GSTP1和ERCC1基因多態性與食管癌患者放療敏感性及預后的關系

李強虎,辛 勇

(1．徐州醫科大學第一臨床醫學院,江蘇 徐州 221004;2．徐州醫科大學附屬醫院,江蘇 徐州 221006)

臨床治療中,通過科學、足量的放療能夠有效控制食管癌進展[1],但并非所有食管癌患者均對放療敏感,部分患者因對放療耐受而造成治療失敗,其影響因素包括患者自身特征、腫瘤本身、放射劑量效應關系等[2]。隨著近年來基因檢測技術的快速發展,通過基因檢測預測食管癌患者對放療的敏感性,并制定個體化放療方案。相關研究[3]顯示,DNA損傷修復能力與放療敏感性密切相關,DNA損傷修復相關基因在其中發揮重要作用,其單核苷酸多態性(SNP)能夠改變DNA修復蛋白功能,進而影響損傷修復能力。谷胱甘肽硫轉移酶P1基因(GSTP1)、切除修復交叉互補基因1(ERCC1)在核苷酸修復中發揮重要作用[4]。為此,本研究主要探討GSTP1和ERCC1基因多態性與食管癌患者放療敏感性及預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年4月—2020年2月徐州醫科大學附屬醫院收治的食管癌患者200例。其中,男144例,女56例;年齡61～75歲,平均(66.31±5.08)歲。根據放療結束后的療效將患者分為放療敏感組(完全緩解、部分緩解)、放療不敏感組(穩定、進展)。本研究經徐州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會審核批準,患者均自愿參與并簽署知情同意書。

入選標準:經內鏡檢查和病理檢查確診為食管癌;無放療禁忌證,接受多西他賽單藥化療和同期放療;完成3 a隨訪研究。

排除標準:有重要器官功能異?；虬┘毎h處轉移的患者;接受過手術治療、放療、化療的患者。

1.2 方 法

1.2.1 治療方案

食管癌患者放療方案:采取適形放射治療,總劑量為原發腫瘤靶區60 Gy,2 Gy/次,1次/d,5次/周,30次為1個療程。放療第1天開始同期進行化療,化療方案:多西他賽40 mg,1次/周,6次為1個療程,共2個療程。

1.2.2 療效評價

患者放療1個療程后,參照實體瘤療效評價標準(RECIST1.1)判斷食管癌患者的療效,分為完全緩解、部分緩解、穩定、進展。其中,完全緩解:靶病灶完全消失;部分緩解:靶病灶最大徑與治療前相比減少30%及以上;穩定:處于部分緩解和進展之間的狀態;進展:靶病灶最大徑與治療前相比增加20%及以上,或出現新發腫瘤病灶。將完全緩解、部分緩解納入放療敏感組,穩定、進展納入放療不敏感組。治療后對患者進行3 a隨訪,利用電話、門診復查、住院復查等方式進行,記錄患者生存情況。

1.2.3 GSTP1和ERCC1基因型檢測

采集患者外周靜脈血4 mL,放入EDTA抗凝管中4 ℃保存待測,使用Qiagen全血基因組DNA提取試劑盒獲得基因組DNA。PCR擴增引物由上海士鋒生物有限公司合成。GSTP1上游引物:5′-AAAGTCCCCTCTTTAAAC CGC-3′,下游引物:5′-CTGACTGATGGAGTACTTGTT-3′;ERCC1上游引物:5′-CCGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′,下游引物:5′-CTCATGTAGTGGTCGTC GTAG-3′。PCR反應體系20 μL,包括dNTP Master Mix 6 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板3 μL、雙蒸餾水9 μL。擴增條件:94 ℃預變性1 min,95 ℃變性40 s,60 ℃復性1 min,共45個循環,72 ℃延伸5 min。檢測儀器自帶軟件收集熒光信號并分析得出SNP分型,同時將標本送至基因科技(上海)股份有限公司進行直接測序。

1.2.4 MBP-1、PTEN、Cyclin D1、PLCE1基因表達檢測

取適量的患者食管癌組織,加入RIPA蛋白裂解液充分研磨,將組織懸液以12 000 r/min 4 ℃恒溫離心15 min,收集上清液;應用酶聯免疫吸附法測定髓磷脂堿性蛋白1(MBP-1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、磷脂酶Cε1(PLCE1)基因蛋白濃度。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 不同性別、病理類型的食管癌患者GSTP1和ERCC1基因多態性分析

本研究結果顯示,200例食管癌患者中GSTP1基因攜帶野生型GG 115例,雜合型GA 61例,突變型AA 24例。ERCC1基因攜帶野生型CC 86例,雜合型CT 99例,突變型TT 15例。GSTP1和ERCC1基因SNP分布符合Hardy-Weinberg平衡,GSTP1和ERCC1基因各位點的基因型分布在不同性別、病理類型的食管癌患者間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同性別、病理類型的食管癌患者GSTP1和ERCC1基因多態性分析Tab.1 Analysis of GSTP1 and ERCC1 gene polymorphisms in esophageal cancer patients with different genders and pathological types

2.2 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后療效分析

本研究結果顯示,200例食管癌患者經放療后敏感(完全緩解、部分緩解)119例納入放療敏感組,不敏感(穩定、進展)81例納入放療不敏感組。GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者放療后完全緩解、部分緩解的比例明顯高于野生型GG的患者,穩定、進展的比例明顯低于野生型GG的患者(P<0.001)。ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者放療后完全緩解、部分緩解的比例明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,穩定、進展的比例明顯低于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者(P<0.001)。見表2。

表2 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后療效分析Tab.2 GSTP1 and ERCC1 genotypes and efficacy of radiotherapy in esophageal cancer patients

2.3 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后生存時間的關系

本研究結果顯示,GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者放療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于野生型GG的患者(P<0.05);ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者放療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者(P<0.05)。見表3。

表3 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌患者放療后生存時間的關系Tab.3 GSTP1 and ERCC1 genotypes and survival time after radiotherapy in esophageal cancer patients

2.4 不同放療敏感性的食管癌組織中增殖、凋亡相關基因表達

本研究結果顯示,放療不敏感組食管癌患者凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達水平明顯低于放療敏感組食管癌患者,增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達水平明顯高于放療敏感組食管癌患者(P<0.05)。見表4。

表4 不同放療敏感性的食管癌組織中增殖、凋亡相關基因表達Tab.4 Expression of proliferation and apoptosis related genes in esophageal cancer tissues with different radiosensitivity

2.5 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌組織中增殖、凋亡相關基因表達水平的關系分析

本研究結果顯示,GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達水平明顯高于野生型GG的患者,增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達水平明顯低于野生型GG的患者(P<0.001)。ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達水平明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達水平明顯低于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者(P<0.05)。見表5。

表5 GSTP1和ERCC1基因型與食管癌組織中增殖、凋亡相關基因的關系分析Tab.5 Analysis of relationship between GSTP1 and ERCC1 genotypes and expression levels of proliferation and apoptosis related genes in esophageal cancer tissue

3 討 論

放射生物學效應主要是通過DNA改變來實現的,當人體細胞在X線作用下會發生單鏈或雙鏈斷裂,其中雙鏈斷裂主要發生在對側互補堿基對或間隔區堿基對[5]。DNA雙鏈斷裂是目前公認的電離輻射所致染色體損傷,主要修復方式為切除修復[6]。近年來研究[7]顯示,惡性腫瘤患者放療的療效差異可能與DNA損傷修復水平有關。在惡性腫瘤患者分次放療中,射線能夠對DNA造成累積性損傷,該損傷過程在多種DNA底物及修復酶的作用下持續被修復,當患者對放療中射線所致DNA損傷修復能力較強時,表現為放療敏感性低[8]。GSTP1是從哺乳動物中分離得到的影響細胞對電離輻射敏感性的基因,參與DNA的修復過程,其編碼蛋白無直接催化活性,但能夠在堿基切除修復過程中發揮蛋白支架作用,與DNA連接酶作用后參與電離輻射所致的DNA修復和堿基損傷過程[9]。相關研究[10]顯示,GSTP1基因G28152A位點多態性能夠降低GSTP1基因的堿基切除活性,影響腫瘤細胞對放射性的敏感性。本研究對GSTP1基因G28152A位點多態性進行檢測,結果顯示,攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者放療后完全緩解的比例明顯高于野生型GG的患者,放化療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于野生型GG的患者。提示食管癌患者中GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的放療效果更好,生存率處于較高水平;檢測GSTP1基因SNP可作為食管癌患者放療敏感性的預測指標之一。

ERCC1編碼一種高度保守的單鏈DNA內切酶,其表達產物與相應的DNA切除修復酶通過互補基因相互結合而生成XPF-ERCC1核酸酶復合體,作為特異性核酸內切酶,發揮損傷識別、切除DNA 5′端的雙重作用[11]。ERCC1基因C118T位點核苷酸C向T改變,會造成密碼子中AAC排列轉變為AAT,雖然上述兩種核苷酸排列均編碼天門冬氨酸,但SNP會改進基因轉錄[12]。相關研究[13]顯示,卵巢癌細胞中ERCC1基因第121位密碼子由C變異為T,造成ERCC1蛋白表達下調。目前,關于ERCC1基因多態性與食管癌放療療效的相關研究較少,為此,本研究對ERCC1基因C118T位點多態性進行檢測,結果顯示:ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者放療后完全緩解的比例明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,放療后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者。提示食管癌患者中ERCC1基因攜帶野生型CC的放療效果更好,生存率處于較高水平;檢測ERCC1基因SNP也可作為食管癌患者放療敏感性的預測指標。

放療能夠促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖,凋亡、增殖相關基因的表達也會發生相應改變[14]。食管癌病情發展過程中MBP-1、PTEN屬于凋亡相關基因,Cyclin D1、PLCE1屬于增殖相關基因[15]。其中MBP-1作為c-myc啟動子結合蛋白,可抑制其生物學活性,誘導細胞凋亡[16];PTEN負調控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路,抑制該信號通路介導的細胞生長[17]。Cyclin D1屬于細胞周期家族成員,具有高度保守性,其可通過調控細胞周期蛋白依賴性激酶來促進細胞增殖[18]。PLCE1可通過誘導抑癌基因p53活化來促進腫瘤細胞增殖[19]。本研究結果顯示,放療不敏感組食管癌患者凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達水平明顯低于放療敏感組食管癌患者,增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達水平明顯高于放療敏感組食管癌患者,提示MBP-1、PTEN、Cyclin D1、PLCE1表達水平與食管癌放療敏感性密切相關。進一步分析顯示,GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA的食管癌患者凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達水平明顯高于野生型GG的患者,增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達水平明顯低于野生型GG的患者。ERCC1基因攜帶野生型CC的食管癌患者凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達水平明顯高于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者,增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達水平明顯低于攜帶雜合型CT和突變型TT的患者。說明GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA,ERCC1基因攜帶野生型CC可能通過上調凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達,下調增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達來發揮抑制食管癌病情發展的作用,具有較高的放療敏感性。

綜上所述,食管癌患者GSTP1和ERCC1基因SNP可作為放療敏感性的預測指標,其中GSTP1基因攜帶雜合型GA和突變型AA,ERCC1基因攜帶野生型CC的患者放療預后較好,可能與上調凋亡相關基因MBP-1、PTEN表達,下調增殖相關基因Cyclin D1、PLCE1表達有關。