輻射誘導成纖維細胞FAP表達對放射治療后瘢痕復發的影響

唐建萍,劉鐘華

(1.吉林大學第一醫院,吉林 長春 130021;2.長春中醫藥大學第三附屬醫院, 吉林 長春 130061)

瘢痕疙瘩(keloid scars,KSs)是一種皮膚纖維增殖性疾病,為皮膚損傷后結締組織過度增生所產生的[1]。放射治療是目前公認的瘢痕疙瘩最重要的臨床治療方法之一[2]。高能電子線照射時,從體表進入體內深部后都可以維持均勻的劑量分布,目前,已成為瘢痕疙瘩術后輔助放療的最佳選擇[3]。單純手術切除是治療瘢痕疙瘩和增生性疤痕的傳統方法,復發概率為45%～100%[4]。放療通常作為瘢痕疙瘩的術后輔助治療,可將瘢痕疙瘩復發概率控制在15%～23%[2]。然而,其復發機制尚不清楚。成纖維細胞活化蛋白(fibroblast activation protein alpha,FAP)是一種膜上的絲氨酸蛋白酶(二肽基肽酶Ⅳ),可能在瘢痕疙瘩的侵襲性中發揮關鍵作用[5],對傷口愈合和腫瘤侵襲過程中細胞外基質的降解極為重要。FAP具有蛋白酶和膠原酶活性,但在正常成人組織中FAP通常呈陰性[6],提示FAP可能是治療瘢痕疙瘩的新靶點,但目前關于FAP與放療后瘢痕疙瘩復發關系的研究很少,因此有必要建立合適的動物模型探索新的治療方法。將人源性組織移植到具有免疫能力的嚙齒動物體內的主要障礙是其自身強大的異種免疫排斥反應[7],通過破壞對免疫細胞的發育、存活和功能起重要作用的相關基因,已經培育出了幾種免疫缺陷小鼠品系[8]。本研究使用三重免疫缺陷(NCG)小鼠,通過構建人瘢痕疙瘩組織PDX異種移植NCG小鼠模型,研究FAP在瘢痕疙瘩復發中的作用機制,以期為瘢痕的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器

60只8周齡NCG小鼠(動物生產許可證號: SCXK(京)-2019-0009,北京維通利華實驗動物技術有限公司);所有小鼠飼養于22 ℃、12 h光/暗循環的SPF級標準動物房中,自由攝取食物和飲水。本研究經醫院實驗動物倫理委員會審核通過,所有動物操作均符合試驗動物使用和保護條例。人瘢痕疙瘩成纖維細胞由8名瘢痕疙瘩患者手術切除的組織中提取,本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準,所有患者知情同意。

DMEM培養基、1%青-鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline,PBS)(Gibco公司,美國);RNA提取試劑盒(Amresco公司,美國);反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR) 試劑盒和PCR引物(上海翊圣生物科技有限公司);4%多聚甲醛組織固定液(上海尚寶生物科技有限公司);免疫組化一抗FAP、CD31抗體(Affinity公司,美國);二抗Kit-9706和過氧化物酶試劑盒(邁欣科技有限公司);碘化丙啶PI染色液和曲拉通X-100(Triton X-100)(北京博奧拓達科技有限公司);細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)(上海碧云天生物技術有限公司);21EX直線加速器放療設備(Clinac 21ex,Varian醫療系統,瓦里安公司,美國);低溫離心機(5424R)(Eppendorf公司,德國),基因擴增儀(ETC811)(蘇州東勝興業科學儀器有限公司);熒光定量PCR儀(Rotor-Gene Q)(孚約生物科技(上海)有限公司);流式細胞儀(BD FACS Canto II)(BD公司,美國);多功能酶標儀(SPARK)(TECAN公司,瑞士)。

1.2 組織來源、制備、異種移植及電子線照射

將瘢痕組織用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2次,并在無菌條件下切成邊長為3 mm的正方體組織塊。將60只8周齡NCG小鼠以0.1 mL/10 g體質量、5%水合氯醛腹腔注射麻醉,在臀大肌上方背中線兩側做1 cm切口,將瘢痕組織塊植入皮下,最后縫合創口。將兩側皮下移植物分為兩組,左側為未照射組,右側為照射組。照射組的組織塊植入小鼠體內1周后,對移植小鼠右側移植物應用6 MeV進行電子線照射,劑量率為600 cGy/min,劑量為10 Gy,非目標區域用2 cm的鉛板屏蔽。

1.3 原代成纖維細胞培養及電子線照射

將瘢痕組織用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2次,在無菌條件下切成邊長為3 mm的正方體組織塊。將組織塊間隔1 cm放入培養皿中,加入含有10%FBS和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養基,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。約1周可見原代成纖維細胞從組織塊邊緣爬出,當原代成纖維細胞達到90%的融合度時進行胰酶消化并傳代培養。培養至第3代時開始細胞試驗。將細胞分為未照射組和照射組,照射組細胞長至70%～80%時應用6 MeV電子線照射,劑量率為600 cGy/min,劑量為10 Gy,非目標區域用2 cm的鉛板屏蔽。

1.4 實時定量PCR檢測細胞中mRNA水平

收集未照射組和照射組細胞,用RNA提取試劑盒提取兩組細胞總RNA,根據反轉錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒說明書進行mRNA定量分析。引物序列:FAP上游引物5′ GGAAGTGCCTGTTCCAGCAATG-3′,下游引物5′- TGTCTGCCAGTCTTCCCTGAAG-3′ ;Vimentin上游引物5′-AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA-3′,下游引物5′-ATCTGGCGTTCCAGGGACTCAT-3′ ;Beta-actin上游引物5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAAG-3′,下游引物5′-CCATGCCAATCTCATCTTGT-3′ 。

1.5 免疫組織化學檢測小鼠移植物內FAP和CD31的表達

收集兩組小鼠移植物組織,用4%多聚甲醛固定20 min,石蠟包埋,切片至4 μm厚度,將組織切片進行抗原修復;應用一抗FAP(1∶200) 和CD31(1∶200)孵育,然后應用二抗Kit-9706(1∶1 000)孵育,并使用過氧化物酶試劑盒檢測免疫反應性;應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行定量分析。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖

應用細胞計數試劑盒-8評估細胞增殖。將成纖維細胞(3×103細胞/孔)接種到96孔板中,在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養;加入CCK-8溶液2 h,在450 nm處測定吸光度(A)值。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期

在未照射組和照射組的成纖維細胞達到80%～90%時進行胰蛋白酶化。將細胞用PBS清洗2次,在-20 ℃、70%乙醇中固定12 h,用300 μL PI(終濃度為50 mg/L)和0.1% Triton X-100在37 ℃下放置15 min;應用流式細胞術分析細胞周期不同階段的細胞分布。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 建立人源瘢痕疙瘩組織異種移植NCG小鼠模型

將瘢痕手術后的組織切成邊長為3～4 mm的正方形組織塊,并在無菌條件下將切好的組織塊植入NCG小鼠雙側背部皮下并縫合(見圖1 a)。在本研究中,移植20周后,能夠觀察到明顯的組織體積減小,但移植物仍然可見;移植3周后建立了穩定的新生血管(見圖1 b)。移植4周后,用單次10 Gy的電子線照射移植小鼠的右側移植物(見圖1 c)。結果顯示,本研究成功構建了人源瘢痕疙瘩異種移植小鼠模型。

圖1 人源瘢痕疙瘩組織移植NCG小鼠及其照射方式Fig.1 Human keloid tissue transplantation of NCG mice and its radiotherapy

2.2 免疫組織化學檢測兩組小鼠移植物和熒光定量PCR檢測兩組細胞CD31和FAP表達

通過免疫組化檢測未照射組和照射組照射4周后小鼠移植物中CD31和FAP表達情況,結果顯示,照射組移植物較未照射組的CD31表達量明顯減少,而FAP的表達量明顯升高(P<0.001)。見圖2 a。在體外實驗中,熒光定量PCR結果顯示,照射組的成纖維細胞FAP(P<0.001)和Vimentin(P<0.01)的表達量在第4周明顯高于未輻照組(見圖2 b)。以上結果提示電子線照射可以誘導激活瘢痕組織中的成纖維細胞,上調FAP表達水平,促進瘢痕組織復發。

圖2 組織及細胞中相關指標表達變化Fig.2 Expression of indicated molecule in tissues and cells

2.3 CCK-8檢測兩組原代成纖維細胞增殖能力

本研究結果顯示,輻照后的瘢痕組織原代成纖維細胞會具有更強的增殖能力(見圖3 a)。CCK8法檢測結果顯示,與未照射組比較,照射組在450 nm處A值更高(P<0.05),表示其細胞增殖能力更強(見圖3 b)。

圖3 兩組原代成纖維細胞增殖能力Fig.3 Proliferation ability of primary fibroblasts in two groups

2.4 流式細胞術分析兩組成纖維細胞的細胞周期

KEGG分析顯示,輻照顯著增加了細胞周期調節因子的表達。因此,通過流式細胞術分析兩組成纖維細胞的細胞周期變化,結果顯示,與未照射組比較,照射組照射后4周明顯促進成纖維細胞進入S期,加速了細胞的增殖(見圖4 a)。體外試驗證明,成纖維細胞照射后第3天開始,進入S期的細胞比例明顯超過未照射組(見圖4 b)。

圖4 流式細胞術鑒定細胞周期Fig.4 Cell cycle identification by flow cytometry

3 討 論

瘢痕疙瘩是一種纖維增生性疾病和人類特有的生理現象,可發生在遺傳易感人群中[9]。因此,由于瘢痕疙瘩僅能在人體上產生,是很難通過動物模型進行體內科學研究的。免疫缺陷小鼠品系的培育為研究體內瘢痕疙瘩的病理提供了一種新的方法,這種人源組織異種移植小鼠模型(PDX模型)在移植后幾周到幾個月仍然存活[8,10]。本研究利用NCG小鼠建立了人源性瘢痕疙瘩組織的PDX模型,移植物成功在小鼠體內存活了長達20周。雖然隨著時間的推移,能夠觀察到明顯的組織損失,但所有移植物在20周內保持了其原始的組織學和形態學特征,為臨床研究和分子機制提供了足夠長的窗口期。

研究[11]表明,電子線照射瘢痕疙瘩具有良好的臨床療效,最近的數據[4]顯示,手術切除瘢痕疙瘩后隨即進行電子線照射可將復發概率降低到8.6%,而傳統瘢痕疙瘩手術的復發概率高達45%～100%。關于最佳照射時間,大多數研究[12]建議在瘢痕疙瘩手術切除后24～48 h內應進行電子線輔助放射治療。從放療分子機制上看,此時在切口肉芽組織中占主導地位的成纖維細胞是對輻射敏感組織。因此,這種放療策略可以有效抑制成纖維細胞的增殖和分裂,減少膠原沉積。然而,對于最佳照射劑量和分割方案尚未達成共識。在既往研究[13]中,瘢痕疙瘩的治療基本上均為術后輔助放療,劑量分割方式為12～20 Gy/3～5次。本研究證實,與正常分割方案相比,20 Gy/5次的輻射可產生更好的局部控制率。最近的研究[14]表明,對瘢痕疙瘩切除術后盡快使用大分割的高能電子線放療是一種很好的臨床治療方法。單次8～10 Gy的電子線輔助放療也被證實對治療瘢痕疙瘩是有效和安全的[15-16]。既往研究[17]表明,對于不可切除的瘢痕疙瘩,根治性放療亦可達到令人滿意的療效。因此,術后輔助放療已成為瘢痕疙瘩最為常見的治療方法。

在本研究通過電子線照射人源瘢痕疙瘩的PDX模型探討FAP對輻照后瘢痕疙瘩復發的作用及其機制,血管作為輻照敏感組織,其狀態直接影響移植物的存活周期。本研究提示照射后4周移植物的血管網絡遭到嚴重破壞,表明輻照可迅速破壞移植物的新生血管系統,導致其產生輻射抗性。本研究觀察到輻照后的瘢痕疙瘩組織迅速復發,并且伴隨著FAP和Vimentin的表達回升。FAP是一種脯氨酸選擇性絲氨酸蛋白酶,在瘢痕疙瘩組織和腫瘤基質(癌癥/腫瘤相關成纖維細胞,CAFs/TAFs)中過度表達,但在大多數正常成人組織中檢測不到[18-19]。FAP通過絲氨酸蛋白酶活性在基質重塑中發揮重要作用[20],放療后腫瘤復發通常是由腫瘤輻射抗性成分引起的,這是由癌細胞內在特性和外部微環境共同作用的結果[21]。越來越多的證據[22-24]表明:FAP陽性的腫瘤CAFs可能提供更具免疫抑制性的腫瘤微環境,以抵抗免疫細胞/放療/化療的殺傷,從而提高腫瘤存活率。此外,移植瘤模型結果表明,FAP陽性基質細胞可以通過削弱T細胞抗腫瘤活性來促進免疫抑制[25]。然而,誘導FAP表達的機制尚不清楚。本研究結果首次揭示了電子線照射可提升體外和體外FAP的表達水平,未照射組FAP陽性組織的減少與組織損失呈正相關關系,而照射組FAP陽性組織的復發也與移植物體積成正比。此外,轉錄組學結果顯示,輻照顯著增強了移植物的翻譯活性,促進細胞周期進程。本研究結果顯示,無論是體內還是體外試驗,輻照均促進成纖維細胞的S期細胞比例的增加,并提高其增殖能力。本研究發現,電子線僅在原代人瘢痕疙瘩衍生成纖維細胞中誘導FAP表達,也試圖檢測輻射誘導的小鼠成纖維細胞細胞系FAP表達,但該細胞系顯示出較差的放射敏感性(數據未顯示)。

綜上所述,本研究結果顯示,FAP在手術切除和放療后瘢痕復發組織中的顯著表達,表明輻照可能增強FAP陽性細胞豐度,其與細胞周期和增殖相關。