基于暴露組-脂質組關聯研究的代謝相關脂肪性肝病血清中外源性化學物質的風險分析

陳倩倩, 由 蕾, 管朋維, 方成男, 秦望舒, 劉心昱*, 許國旺

(1. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧省代謝組學重點實驗室,遼寧 大連 116023; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 中國醫科大學, 遼寧 沈陽 110122)

脂肪肝是一種由多種原因導致肝細胞內脂肪堆積過多的疾病,一般分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝兩大類。非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒和其他明確的肝臟損傷因素導致的,以肝臟實質細胞脂肪變性為特征的疾病[1]。2020年初,國際專家小組發布共識聲明[2],將非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic associated fatty liver, NAFLD)改名為代謝相關脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease, MAFLD),該病全球患病率日益攀升,已高達25%[3]。

流行病學證據表明,MAFLD是一種多系統疾病[4],不僅會造成終末期肝病[5]、原發性肝癌[5],還與2型糖尿病[6]、心血管疾病[7]、肥胖[8]及高尿酸血癥[9]等密切相關。近年來,越來越多的研究顯示慢性代謝性疾病不單受到遺傳因素的控制,還與周圍環境的暴露密不可分,包括MAFLD的多種疾病均與環境暴露和遺傳等多種因素聯合作用相關[10]。有研究發現,環境污染物(如全氟辛烷磺酸)暴露與MAFLD患者肝臟脂質譜的改變有關,外源性化學物質可能是MAFLD發生和發展的重要影響因素[11]。

肝臟是體內新陳代謝的中心器官,當脂質在肝臟內的生成與消耗平衡被擾亂時,就會促進MAFLD的形成,因此MAFLD與肝臟內的脂質代謝緊密關聯[12]。脂質組學旨在大規模定性和定量研究脂類化合物,能準確全面地提供生物樣品在不同生理條件下的全脂信息譜圖,在解釋脂質代謝相關疾病的發病機制方面發揮了重要作用[13]?，F有脂肪肝代謝組學和脂質組學研究的證據表明,氨基酸、花生四烯酸、膽汁酸以及脂質代謝途徑在MAFLD患者中顯著變化,尤其是脂質代謝[14]。此外,研究還發現,與對照組相比,NAFLD患者血漿中多種甘油二酯(DG)特異性增加[15]。與代謝組類似,脂質組能有效反映內外界因素引起的脂代謝紊亂,有助于從脂代謝視角深入了解環境化學物質暴露與MAFLD疾病風險關聯與作用機制。

因此,本研究擬采用基于超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UHPLC-MS/MS)的靶向暴露組學定量血清中外源性化學物質殘留,采用超高效液相色譜-高分辨質譜(UHPLC-HRMS)的非靶向脂質組學技術獲取MAFLD患者血清脂質譜,通過暴露組關聯研究確定外源性化學物質殘留與代謝相關脂肪性肝病患者的風險關系,通過脂質組關聯研究結合中間相遇原則揭示外源性化學物質殘留引起與疾病風險相關的脂代謝擾動,為全面深入了解代謝相關脂肪性肝病的發病機制提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

臺式高速冷凍離心機(日本HITACHI公司);振蕩器(美國Avantor公司);真空離心濃縮儀(美國LABCONCO公司); 96孔氮吹儀(中國奧盛儀器有限公司);氮氣發生器(中國森奧電器有限公司);超純水系統(美國Millipore公司)。

甲醇、乙腈和異丙醇(色譜純)購于德國Merck公司;甲酸購于中國J&K Scientific公司;甲基叔丁基醚(MTBE)和乙酸銨(粉末,純度99%)購于美國Sigma-Aldrich公司。脂質組學內標購自美國Avanti Polar Lipids公司。254種化學物質標準品(包含酚類、全氟化合物、紫外線吸收劑、除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、獸藥、食品添加劑等)和暴露組學內標購于Sigma-Aldrich、J&K Scientific等公司。磷脂去除96孔板PhreeTMPhospholipid Removal Plates購于美國Phenomenex公司。

1.2 樣本采集

本研究涉及的337例樣本采自錦州醫科大學第一附屬醫院,以診斷為MAFLD的患者為受試對象,采集血清樣本并收集受試者的年齡、性別、體重、血糖、血脂及腎功能等生化指標信息。

本研究得到錦州醫科大學附屬第一醫院醫學研究倫理委員會的批準(KYLL202084),并按照1975年修訂的1964年赫爾辛基宣言的指導方針進行。所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 非靶向脂質組學分析[16]

樣本預處理 采用研究組建立的甲醇-MTBE-水溶劑體系提取血清中的脂質。簡述如下:量取20 μL血清樣本,加入240 μL含內標(質量濃度見表1)的甲醇溶液。渦旋后,加入800 μL MTBE,室溫振蕩后加入水分層,渦旋離心后取上清液凍干。用二氯甲烷-甲醇(2∶1, v/v)復溶,含5 mmol/L乙酸銨的乙腈-異丙醇-水(65∶30∶5, v/v/v)的混合液稀釋后進樣分析。質量控制(QC)樣本由相同體積的所有待檢測樣本混合而成,用來監測和評價樣本分析過程中數據的穩定性,其預處理操作同實際樣本。

色譜條件 脂質組學分析采用Vanquish超高效液相色譜-Q ExactiveTM質譜系統(美國Thermo Fisher Scientific公司)。采用ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司)在柱溫60 ℃進行色譜分離。以含10 mmol/L乙酸銨的乙腈-水溶液(60∶40, v/v)和含10 mmol/L乙酸銨的異丙醇-乙腈溶液(90∶10, v/v)為流動相進行梯度洗脫。

質譜條件 ESI源正離子檢測模式下,MS全掃描范圍為m/z300～1 100,噴霧電壓3.50 kV;負離子檢測模式下,MS全掃描范圍為m/z160～1 600,噴霧電壓為3.00 kV。毛細管溫度300 ℃,輔助加熱器溫度350 ℃,鞘氣和輔助氣流速分別為45和10 arb。全掃描MS和數據依賴型二級質譜(dd-MS2)兩種模式下的分辨率分別設置為120 000和30 000。以QC樣本進行dd-MS2掃描用于脂質定性。

表1 內標化合物的信息

1.4 靶向暴露組學定量分析[17]

樣本預處理 利用研究組建立的基于96孔除磷脂板的暴露組學前處理方法。簡述如下:量取50 μL血清樣本,加入200 μL混合內標溶液(內標濃度見表1,內標溶于乙腈)及50 μL乙腈。振蕩混合后,利用接收板收集提取液,并利用氮氣吹干。以50 μL甲醇-水(1∶1, v/v)復溶,振蕩混合并經過0.22 μm過濾后進樣分析。

配制基質混合標準溶液和溶劑混合標準溶液供定量使用,質量濃度梯度如下:200、100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005、0.002 5、0.001 ng/mL。

色譜條件 暴露組學分析采用ExionLC AD超高效液相色譜-Triple QuadTM6500+質譜系統(美國AB SCIEX公司)。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司),柱溫60 ℃,流速0.4 mL/min。以含5 mmol/L乙酸銨的水溶液和含10 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫。

質譜條件 利用ESI源,正、負離子切換檢測模式同時掃描。正、負離子檢測模式下,噴霧電壓分別為5.50 kV和-4.50 kV。溫度設定為500 ℃,離子源氣1和離子源氣2都設為344.74 kPa。分析過程中,插入空白樣本(乙腈)和QC樣本分別監測分析過程中可能產生的殘留及儀器的分析穩定性。每運行完96針,插入2針空白樣本沖洗系統(沖洗2 h)。

1.5 數據處理與統計分析

利用LipidSearchTM4.1軟件(美國Thermo Scientific公司)對QC樣本的dd-MS2數據進行定性,獲得精確質荷比、保留時間、脂質類型、脂?；x子碎片及質量精度等信息,然后通過Xcalibur軟件(美國Thermo Scientific公司)對脂質的結構信息以及保留時間進行核對,對未產生特征碎片的脂質根據實驗室自建數據庫進行靶向提取。

利用SCIEX OS軟件(美國AB SCIEX公司)對QC樣本中各個化學物質進行積分,根據校正質控樣本中獲得最小相對標準偏差(RSD)為原則選擇合適的內標,并用于實際樣本和基質/溶劑加標線性樣本的校正。建立加權(權重為1/濃度)線性回歸模型擬合校準曲線,定量實際樣本中的暴露物。默認使用基質加標線性定量,在基質干擾嚴重時選用溶劑加標線性定量。在統計分析之前,將定量結果中低于LOD的檢測值替換為LOD/2值。

利用Mann-Whitney非參數檢驗對差異代謝物做層次聚類分析,利用調整混雜因素后的Spearman相關性分析和二元邏輯回歸分析,考察外源性暴露物、內源性脂質代謝物和代謝相關脂肪性肝病的關系等。

2 結果與討論

2.1 臨床指標的比較

根據受試者生化指標等信息將疾病組細分為4種情況:(1)只患脂肪肝(以MAFLD(0)表示),共52例;(2)患脂肪肝且合并高尿酸血癥、高脂血癥、肥胖、糖尿病和高血壓任意1種代謝性疾病(MAFLD&1),共121例;(3)患脂肪肝且合并2種代謝性疾病(MAFLD&2),共92例;(4)患脂肪肝且合并3種代謝性疾病(代謝綜合征)(MAFLD&3),共35例;(5)患有脂肪肝且合并4種代謝性疾病(MAFLD&4),共7例。此外,研究中納入30例健康對照(HC)。

代謝性疾病的診斷標準如下:高尿酸血癥,尿酸水平男性≥420 μmol/L,女性≥360 μmol/L;高脂血癥,滿足以下任一條件,甘油三酯水平≥2.3 μmol/L、總膽固醇水平≥6.2 μmol/L、低密度脂蛋白膽固醇水平≥3.4 μmol/L;肥胖,身體質量指數(BMI)≥28;高血壓,滿足以下任一條件,收縮壓≥140 mmHg、舒張壓≥90 mmHg;糖尿病,空腹血糖濃度水平≥7.0 μmol/L。與健康對照組相比,代謝相關脂肪性肝病組在性別、體重指數、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、體重、收縮壓與舒張壓等指標存在顯著差異,詳見表2。

表2 本工作研究對象的詳細臨床信息

2.2 血清中化學物質殘留的檢測及數據質量評價

暴露物的峰面積經內標校正后,計算質控樣本中暴露物含量的RSD,評價儀器的穩定性和數據的重復性。結果顯示,96%暴露物含量的RSD<30%,表明數據總體質量良好。QC中RSD<30%的物質線性范圍跨越3～4個數量級,具有良好的線性且相關系數平方(r2)在0.99以上。

本研究檢測的254種物質中,167種物質的檢出率<30%, 55種物質的檢出率>30%, 32種物質未檢出。全氟辛酸(PFOA)、全氟己烷磺酸(PFHxS)、全氟庚基磺酸(PFHpS)的檢出率為100%。全氟壬酸(PFNA)、氟蟲腈砜、全氟十一酸(PFUnDA)、可的松、糠酸莫美他松、皮質醇檢出率為99%。此外,全氟戊酸(PFPeA)、噻蟲嗪、全氟丁基磺酸(PFBS)等的檢出率均在90%以上(見表3)。有研究報道全氟類化合物暴露很普遍[18],在人體中更容易積累。檢測頻率>30%的物質被納入后續分析。

2.3 高頻檢出化學物質殘留的分布特征

55個高頻檢出物質包括全氟化合物、農獸藥、塑化劑、食品添加劑、藥物、紫外線吸收劑以及防腐劑和其他環境污染物等多個類別。人血清中高頻檢出外源性化學物質的平均水平為0.02～36.36 ng/mL,水楊酸、噻蟲嗪、全氟辛酸、可的松和皮質醇5個物質的平均含量在15 ng/mL以上,分別為20.64、15.76、19.96、17.51以及36.36 ng/mL(圖1a)。其中皮質醇不僅平均含量最高且檢出率高達99.11%。本研究中持久性有機污染物全氟化合物的檢測頻率都在60%以上,且全氟辛酸的檢出率高達100%,錦州地區樣本的平均含量為19.96 ng/mL。全氟辛酸在人體中的暴露水平受到生活方式、居住環境及工作場所等多種因素的影響,例如沈陽人群為6.08 ng/mL[19]、上海人群為16.99 ng/mL[20]。

表3 檢出率大于30%的外源性化學物質

圖 1 (a)高頻檢出暴露物質的濃度分布特征(n=337)以及(b～f)高頻檢出外源性化學物質的年齡分層Fig. 1 (a) Concentration distribution of exposures detected at high frequency (n=337) and (b-f) age stratification of exogenous chemical residues detected at high frequency** p<0.01; *** p<0.001.

進一步探究了暴露物的年齡分布特征。根據全人群年齡中位數分為兩組:≤46歲和>46歲。單變量分析發現,5種高頻檢出物質(二甲基PABA乙基己酯、3,5,6三氯吡啶-2-醇、磷酸二丁酯、尼泊金甲酯、雙氯芬酸)具有年齡分布差異,其中二甲基PABA乙基己酯在≤46歲一組中含量較高(圖1b), 3,5,6三氯吡啶-2-醇(圖1c)、磷酸二丁酯(圖1d)、尼泊金甲酯(圖1e)、雙氯芬酸(圖1f)在>46歲一組中含量高。隨著年齡的增加,外源性化學物質在體內蓄積增多,韓國的一項普通人群研究中也發現全氟烷基物質與年齡呈正相關[21]。

2.4 血清化學物質殘留與MAFLD的風險分析

為探討高頻檢出物與代謝相關脂肪性肝病發病風險的關聯,采用二元邏輯回歸評估污染物濃度的風險比(OR)。結果表明,馬拉硫磷二羧酸和全氟壬酸可以增強單純性脂肪肝患者的患病風險;全氟壬酸、全氟辛酸和全氟十一酸與合并一項代謝性疾病的脂肪肝患者的患病風險增加有關;氟蟲腈砜、2-羥基-4-二苯甲酮-5-磺酸、雙氯芬酸和尼泊金甲酯對合并兩項代謝性疾病的脂肪肝患者起正相關作用;馬拉硫磷二羧酸、尼泊金甲酯、安賽蜜以及4-羥基二苯甲酮能夠增強合并三項代謝性疾病的脂肪肝患者的患病風險。這些風險物質在人群中的分布情況見圖2,可以看出,與健康對照組相比,單純性脂肪肝和合并代謝性疾病的脂肪肝患者體內的外源性化學物質含量不同程度的升高。越來越多的研究發現,長期暴露于環境污染物會增加代謝紊亂的風險[22,23],與代謝相關脂肪性肝病發病率之間也存在正相關關系[24]。

圖 2 外源性化學風險物質殘留的濃度分布圖Fig. 2 Concentration distributions of exogenous chemical residue risk exposures*p<0.05; **p<0.01.

校正性別和年齡混雜因素后,鄰苯二甲酸單環己酯、氟蟲腈砜和馬拉硫磷二羧酸與單純性脂肪肝患者的患病風險呈正相關;全氟辛酸、氟蟲腈砜、全氟十一酸以及全氟壬酸可增強合并一項代謝性疾病脂肪肝患者的患病風險;只有氟蟲腈砜與合并兩項代謝性疾病的脂肪肝患者風險增加有關;3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲酸、安賽蜜和4-羥基二苯甲酮可以增強合并三項代謝性疾病脂肪肝患者的患病風險(見圖3)。

流行病學研究報告顯示,全氟化合物與高尿酸血癥風險增加有關[25,26], PFOA和PFNA與MAFLD的發展也有關系,全氟辛烷磺酸在結構上類似于脂肪酸,且能激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)信號通路,進而擾亂脂質平衡[27]。同時,PFASs通過與血清白蛋白結合并轉運至調節血清脂質水平的靶器官來影響血脂水平[28]。除了和MAFLD有關,PFASs暴露與肝纖維化的關系比脂肪變性更密切[29]。以往研究發現甜味劑果糖暴露可以加劇MAFLD的風險[30],在本研究中,除全氟化合物外,還發現了農藥馬拉硫磷二羧酸、塑化劑鄰苯二甲酸單環己酯以及食品添加甜味劑安賽蜜對MAFLD的風險呈正相關。鄰苯二甲酸酯類暴露可能通過影響脂質信號通路,改變關鍵因子FADS6、MVD、SC5D、PLA2G4E的表達水平,導致肝臟細胞中出現脂肪蓄積[31];根據現有研究推測,安賽蜜可能通過增加脫硫弧菌屬的含量誘導炎癥細胞因子的表達進而導致脂肪肝[32]。

圖 3 代謝相關脂肪性肝病風險OR值的森林圖Fig. 3 Forest plots of odds ratio (OR) for MAFLD risk Triangle represents logistic regression model unadjusted for confounding factors, circle represents logistic regression model adjusted for gender and age. Blue represents significance and orange represents non-significance. 95%CI: 95% confidence intervals.

2.5 基于UHPLC-HRMS的血脂譜分析

為了探究MAFLD脂質譜的擾動情況,利用脂質組學技術分析了MAFLD和健康對照的血清脂質組,共鑒定出879個脂質分子,主要有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、脂肪酸(FA)、神經酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)、甘油三酯(TG)及甘油二酯等。峰面積經內標校正后,計算質控樣本中的RSD,評價儀器的穩定性和數據的重復性。結果顯示,超過92%的脂質其含量的RSD<30%,反映了儀器的穩定性和數據的可重復性。

有研究表明脂肪肝患者體內發生了脂代謝改變[33],我們通過多變量分析進一步研究總體水平上的脂質紊亂,結果表明單純性脂肪肝患者及脂肪肝同時伴有高尿酸血癥、高血脂等代謝性疾病的患者體內均發生了脂質代謝異常。

2.6 代謝相關脂肪性肝病的脂質變化特征

通過單變量分析篩選代謝相關脂肪性肝病中發生擾動的脂質分子,在MAFLD(0)和其余組別中分別有383和330個差異脂質,有309個脂質分子在兩組中均具有顯著性。這些差異代謝物主要涉及Cer、TG、DG、PC、PE等亞類。由圖4a可以明顯看出,神經酰胺、甘油三酯和甘油二酯在代謝相關脂肪性肝病患者組中顯著升高。本研究中代謝相關脂肪性肝病患者脂質紊亂情況與以往研究報道的結果一致[34]。

圖 4 (a)差異脂質代謝物熱圖和(b～e)差異脂類的脂酰鏈和不飽和度信息Fig. 4 (a) Heatmap of significantly altered lipids and (b-e) details of acyl chain and unsaturation in differential lipids DG: diglycerides.

為了解脂質結構與疾病的關系,比較了差異脂質在脂酰鏈和不飽和度上的特點。結果表明,甘油二酯和甘油三酯在單純性脂肪肝患者和合并代謝性疾病的脂肪肝患者組中的含量均高于健康對照。其中甘油二酯的?；紨抵饕性?2～40,甘油三酯的?；紨抵饕性?5～60,且均表現為多不飽和脂質分子的變化為主(圖4b～e)。既往研究也發現碳數為50～54、雙鍵數為7以下(大多為2、3)的TG與MAFLD[35]和2型糖尿病相關[36],同時2型糖尿病的發病風險大小與MAFLD的嚴重程度平行,胰島素抵抗、氧化應激、炎癥反應和腸道菌群等是它們的共同病理機制,兩者相互聯系、互為因果[37]。

2.7 外源性化學物質殘留引起與MAFLD風險相關的脂代謝擾動

為了探討與暴露物相關的脂質代謝擾動,根據Spearman相關性分析來確定與MAFLD(0)風險相關的脂質代謝標志物。如圖5a所示,分別有3、8和15個MAFLD(0)相關脂質代謝物與氟蟲腈砜、鄰苯二甲酸單環己酯以及馬拉硫磷二羧酸的水平顯著相關,其中TG與暴露物水平的相關性最強。SM(d18∶1-23∶0)和PE(18∶1p-22∶5)與氟蟲腈砜呈顯著正相關,并與MAFLD(0)風險增加有關。鄰苯二甲酸單環己酯和馬拉硫磷二羧酸主要與TG顯著性最強,并與MAFLD(0)風險增加有關。

有研究發現,農藥殺蟲劑對女性生殖健康有影響[38],本研究發現了氟蟲腈砜和馬拉硫磷二羧酸對MAFLD的風險作用,氟蟲腈砜因其較強的危害性,已被禁止使用。有動物實驗發現,鄰苯二甲酸二乙基己酯和鄰苯二甲酸二丁酯具有顯著誘發斑馬魚幼魚脂肪肝風險的作用,鄰苯二甲酸丁酯苯甲酯顯著促進斑馬魚幼魚的脂質沉積[39]。盡管基于人群MAFLD的鄰苯二甲酸單環己酯的研究結果尚未有報道,本研究發現鄰苯二甲酸酯類的暴露物鄰苯二甲酸單環己酯對于MAFLD有風險作用。

在MAFLD的研究中,分別有110、31、192、137、18、34和8個MAFLD相關脂質代謝物分別與氟蟲腈砜、4-羥基二苯甲酮、全氟辛酸、全氟壬酸、安賽蜜、全氟十一酸和3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲酸的水平顯著相關,其中甘油三酯與暴露物水平的相關性最強。大部分甘油三酯與氟蟲腈砜、4-羥基二苯甲酮、全氟十一酸、全氟辛酸、全氟壬酸及3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲酸水平呈顯著正相關,并與MAFLD風險增加有關,與安賽蜜水平呈負相關,但與MAFLD風險增加有關。圖5b展示了與每個外源性化學物質相關脂質中前10個最相關的(TOP10)脂質分子的MAFLD風險。

有研究發現,安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖和糖精鈉按最大使用量三元和四元聯合使用所帶來的健康風險是單獨使用的2倍[40]。本研究發現,全氟化合物暴露與MAFLD的風險增加相關,既往研究[41]發現全氟化合物是過氧化物酶體增殖激活受體的激活劑,進而參與調節脂質代謝(如脂肪形成和儲存等)。

以上結果表明,環境暴露物對于疾病的發生發展起到不容忽視的作用,從環境暴露角度深入了解MAFLD的發病機制值得關注。

圖 5 外源性化學物質殘留引起的相關代謝物與(a)單純性脂肪肝和(b)合并代謝性疾病脂肪肝風險的關系Fig. 5 Association between chemical residues-induced related metabolites and the risk to (a) MAFLD(0) and the risk to (b) MAFLD Partial correlation coefficient was obtained by Spearman correlation analysis. * p<0.05; ** p<0.01; ***p<0.001.

3 結論

本研究表征了MAFLD患者血清中外源性化學物質的暴露特征和內源性脂質代謝物的擾動,并全面探討了血清外源性化學暴露物與MAFLD的關系。結果表明,氟蟲腈砜、馬拉硫磷二羧酸和鄰苯二甲酸單環己酯與單純性脂肪肝的風險相關,氟蟲腈砜、安賽蜜、全氟辛酸、全氟壬酸、全氟十一酸、4-羥基二苯甲酮以及3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲酸與合并代謝性疾病脂肪肝的風險相關。MAFLD患者的神經酰胺、甘油三酯和甘油二酯較健康對照顯著升高,其中TG與暴露和疾病的相關性最強,通過中間相遇原則發現,大多數效應標志物與外源性化學暴露物呈正相關,并且與人群的患病風險增加有關。我們的研究在脂質代謝水平上探討了環境化學暴露對于代謝相關脂肪性肝病的影響,為后續更深入的機制研究提供了重要的科學依據。

致謝 感謝上?？茖W院上海市生物醫藥技術研究院藥物與醫療器械研究所質譜技術開發平臺主任曹云峰博士在樣本募集中給予的幫助與支持,感謝錦州醫科大學第一附屬醫院給予的樣本支持。