益氣甘露方治療2型糖尿病氣陰兩虛證血清代謝組學的研究

王藝霖,劉文星,黃曉強,黎崇裕,鐘秋萍,黃東暉,許小澤

(1.廣東藥科大學附屬第一醫院,廣東 廣州 510000;2.珠海市中西醫結合醫院,廣東 珠海 519000)

2型糖尿病是由于胰島素分泌缺陷和(或)胰島素抵抗引起的以長期高血糖并伴有多個靶器官損害為臨床特點的慢性代謝性疾病[1]。代謝組學是對低分子量代謝產物進行定性與定量分析的一門學科[2],能夠闡明生物體代謝過程,目前在糖尿病等疾病的研究中廣泛應用[3]。2型糖尿病屬于中醫學“消渴病”范疇,其發生以氣陰兩虛為本,燥熱津傷為標,氣陰兩虛證為臨床中常見的證型。益氣甘露方由《醫學衷中參西錄》之玉液湯加減化裁而成,以益氣養陰清熱為主。本研究應用代謝組學技術,以2型糖尿病氣陰兩虛證患者為研究對象,采用氣相色譜-質譜聯用方法對益氣甘露方治療前后血清代謝產物進行檢測,比較其內源性物質的差異及變化,本研究結果可為中醫藥治療2型糖尿病的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年7月—2023年10月于廣東藥科大學附屬第一醫院、珠海市中西醫結合醫院門診及住院部診斷為2型糖尿病氣陰兩虛證患者80例作為研究對象。其中,男46例,女34例;年齡 21～71歲,平均(45.62±10.95)歲 。將患者隨機分為對照組與試驗組,每組40例。兩組患者在年齡、病程、空腹血糖、餐后2 h血糖、體質量指數(BMI)、腰圍、體質量方面比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。此外,從體檢人員中選取了40名與糖尿病患者年齡、性別相匹配的健康人作為健康對照組,其中,男23名,女17名;年齡 20～71歲,平均(43.25±10.16)歲。

1.2 診斷標準

西醫診斷標準參照《中國2型糖尿病防治指南》[4],中醫診斷標準參照2002年國家衛生部《中藥新藥治療消渴病(糖尿病)臨床研究指導原則》中2型糖尿病氣陰兩虛證辨證標準:咽干口燥,倦怠乏力。次證:多食易饑,口渴喜飲,氣短懶言,五心煩熱,心悸失眠。舌脈:舌紅少津液,苔薄或花剝,脈細數無力,或細而弦。具備2項主癥和1～2項次癥即可診斷。

1.3 納入標準

患者年齡18～75周歲;符合2型糖尿病診斷標準,空腹血糖<10 mmol/L,經2位主任醫師按照上述2型糖尿病中醫證型診斷標準嚴格辨證后,確定診斷為氣陰兩虛證者。

1.4 排除標準

合并有心、腦、肝等嚴重疾病,或者對研究中某種藥物過敏及無法耐受的患者;妊娠期或哺乳期的婦女;近1個月內發生過糖尿病急性并發癥患者;對研究中某種藥物過敏、無法耐受者。

1.5 健康對照組選擇標準

參與研究的健康人年齡18～75周歲;排除糖尿病、IGT、IFG史,無心腦血管、肝、腎疾病。

1.6 脫落與剔除標準

受試者依從性較差,不能按規定服藥,或資料不全影響療效評價者;研究過程中發生嚴重不良事件者。

1.7 治療方法

入組患者均在飲食、運動控制的基礎上進行治,囑患者戒煙、戒酒。對照組:給予二甲雙胍(國藥準字:H20010716,拜耳醫藥保健有限公司,)口服治療,0.1 g/次,3次/d,療程為12周。試驗組給予益氣甘露方(組成:黃芪15 g,西洋參5 g,天花粉15 g,山藥15 g,山萸肉10 g,葛根15 g,翻白草15 g,烏梅10 g,雞內金10 g,麥冬10 g,炙甘草3 g)治療,1劑/d,水煎取汁300 mL,早晚兩次溫服,療程為12周。

1.8 觀察指標及療效標準

1.8.1 療效評價標準

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]相關療效的判定原則。

1.8.2 生化指標檢測

采用生化儀檢測治療前后的血糖指標:空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、空腹胰島素(INS)、餐后2 h胰島素(INS120′);血脂指標:總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.8.3 中醫癥狀積分

觀察治療前、完成治療后中醫癥狀積分:倦怠乏力、咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲、五心煩熱、大便干燥的改變情況,分為無、輕、中、重,分別賦 0 分、1分、2分、3分,分數越高代表癥狀越嚴重。

1.8.4 代謝組學檢測

1) 標本采集:收集全血至真空采血管,靜置30 min左右,4 ℃,≤1 300 g 離心10 min。待血細胞完全沉降到管底后,用移液器將上層血清轉移到1.5 mL離心管內,每管200 μL,然后凍存于-80 ℃冰箱。

2) 樣品前處理:吸取100 μL液體樣本于1.5 mL離心管中,在其中加入約400 μL提取液(V(乙腈)∶V(甲醇)=1∶1)含0.02 mg/mL的內標(L-2-氯苯丙氨酸),渦旋混勻30 s后,低溫超聲提取30 min,把樣品于-20 ℃靜置30 min。4 ℃,13 000 g離心15 min,移取上清液,氮氣吹干,100 μL復溶液(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)復溶,低溫超聲萃取5 min(5 ℃,40 kHz),4 ℃,13 000 g離心10 min,移取上清液,上機分析。

3) 氣相色譜-飛行時間質譜(GC-ToF/MS) 分析:采用超高效液相色譜串聯傅里葉變換質譜UHPLC-Q Exactive HF-X系統對樣本進行LC-MS/MS分析。

4)物質鑒定及分析:上機后,將原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊,最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的數據矩陣,同時將質譜信息與代謝公共數據庫相互匹配,從而得到代謝物的相關信息。

對預處理后的數據矩陣采用Simca-p軟件,進行主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判別分析分析(OPLS-DA)。顯著差異代謝物的選擇基于OPLS-DA模型得到的變量權重值(VIP)和t檢驗P值來確定,根據VIP>1、P<0.05兩個條件判定代謝物為顯著差異性代謝物。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 兩組患者臨床療效

本研究結果顯示,對照組臨床療效總有效率為87.50 %,試驗組臨床療效總有效率為92.50 %,兩組比較差異無統計學意義(P>0.05),且試驗組不低于對照組。見表1。

表1 兩組患者臨床療效

2.2 兩組患者血糖相關指標

本研究結果顯示,治療前,兩組血糖及血脂指標相比較差異無統計學意義(P>0.05);治療后,對照組與試驗組PG、2 h PG、HbAlc、INS、INS120′與治療前比較差異均具有統計學意義(P<0.05),且試驗組療效不低于對照組,兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。治療后,兩組TC、TG、LDL-C較治療前比較差異具有統計學意義(P<0.05),且試驗組不低于對照組,兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。兩組患者HDL-C與治療前比較差異均無統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 兩組患者血糖相關指標

表3 兩組患者血脂相關指標

2.3 治療前后炎癥因子水平變化

本研究結果顯示,治療前,兩組血清炎癥因子水平比較差異無統計學意義(P>0.05);治療后,兩組炎癥因子TNF-α、IL-6、hs-CRP水平與治療前比較差異具有統計學意義(P<0.05),且試驗組不低于對照組,兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩組患者炎癥因子

2.4 治療前后中醫癥狀積分

本研究結果顯示,治療前,兩組各中醫癥狀積分比較差異無統計學意義(P>0.05);治療后,對照組咽干口燥、多食易饑、口渴喜飲癥狀積分與治療前比較差異具有統計學意義(P<0.05),倦怠乏力、五心煩熱、大便干燥癥狀積分與治療前比較差異無統計學意義(P>0.05);而試驗組各個中醫癥狀積分較治療前比較差異均具有統計學意義(P<0.05),且試驗組優于對照組(P<0.05)。見表5。

表 5 兩組患者中醫癥狀積分

2.5 2型糖尿病氣陰兩虛證與健康人的差異代謝物鑒定

通過OPLS-DA(正交偏最小二乘法)方法,根據VIP>1、 student’st檢驗P<0.05篩選出區分2型糖尿病氣陰兩虛證與健康人的差異性代謝物,可作為潛在生物標志物。顯著差異代謝物所參與的代謝途徑主要涉及脂類代謝和氨基酸代謝。見表6。

表6 2型糖尿病氣陰兩虛證與健康人的差異代謝物

2.6 差異代謝物含量

本研究對試驗組治療前后、健康人對照組3組的血清差異代謝物進行檢測,并繪制主成分分析圖(PCA圖)。見圖1。B1代表試驗組治療前,B2代表試驗組治療后,C代表健康對照組。從圖中可以看到,B1、B2、C組聚類明顯,且差異顯著;B1組與健康對照C組間差異最大,B2組向C組接近,說明經過治療后,代謝產物的變化逐漸趨近于健康人的水平。

B1.試驗組治療前; B2.試驗組治療后;C.健康對照組。

3 討 論

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后新興的一門系統生物學,是了解生物體代謝產物功能作用的關鍵技術之一[6]。代謝組學提供了潛在代謝途徑的信息,可以進一步確定糖尿病及其進展機制。應用系統生物學方法研究糖尿病,可以提供一個全面的代謝網絡,加深對分子的認識,幫助發現潛在治療靶點,還可對T2DM藥物療效進行預測[7]。本研究以2型糖尿病患者為研究對象,運用代謝組學技術檢測其治療前后代謝產物的變化,發現其潛在生物標志物主要有溶血磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、二酰甘油、三酰甘油、溶血磷脂、磷脂酰肌醇磷酸、膽甾烯基癸酸酯、二氫生物蝶呤、脲基琥珀酸,主要涉及脂肪酸代謝和氨基酸代謝途徑。有研究[8]報道,T2DM患者血液中的游離脂肪酸水平往往處于較高水平,脂質代謝的紊亂會導致糖尿病病情進展,人體肌肉中脂肪酸增加會引發丙酮酸脫氫酶失活,從而導致人體細胞內血糖濃度升高。本研究對試驗組治療前后、健康人對照組的血清差異代謝物進行檢測發現,經益氣甘露方治療后,2型糖尿病患者差異代謝產物含量水平逐漸趨近于健康人的水平。

本研究顯示:益氣甘露方治療氣陰兩虛型2型糖尿病總有效率高達92.50%,FPG、2 h PG、HbAlc、INS、INS120′、TC、TG、LDL-C水平與治療前比較均顯著下降(P<0.05),且療效不低于二甲雙胍對照組。經益氣甘露方治療后,IL-6、TNF-α、hs-CRP炎癥因子水平較治療前均下降明顯。此外,益氣甘露方試驗組的中醫癥狀積分經治療后顯著下降(P<0.05),且優于對照組。說明益氣甘露方可以有效降低2型糖尿病患者的血糖,調節脂質代謝,減輕全身的炎癥反應。益氣甘露方由玉液湯加減化裁而成,在玉液湯的基礎上,去知母、五味子,增加山萸肉、烏梅、麥冬、炙甘草,與玉液湯原方比較,其養陰生津功效增強。方中重用黃芪益氣生津為君藥;西洋參補氣養陰,天花粉能夠清肺胃熱,生津止渴;山藥、山萸肉補脾固腎,四者共為臣藥;葛根生津而止渴;翻白草、烏梅、麥冬清熱潤燥、生津止渴;雞內金助脾之健運,運化水谷精微,共為佐藥;炙甘草調和諸藥,為使藥,共奏益氣養陰、清熱生津之功。

益氣甘露方中很多中藥成分具有調節糖脂代謝、改善胰島素抵抗的治療作用?，F代藥理學研究[9-19]發現,黃芪、葛根可以通過調控AMPK信號通路發揮糖脂平衡作用,且兩藥配伍的作用優于單藥。西洋參富含皂苷成分,可以降低高血脂大鼠的甘油三酯和膽固醇水平。天花粉分離的酸性蛋白天花粉凝集素、山藥的多糖成分對實驗動物的糖脂代謝、糖耐量異常具有改善作用。山茱萸提取物可以通過抑制炎癥因子、下調Akt磷酸化發揮抗炎作用,其活性成分馬錢苷、莫諾苷,對糖脂代謝、氧化應激起積極的調控作用。翻白草中的黃酮、三萜類成分,烏梅提取物、麥冬和炙甘草的有效成分均具有血糖調節和抗氧化、抗炎活性。益氣甘露方以多成分、多靶點對糖脂平衡進行協同調節,具有改善糖尿病臨床癥狀的作用。

綜上所述,益氣甘露方可以有效調節2型糖尿病患者的血糖、血脂水平,改善臨床癥狀,降低炎癥反應,其主要參與脂肪酸代謝、氨基酸代謝等重要途徑,能夠提高患者的生活質量。