甘肅地區遺傳代謝病疾病譜及致病基因分析

張釧 惠玲 周秉博 鄭雷 王玉佩 郝勝菊 達振強 馬瑩 郭金仙 曹宗富 馬旭

（1.甘肅省婦幼保健院/甘肅省中心醫院/甘肅省缺省缺陷與罕見病臨床醫學研究中心，甘肅蘭州 730050；2.國家衛生健康委科學技術研究所/國家人類遺傳資源中心，北京 100081）

遺傳代謝?。╥nherited metabolic disorder,IMD）作為出生缺陷重要組成部分，是由于編碼物質代謝所必需的酶或輔酶基因變異引起相應功能蛋白活性降低或喪失，導致機體代謝紊亂的一組疾?。?-2］，目前已報道的IMD 有1 450 多種［3］。新生兒IMD 篩查可及時對IMD 患兒進行早期診斷和及時干預，對改善預后十分重要［4］，具有重大社會效益［5-6］。

對IMD 患兒進行基因分型意義重大，明確基因分型后可以精準地指導后續治療、遺傳咨詢及婚育問題。IMD 的疾病譜及患病率存在地域性差異［7］。甘肅地處我國西北地區，醫務人員整體對遺傳病尤其是IMD 的認識非常有限，許多IMD 的患病率沒有數據，以及治療規范沒有建立。臨床上經常出現IMD 患兒因不能及時得到診斷造成干預治療不及時的嚴重后果。截至目前，尚未見甘肅地區IMD疾病譜及患病率的相關研究報道。

本研究進行了甘肅地區IMD 疾病譜及致病基因研究，以期實現對本地區IMD 患兒的早期診斷和及時干預，改善預后，為本地區建立精準的IMD篩查、診斷、預防體系提供基礎性數據與策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2018 年1 月—2021 年12 月甘肅省婦幼保健院286 682 例新生兒IMD 篩查的串聯質譜數據，受檢者按人口基數比例來自甘肅省的12 個地級市、2 個自治州的23 個縣，占2018—2021 甘肅省出生人口的26.42%（108.5萬）。

本研究獲得家屬知情同意并簽署知情同意書，并通過甘肅省婦幼保健院倫理委員會審查［（2021）GSFY倫審65號］。

1.2 基因組DNA提取

采集患兒及其父母外周靜脈血2～3 mL，EDTA抗凝。應用北京天根生化科技有限公司生產的血液基因組DNA 提取試劑盒（貨號：DP348）提取基因組DNA。

1.3 高通量測序分析

采用全外顯子組測序技術（北京智因東方轉化醫學研究中心）進行檢測，目標區域20×以上，覆蓋度達95%。檢測區域包括外顯子區和剪接區、部分內含子區；可檢測變異類型包括非重復區域的單堿基變異、小片段插入/缺失（≤20 bp），以及部分外顯子缺失/重復和拷貝數變異。

1.4 數據分析

高通量測序結果與參考基因組（GRCh37/hg19）比對得到所有變異的SNP_INDEL 文件，對檢測到的堿基改變進行篩選，最后依據美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南［8］判讀新變異的致病性。

1.5 Sanger測序驗證

基因外顯子擴增引物由上海生工生物工程股份有限公司完成。PCR 擴增體系為25 μL：2×Taq PCR Mastermix（北京天根生化科技有限公司）12.5 μL，基因組DNA模板1.5 μL（濃度20～50 ng/μL），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對單一目的條帶的產物采用PCR 產物純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）純化后，由ABI 3500 型（ABI，美國）測序儀進行測序，使用SeqMan 軟件與標準序列對測序結果進行比對分析。

1.6 IMD診斷

根據《新生兒疾病串聯質譜篩查技術專家共識》［9］，基于本實驗室建立的特定疾病的關鍵生物標志物的檢測值及臨界值，根據串聯質譜檢測結果，結合基因分型及患兒臨床表現綜合確定IMD種類。IMD種類的確定由實驗室數據分析人員與臨床醫生共同決定。

2 結果

2.1 新生兒IMD分布

286 682 例新生兒經基因檢測明確診斷IMD 180 例，包含28 個致病基因導致的23 種IMD，總患病率為0.63‰（1/1 593）。苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）患病率最高，為0.32‰（1/3 083）；其次是甲基丙二酸血癥（methylmalonic acidemia,MMA）（0.11‰，1/8 959）、四氫生物蝶呤缺乏癥（tetrahydrobiopterin deficiency,BH4D）（0.06‰，1/15 927）、希特林蛋白缺乏癥（0.02‰，1/47 780）。本地區前11 種IMD（患兒數≥2）的累計患病率達93.3%。見表1。

表1 甘肅地區286 682例新生兒IMD疾病譜

2.2 IMD遺傳方式分布

23 種IMD 中，21 種（91%）為常染色體隱性遺傳，肉堿軟脂酰轉移酶2缺乏癥為常染色體顯性遺傳，鳥氨酸氨基甲酰轉移酶缺乏癥為X連鎖隱性遺傳，見表1。180 例患兒中，177 例（98.3%）致病變異均來自父母；1例致病變異來自母親和自發變異；2 例為自發變異（X 連鎖隱性遺傳和常染色體顯性遺傳患兒）。

2.3 新變異及其致病性分析

28 個致病基因中，共發現166 種變異，其中9個基因的13種變異為ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）和HGMD（https://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）數據庫未報道的新變異。根據ACMG 指南，5 種新變異為致病變異，7 種為可能致病變異，1種為臨床意義未明。見表2。

表2 甘肅地區IMD致病基因新變異位點及致病性分析

3 討論

新生兒IMD 篩查目標是預防或降低IMD 病死率，對社會和兒童個人都是有益的［9-10］。新生兒IMD篩查并不具有診斷性，結果異常時應進行基因診斷，對新生兒進行精準評估，有利于早期干預治療，可有效降低包括脂肪酸氧化缺陷、尿素循環障礙等在內疾病的患病率和病死率［5，10-13］。

IMD 疾病譜及患病率在全國存在地域性差異。河南地區IMD 總患病率為0.48‰（1/2 085），其中患病率最高的為MMA，其次為高苯丙氨酸血癥（hyperphenylalaninemia,HPA）、原發性肉堿缺乏癥（primary carnitine deficiency,PCD）、3-甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶缺乏癥（3-methylcrotonyl-coenzyme a carboxylase deficiency,MCCD）、短鏈?；o酶A 脫氫酶缺乏癥（short-chain acyl-coenzyme a dehydrogenase deficiency,SCADD）、希特林蛋白缺乏癥、戊二酸血癥Ⅰ型等［14］。浙江地區新生兒IMD 總患病率為0.22‰（1/4 535），患病率最高的為HPA，其次為PCD、MMA、SCADD、MCCD、希特林蛋白缺乏癥、高甲硫氨酸血癥等［15］。廣州地區IMD 總患病率為0.41‰（1/2 451），患病率最高的為PCD，其次為MMA、PKU、SCADD、希特林蛋白缺乏癥［16］。陜西地區IMD 總患病率為0.65‰（1/1 545），患病率最高的為HPA，其次為MMA、希特林蛋白缺乏癥、PCD、中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥［17］。

本地區IMD 疾病譜及患病率與國內以上地區［14-17］不同。在本研究286 682例新生兒中，經基因檢測共診斷IMD 180 例，包含28 個致病基因導致的23 種IMD，患病率最高的是PKU，其次是MMA、BH4D、希特林蛋白缺乏癥、MCCD、鳥氨酸氨基甲酰轉移酶缺乏癥及楓糖尿?。╩aple syrup urine disease,MSUD），總患病率為0.63‰（1/1 593），本地區IMD總患病率低于同為西北地區的陜西，但要高于國內其他地區。推測這可能是由于西北地區經濟水平欠發達，人口流動性有限，由于當地人群的建立者效應所致，需要擴大樣本量進一步研究。

有效的IMD 治療隨訪可降低對患兒的危害，MSUD為氨基酸代謝病的一種，患兒尿液會出現類似楓糖漿的氣味［18］。該病是一種致死、致殘的常染色體隱性遺傳疾病，治療困難，預后不良。本研究3 例MSUD 患兒中2 例來自同一家系，該家系在第1胎患兒明確診斷后沒有進行產前診斷，導致第2 胎也為MSUD，因此，對患兒家庭進行有效的遺傳咨詢及生育指導十分重要。

攜帶者篩查技術可以檢出攜帶同一種隱性遺傳病致病基因的高風險夫妻，攜帶同一致病基因的高風險夫妻可通過產前診斷或胚胎植入前診斷來避免患兒的出生。隨著測序技術的發展，擴展性攜帶者篩查病種已經有上百種［19］。但由于遺傳病的疾病譜及患病率存在地域性差異，因此，不同地區應制定不同的篩查疾病種類。本研究結果顯示，如果在擴展性攜帶者篩查的病種中添加PKU、MMA、BH4D、希特林蛋白缺乏癥、MCCD、鳥氨酸氨基甲酰轉移酶缺乏癥、MSUD、極長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥、瓜氨酸血癥1型、黏脂貯積癥、肉堿?；D移酶缺乏癥這11 種IMD 時，可覆蓋甘肅地區93.3%的IMD，可有效降低本地區IMD發生率。

綜上所述，本研究對甘肅地區286 682 新生兒的IMD 疾病譜進行分析，發現28 種IMD。PKU、MMA、BH4D為本地區患病率最高的IMD。本研究在9個基因中發現了13個新變異位點，豐富了IMD相關致病基因變異數據庫，為IMD 的分子遺傳學診斷、干預治療、生育指導及遺傳咨詢提供了理論依據與技術支持。

作者貢獻聲明：張釧負責實驗操作、數據分析、論文撰寫與修改、經費支持，惠玲、周秉博、鄭雷、王玉佩、郝勝菊、達振強、馬瑩、郭金仙負責實驗操作、數據分析、論文撰寫與修改，曹宗富、馬旭負責指導研究、論文修改、經費支持。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。