酚類化合物混合暴露與男性精液質量的關聯分析

沈笑荔, 唐偉鋒, 劉軍霞, 敖俊杰, 劉曉寧,黃 賢, 邱 進, 張 軍, 張前龍*

(1. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院, 環境與兒童健康教育部和上海市重點實驗室, 上海 200092;2. 上海交通大學醫學院公共衛生學院, 上海 200025; 3. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院, 上海 200135)

不孕不育的患病率逐年上升,全球約有8%～12%的夫婦存在不孕不育的困擾,而其中約50%可歸因于男性相關的因素[1]。影響男性生殖健康的因素十分復雜,如:飲食結構[2]、不良生活習慣(如熬夜、酗酒、長期吸煙)[3-5]、特殊職業(如高溫、化學物質、輻射)[6,7]等。此外,環境內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)暴露對男性生殖健康的影響也日益受到人們的關注。酚類化合物是一類常見的環境內分泌干擾物,包括雙酚類(bisphenols)、對羥基苯甲酸酯類(parabens)、羥基苯甲酮類(hydroxybenzophenones)和抗菌劑等。酚類化合物廣泛應用于工業生產、生活消費品、食品包裝等[8,9]。由于其暴露廣泛,在日常生活中人們不可避免地通過呼吸、飲食和皮膚等途徑接觸酚類化合物[10,11]。

近年來,越來越多的流行病學研究報道了酚類化合物與男性精液質量間的關聯。一項橫斷面研究從不育門診納入了190名男性,測量了其尿液中的雙酚A(bisphenol A, BPA)濃度,結果提示BPA濃度與精子濃度、形態異常和精子活力呈顯著負相關[12]。Jurewicz等[13]的報道顯示,尿中對羥基苯甲酸酯水平與精子形態、活力和血清睪酮水平下降顯著相關。然而,其他幾項研究結果并未發現酚類物質與精子質量的統計學關聯[14-16]。由于目前的研究結果尚不一致,并且大部分研究仍局限于酚類化合物單一物質暴露的影響,忽視了現實情況中多種酚類物質混合暴露的影響,酚類化合物混合暴露與男性精液質量的關聯仍需進一步探討。

然而,多種酚類化合物的同時分析具有挑戰性,因為它們具有不同的極性范圍和不同的理化性質?？紤]到環境酚類在人體內廣泛存在,迫切需要開發一種同時測定多種類別酚類化合物的方法。此外,酚類化合物在人體中的暴露處在痕量水平以及所測定生物基質的復雜性,都對分析方法的開發構成了重大挑戰。盡管液相/氣相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS或GC-MS/MS)已被證明是用于痕量分析的強大工具[17],但現有的檢測方法在大規模流行病學研究中仍然存在不足。傳統的預處理操作(如液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE))耗時,并且需要大量的尿樣和有害的有機溶劑[18]。為了節省樣本、節約成本和時間,改進預處理過程非常重要。

基于此,課題組前期開發了一種可同時檢測人體尿液中18種酚類化合物(包括對羥基苯甲酸酯、雙酚類、羥基苯甲酮類和抗菌劑)的HPLC-MS/MS方法[19],并開展了大樣本流行病學研究對象的實際檢測應用。本文以2021年12月-2022年11月上海市人類精子庫捐獻精子的志愿者為研究對象,分析酚類化合物單一暴露和混合暴露與男性精液質量參數間的關聯。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6490高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(美國Agilent公司); 7080全自動生化分析儀(日本Hitachi公司); Nikon eclipse 50i顯微鏡(北京中儀光科科技發展有限公司); CPA225D電子分析天平(0.000 01 g)(德國Satorious公司); Vortex-Genie2旋渦混合器(美國Scientific Industries公司); Thermo SPE121P離心濃縮系統和CL31R Multispeed離心機(美國Thermo公司)。

甲醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯均為色譜純,β-葡萄糖醛酸酶(85 000 unit/mL),以上均購自德國Merck公司。

對羥基苯甲酸甲酯(MeP)、對羥基苯甲酸乙酯(EtP)、對羥基苯甲酸丙酯(PrP)、對羥基苯甲酸丁酯(BuP)、對羥基苯甲酸正庚酯(HeP)、對羥基苯甲酸芐酯(BzP)、BPA、雙酚B(BPB)、雙酚S(BPS)和三氯生(TCS)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;雙酚AF(BPAF)、雙酚P(BPP)、雙酚Z(BPZ)、2,4-二羥基二苯甲酮(BP-1)、2,2′,4,4′-四羥基二苯甲酮(BP-2)、2,2′-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮(BP-8)和4-羥基二苯甲酮(4-HBP)購自加拿大多倫多TRC公司;雙酚AP(BPAP)購自美國New Haven AccuStandard公司。內標MeP-13C6購自加拿大多倫多TRC公司,內標BPA-d16購自加拿大CDN Isotopes公司,TCS-d3購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

每一類物質對應一種內標:雙酚類,含BPA、BPS、BPB、BPP、BPAP、BPAF和BPZ,內標為BPA-d16;對羥基苯甲酸酯類,含MeP、EtP、PrP、BzP、BuP和HeP,內標為MeP-13C6;羥基苯甲酮類,含BP-1、BP-2、BP-8和4-HB,內標為BPA-d16;三氯生內標為TCS-d3。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取一定量的酚類標準品,溶于甲醇,配制成1.0 mg/mL的單標儲備液。依次吸取18種酚類標準品儲備液于甲醇中,渦旋混勻,配制成100.0 ng/mL混標母液,置于-20 ℃保存。吸取混標母液,以80%甲醇水溶液作溶劑,配制成10和100 ng/mL的2個混合標準應用液[19]。同時準確稱取一定量的內標,溶于甲醇,配制成1.0 μg/mL的內標母液。依次吸取3種內標母液于甲醇中,渦旋混勻,配制成100.0 ng/mL內標工作液。取100 μL空白尿液,加入一定量上述混合標準應用液和內標工作液,經過樣品前處理后,配制成質量濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、80.0 ng/mL的系列標準溶液。

1.3 樣品前處理

方法同前期報道[19]。取200 μL尿液,在其中加入20 μL內標工作液以及50 μL酶工作液(母液用水稀釋100倍)混合。輕微渦旋10 s至混勻后,放置于37 ℃孵育過夜。孵育結束后,每管加入500 μL乙酸乙酯后渦旋10 s混勻。將混合液置于離心機中在4 ℃狀態下15 000 r/min離心10 min。管內溶液發生明顯的分層,取出分界線上層的液體置于EP管中。在剩余的尿液層中繼續加入500 μL乙酸乙酯后渦旋10 s混勻。將混合液置于離心機在4 ℃狀態下15 000 r/min離心10 min。管內溶液發生明顯的分層,取出分界線上層的液體置于EP管中。兩次萃取共同得到的液體為萃取液。將萃取液置于離心濃縮儀,于40 ℃濃縮至近干,加入200 μL 80%甲醇水溶液,渦旋10 s使之溶解充分。將混合液置于離心機中在4 ℃狀態下15 000 r/min離心3 min。最后將上清液轉移到內插管色譜瓶中以備HPLC-MS/MS檢測。

1.4 分析條件

色譜條件 Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm; Agilent);柱溫:40 ℃;流速:0.5 mL/min;進樣量:10 μL。流動相:(A)純水,(B)甲醇。梯度洗脫程序如下:0～5.0 min, 25%B～95%B; 5.0～11.0 min, 95%B; 11.0～11.1 min, 95%B～25%B; 11.1～13.0 min, 25%B。

質譜條件 電噴霧離子源(ESI),負離子模式,多重反應監測(MRM)模式掃描,離子源溫度250 ℃,毛細管電離電壓3 000 V,霧化氣壓力137.895 kPa。其他質譜參數見文獻[19]。

1.5 尿液樣本采集

本研究以在上海市人類精子庫初次捐精的志愿者為研究對象。自2021年12月起招募志愿者,研究對象的納入標準如下:1)18～45周歲;2)上海常住戶口;3)無遺傳病史、性傳播病史、慢性系統性疾病史如高血壓、糖尿病等;4)禁欲時間≥2天。排除標準如下:1)有相關的環境暴露(例如油漆工人、膠廠工人等); 2)有影響精液質量的疾病史(例如疝修補并發睪丸萎縮、睪丸損傷、隱睪、輸精管結扎、附睪炎、精囊炎、精索靜脈曲張、泌尿系統疾病如膀胱炎、糖尿病以及其他內分泌疾病)。本研究研究對象均已簽署項目知情同意書,本研究已通過上海交通大學附屬新華醫院倫理審查委員會批準(批件號:XHEC-C-2020-114-1)。

截至2022年11月,本研究共納入1 035例受試者。排除缺少酚類檢測數據(N=183)、精液指標數據(N=31)和重要協變量(N=22)的樣本后,本研究最終納入799例樣本進行分析。受試者尿液樣本于入組當日采集,并置于-20 ℃冰箱冷凍直至檢測。

1.6 尿樣中酚類物質檢測質量控制

使用兒童尿液作為空白基質用于方法的優化、驗證和質量控制。兒童尿液采集于上海優生兒童隊列隨訪期,將尿樣(女生與男生的比例為3∶4)混合后進行檢測,發現其中目標物濃度穩定且痕量(MeP 0.23 ng/mL, EtP 0.04 ng/mL, PrP 0.11 ng/mL, BPA 0.13 ng/mL,其他均

同時為了監測整個過程的本底,每間隔20個樣品設置兩個空白樣(超純水和兒童尿液)。為確保方法的穩定性,每間隔20個樣品設置兩個質量控制濃度點,包括低添加水平質量控制(QClow, 1 ng/mL)和高添加水平質量控制(QChigh, 10 ng/mL)。

1.7 精液質量和尿液中肌酐濃度檢測

精液標本通過手淫收集,采集前需禁欲3～7天。精液按照標準方案進行處理。精液分析按照世界衛生組織(WHO)《人類精液檢驗實驗室手冊》的建議進行。分析工作由人工完成。為減少精子特征評估中的差異,每次對每個精液樣本分析兩次。研究期間,進行了內部質量控制,以確保技術人員的結果之間沒有明顯差異。通過精液分析儀測量精液指標,包含精子濃度、精子總數、精液體積和精子前向運動百分比。精液量用刻度吸管進行評估。為了評估精子濃度和活力,將10 μL混合均勻的精液放入干凈的標記室,用蓋玻片輕輕蓋住,然后在總放大倍率為×200的條件下進行檢查。在顯微鏡視野中的100個方格中隨機掃描10個,用細胞計數器記錄精子數量。精子總數由精液量×精子濃度計算得到。在這項研究中,進行了內部質量控制,以確保精液參數之間沒有顯著差異。

尿肌酐濃度按照肌氨酸氧化酶法使用全自動生化分析儀檢測,用于校正酚類濃度。

1.8 統計分析

采用多元線性回歸模型分析單污染物與精液質量間的關聯,并通過文獻檢索納入可能的混雜因素進一步調整。納入的協變量為:年齡(連續型變量)、身體質量指數(BMI, 連續型變量)、教育水平(分類變量)、禁欲時間(分類變量)、吸煙(分類變量)、飲酒(分類變量)和尿液肌酐濃度(連續型變量)。此外,我們還進一步將污染物濃度分成四分位,分別是:Q1 (quantile 1,即P0～P25), Q2 (quantile 2,即P25～P50), Q3 (quantile 3,即P25～P75)和Q4 (quantile 4,即P75～P100)。以Q1作為對照,分析單污染物濃度與精液指標間的關聯。

由于污染物間存在共線性,為了探索多污染物混合暴露與精液質量間的關系,本研究進一步采用加權分位數之和模型(weighted quantile sum, WQS)探索多污染物與精液質量間的關聯。WQS模型是一種可以計算多種環境化合物累積混合效應的模型,并可以估計每種污染物的加權貢獻值,有助于確定混合物中貢獻最大的化合物[20,21]。該模型已經廣泛應用于環境流行病學研究[22-24]。由于并不確定酚類對精液質量影響的正負方向,我們分別對正負方向進行分析。

所有分析均使用R 4.1.1軟件實現,R包“gWQS”用于實現WQS模型。

2 結果與討論

2.1 人口學特征

本研究中799名研究對象基本人口學特征如表1所示,平均年齡和BMI分別為26.11歲和22.92 kg/m2,大部分研究對象報告從不吸煙(72.6%)和偶爾飲酒(64.8%)。共有517(64.7%)名研究對象有本科及以上學歷。

表1 研究對象的人口學特征

2.2 尿液中酚類物質的濃度分布

研究對象尿液中酚類物質的濃度分布見表2。其中,除BPAF、BPZ、BzP、BuP、HeP、BP-1、BP-2、BP-8、4-HBP外,其他9種物質的檢出率均大于80%,將這9種化合物進一步納入后續數據分析。

表2 尿液中酚類化合物的質量濃度分布及檢出率

2.3 尿液中單一酚類化合物濃度與精液質量的關聯分析

如表3所示,未調整和調整后的多元線性模型結果提示,尿液中EtP濃度與精子濃度、精子總數和精液體積呈顯著負相關(P<0.05)。如圖1所示,當將酚類濃度按四分位分類后,與Q1組相比,EtP濃度Q4組和MeP濃度Q3組的男性精子濃度顯著降低(P<0.05)。此外,與Q1相比,EtP濃度Q2、Q3和Q4組均與精子總數呈現顯著的負相關。本研究表明,對羥基苯甲酸酯類化合物可能與男性精液質量下降顯著相關,這與一項既往研究[25]結果類似:生育與環境縱向調查(The Longitudinal Investigation of Fertility and the Environment, LIFE)招募了501對夫婦,分析其丈夫尿液中對羥基苯甲酸酯類濃度與精液質量的關系,結果顯示,EtP與精子數量、精子活力之間存在反向關系,MeP與精子活力低之間存在顯著關聯。然而,另外幾項人群研究并未發現對羥基苯甲酸酯類化合物與精液質量間的顯著關聯[26,27]。本研究并未發現雙酚類化合物和三氯生與男性精液質量的關聯。該結果與幾項同樣在普通人群中開展的研究相似[14-16]。然而,Meeker等[12]的一項橫斷面研究測量了190名尋求不育治療的男性尿液中BPA濃度,其研究結果提示BPA濃度與精子濃度、形態異常和精子活力呈負相關。Vitku等[28]的研究結果與其一致。Vitku等在不育男性中測量其血漿和精液中BPA濃度,其研究表明隨著男性不育程度的提高,血漿中BPA水平增加,與健康男性相比,輕度和中度不育癥男性血漿BPA水平更高,同時BPA濃度也與精子數量、精子形態呈負相關。Lassen等[29]的研究結果僅發現了尿液中BPA與精子活力呈負相關。造成這種不一致結果的原因可能是由于人群特征、樣本量和酚類物質暴露水平的差異。

表3 尿液中酚類物質含量與精液質量參數的多元線性回歸結果

圖 1 尿液中酚類濃度(四分位)與精液質量參數的多元線性回歸結果Fig. 1 Associations between phenol concentrations (quantiles) in urine samples and semen quality parameters, as determined by multiple linear regression

表4 WQS指數與精液質量參數的WQS回歸模型結果

對羥基苯甲酸酯與精液質量之間的負向關聯可能與酚類物質的內分泌干擾特性相關。研究表明,對羥基苯甲酸酯類化合物可作為內分泌干擾物,具有與內源性雌激素(17β-雌二醇)或抗雄激素類似的活性,導致人體內促性腺激素和睪丸睪酮水平發生變化[30]。因此,它們可能會干擾正常的精子生成過程。另一項研究[31]提示了對羥基苯甲酸酯導致精液質量下降的另一可能潛在機制。該研究對三周齡雄性Sprague-Dawley大鼠(n=8)采取對羥基苯甲酸丁酯灌胃染毒(劑量為1 000 mg/kg)進行研究,發現對羥基苯甲酸丁酯可能通過破壞Sertoli細胞的波形蛋白絲導致精細胞過早脫離Sertoli細胞。由于失去了Sertoli細胞提供的營養支持,過早釋放的精細胞可能會發生凋亡。此外,對羥基苯甲酸酯類化合物還可能通過誘導過量活性氧產生,破壞精子發生[32]。

圖 2 與精子濃度相關的WQS指數中各酚類的權重Fig. 2 Weighted quantile sum (WQS) model regression index weights for sperm concentration

2.4 酚類混合暴露

本研究采用WQS模型進一步探索酚類化合物的混合暴露男性生殖健康風險,結果如圖2和表4所示,WQS指數與精子濃度呈顯著的負相關(P<0.05)。在調整了尿肌酐和潛在的混雜因素后,WQS指數每增加1個單位,精子濃度的對數值減少0.103個單位。其中MeP和EtP是影響精子濃度權重最高的化合物。既往探索酚類化合物混合暴露對男性生殖系統毒性的相關研究十分有限。一項體外研究探討了對羥基苯甲酸酯類混合物(MeP、EtP、PrP、BuP和iso-BuP)的雄激素受體(AR)拮抗作用。該研究結果表明,對羥基苯甲酸酯混合物對AR受體的拮抗作用高于單種化合物作用,提示混合物毒性會產生一定的相加效應[33]。這個體外研究的結果與我們在人類流行病學研究中的發現相類似,WQS模型得出的估計值高于單一污染物分析得出的估計值。由于人類處于多種污染物混合暴露中,混合暴露在人群中的健康影響不容忽視,亟需進一步深入研究。

相較于先前的研究,本研究具有以下幾點優勢。首先,本研究具有較大的樣本量,確保了研究的統計效能。其次,我們的研究對象來自捐精志愿者,他們對自己的精液質量和環境酚類暴露情況并不了解,可以有效地避免選擇偏倚。此外,我們的研究揭示了酚類化合物混合暴露與男性精液質量的潛在關聯。

然而,本研究尚有一些局限性。首先,本研究是一項橫斷面研究,因此很難對暴露和結果進行因果推斷。其次,酚類物質的濃度是通過單點尿液樣本來測量的。由于酚類物質半衰期短,從體內消除速度較快,因此可能存在暴露錯分的偏倚。同樣地,單次精液質量結果也可能存在相同的偏倚。然而,Mahalingaiah等[34]的研究表明,單一尿液樣本可用于預測BPA的長期(數周至數月)暴露。既往的研究[35]也表明,在流行病學研究中,一份精液樣本足以評估研究對象的精液質量。此外,尿液中酚類濃度并不能直接代表男性生殖器官的暴露狀態,未來仍需更多研究進行進一步探索。

3 結論

本研究發現,育齡男性普遍暴露于酚類物質中。酚類暴露可能與男性精液質量下降相關,主要表現在降低精子濃度和精子總數。后續應進一步開展大樣本的前瞻性研究,探索酚類化合物暴露對男性生殖健康的影響。