軟組織損傷癥。由于處方藥味比較復雜，對于制劑質量控制要求更高，本文建立了骨傷跌打康復凝膠貼膏劑中7種主要成分質量分數的HPLC測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；二極管陣列檢測器（美國安捷倫科技公司）；色譜柱為Agilent ZORBA×SB-C18StableBond Analytical 柱（4.6 mm ×250 mm，5μm）；AUW120D電子分析天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）；PL-S30T 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

骨傷跌打康復凝膠貼膏劑（東莞市中醫院制劑中心提供，批號分別為20230516、20230517、20230518、20230525、20230526、20230527、20230528、20230605、20230606、20230607）；原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素、大黃酚（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110809-201205、110885-201703、110773-201313、110713-201212、110721-201618、110756-201512、110796-201520）；乙腈、甲酸均為色譜純（德國Merck公司）；甲醇為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取骨傷跌打康復凝膠貼膏，除去背襯及薄膜，精密稱取凝膠膏劑20 g，加入甲醇40 mL，超聲提取30 min，放至室溫，稱定質量，用甲醇補足減失質量，濾液離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，置水浴鍋中蒸干，用色譜甲醇充分溶解，定容至10 mL，搖勻，備用，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素、大黃酚適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇制備成質量濃度為0.172、0.142、0.120、0.168、0.130、0.102、0.154 mg/mL 的混合對照品儲備溶液。精密吸取適量混合對照品儲備液，加甲醇定容至一定量程的容量瓶中，逐級稀釋至不同質量濃度的混合對照品溶液，各成分質量濃度如下：原兒茶酸為172.0、68.8、51.6、34.4、17.2、8.6、3.44 μg/mL，咖啡酸為142.0、56.8、42.6、28.4、14.2、7.1、2.84 μg/mL，阿魏酸為120.0、48.0、36.0、24.0、12.0、6.0、2.4 μg/mL，鹽酸小檗堿為168.0、67.2、50.4、33.6、16.8、8.4、3.36 μg/mL，大黃酸為130.0、52.0、39.0、26.0、13.0、6.5、2.6 μg/mL，大黃素為102.0、40.8、30.6、20.4、10.2、5.1、2.04 μg/mL，大黃酚為154.0、61.6、46.2、30.8、15.4、7.7、3.08 μg/mL。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBA×SB-C18StableBond Analytical（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；流速：1 mL/min；梯度洗脫（0～13 min，5%A～10%A；13%～15 min，10%A～12%A；15～30 min，12%A；30～32 min，12%A～15%A；32～33 min，15%A～20%A）；柱溫：35 ℃；檢測波長：290 nm；進樣量：10 μL。

2.4 方法學考察[2?10]

2.4.1 專屬性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液、大黃陰性對照溶液（按處方取缺大黃的各味藥材，按處方工藝制備大黃陰性樣品，再按“2.1”項方法制備大黃陰性對照溶液）及黃柏陰性對照溶液（按處方取缺黃柏的各味藥材，按處方工藝制備黃柏陰性樣品，再按“2.1”項方法制備黃柏陰性對照溶液），分別按“2.3”項色譜條件進樣，結果顯示供試品溶液色譜圖中相應位置上出現混合對照品色譜圖上的原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素和大黃酚7 個成分峰；大黃陰性色譜圖中，未檢出大黃酸、大黃素、大黃酚；黃柏陰性色譜圖中，未檢出鹽酸小檗堿。表明方法專屬性良好，見圖1－3。

圖1 混合對照品（A）和供試品溶液（B）色譜圖Figure 1 Chromatograms of mixed reference solution（A）and test solution（B）

圖2 大黃陰性對照色譜圖Figure 2 Negative control chromatogram of Radix et Rhizoma Rhei

圖3 黃柏陰性色譜圖Figure 3 Negative chromatogram of Cortex Phellodendri Chinensis

2.4.2 最低檢測限（LOD）和定量限（LOQ） 取混合對照品溶液，依次稀釋制成一系列梯度濃度的溶液，按“2.3”項色譜條件分別進樣，取峰面積信噪比為1∶3左右，計算最低檢測限濃度（LOD），取峰面積信噪比為1∶10 左右的濃度為最低定量限濃度（LOQ）。結果見表1。

表1 骨傷跌打康復凝膠貼膏劑中7 種主要成分的LOD和LOQTable 1 LOD and LOQ of seven main components of Gushang Dieda Kangfu Cataplasm

2.4.3 線性關系考察 將各質量濃度的混合對照品按“2.3”項色譜條件依次進樣分析，以質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，得到7種成分的回歸方程及線性范圍，見表2?？梢?，在設定的質量濃度范圍內，7種成分的標準曲線線性關系良好，r＞0.999 0。

2.4.4 精密度試驗 取同一份按“2.1”項下方法制備的供試品溶液（批號：20230516），按“2.3”項下色譜條件進樣6 次，測得各成分峰面積RSD 分別為原兒茶酸1.26%、咖啡酸0.37%、阿魏酸0.75%、鹽酸小檗堿0.88%、大黃酸2.54%、大黃素0.57%、大黃酚3.33%，各成分峰面積RSD 均小于5%；測得各成分保留時間RSD 分別為原兒茶酸0.58%、咖啡酸0.51%、阿魏酸0.17%、鹽酸小檗堿0.04%、大黃酸0.04%、大黃素0.04%、大黃酚0.04%，各成分保留時間RSD均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩定性試驗 同一供試品溶液（批號：20230516）于制備后0、2、4、8、10、12 h，按“2.3”項下色譜條件進樣，測得各成分峰面積RSD 分別為原兒茶酸2.78%、咖啡酸2.02%、阿魏酸0.04%、鹽酸小檗堿1.92%、大黃酸0.53%、大黃素0.41%、大黃酚3.21%，各成分RSD 均小于3.5%；測得各成分保留時間RSD 分別為原兒茶酸1.50%、咖啡酸0.77%、阿魏酸0.13%、鹽酸小檗堿0.29%、大黃酸0.16%、大黃素0.15%、大黃酚0.13%，各成分保留時間RSD 均小于2%，表明12 h內供試品溶液穩定性良好。

2.4.6 重復性試驗 取6 份同一批號（20230516）的凝膠膏劑，按方法“2.1”項下方法制備成供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，測得各成分峰面積RSD 分別為原兒茶酸6.11%、咖啡酸6.35%、阿魏酸5.27%、鹽酸小檗堿7.17%、大黃酸5.44%、大黃素5.85%、大黃酚7.91%，各成分RSD 均小于10%；測得各成分保留時間RSD 分別為原兒茶酸0.36%、咖啡酸0.31%、阿魏酸0.10%、鹽酸小檗堿0.147%、大黃酸0.02%、大黃素0.02%、大黃酚0.01%，各成分保留時間RSD均小于1%，表明該方法重復性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗 取6 份同一批號（20230516）供試品約20 g，精密稱定，精密加入已知含量的對照品溶液，按“2.1”項方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣，測定加樣回收率，結果見表3?？梢?，原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素、大黃酚的平均回收率分別為93.79%、95.86%、96.12%、95.31%、96.58%、107.43%、97.12%，7 種成分的平均回收率均在93.79%～107.43%范圍內。

表3 加樣回收率試驗結果Table 3 Results of recovery test

2.4.8 樣品測定 取10 批樣品按“2.1”項方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量，結果見表4。

表4 骨傷跌打康復凝膠貼膏劑中7種主成分的質量分數Table 4 Results of content determination for the seven main components of Gushang Dieda Kangfu Cataplasmw/（μg·g?1）

3 討論

骨傷跌打康復凝膠貼膏劑7 種主要成分中，小檗堿主要存在于黃柏藥材中；大黃酸、大黃素、大黃酚主要存在于大黃藥材中；阿魏酸存在于當歸尾、羌活藥材中。研究過程中發現，黃柏陰性的色譜圖仍檢出阿魏酸，但阿魏酸峰高比供試品色譜圖峰高低，可判斷阿魏酸也來源于黃柏；咖啡酸在荊芥、澤蘭和紅花中存在；兒茶素在大黃、赤芍中存在。這些藥材是骨傷跌打康復凝膠膏劑的主要藥效成分，因此這7種成分的含量測定可以用于此制劑的質量控制。

預實驗中，對樣品制備的提取方法進行了考察，分別比較了水和甲醇作為提取溶劑時提取方式和提取時間的效果，結果顯示用水提取的供試品溶液的色譜峰雜峰比較多，而甲醇超聲30 min 提取制備出來的樣品雜質比較少，色譜峰的重現性比較好。研究過程中還發現，制劑樣品中的藥粉粒度對成分含量均勻性和重現性的影響比較大，制劑制備的藥粉粒度≥80 目，同一批次的水凝膠貼劑不同取樣點的含量測定偏差比較大，樣品的均勻性較差；制劑制備的藥粉粒度≤100 目，同一批次的水凝膠貼劑含量測定結果偏差較小，均勻度比較好。因此制劑的藥粉粒度要≤100 目。

由于骨傷跌打康復凝膠貼膏劑的處方成分比較多，建立的方法的檢測時間較長，希望能繼續改進色譜條件，縮短檢測時間。課題組將繼續進行該制劑的全成分分析，更好地闡釋本制劑的有效成分和控制該制劑的產品質量。