聚多巴胺仿生法制備的聚己內酯螺釘羥基磷灰石涂層對兔前交叉韌帶重建后骨整合的影響

任鋮真,畢方剛,王志遠,王亞飛,李鵬舉,田 科

1)鄭州大學第一附屬醫院骨科六病區 鄭州 450052 2)西安市紅會醫院關節外科膝關節病區 西安 710000

前交叉韌帶位于膝關節內,是膝關節重要的穩定結構,主要作用為限制脛骨向前過度移位和極端旋轉[1]。前交叉韌帶損傷會影響患者的運動能力,若不及時治療,還會導致骨關節炎和半月板撕裂。目前,一般采用前交叉韌帶重建術治療前交叉韌帶損傷[2],界面螺釘是前交叉韌帶重建術中移植物固定的常見形式。早期固定螺釘的主要材質是金屬合金,但金屬具有生物惰性,很難與骨組織結合,導致種植體逐漸松動[3]。聚己內酯(polycaprolactone,PCL)是一種可吸收的脂質聚酯材料,因其可控性和可降解性而被考慮用作骨再生、骨修復的生物支架,但PCL是一種疏水高分子聚合物,不利于細胞附著[4],因此需要利用表面改性技術以實現牢固的骨整合。羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)是一種具備生物活性的磷酸鈣,構成了骨組織的大部分無機成分[5],生物相容性和生物醫用性較高,可在體內緩慢降解,引導骨再生,從而獲得最佳的機械強度[5-6]。研究[7]發現多巴胺在弱堿性環境下通過相互氧化聚合形成的聚多巴胺幾乎可在任何形狀和種類的基底材料表面和內部制備出HA涂層。本實驗利用聚多巴胺仿生法在3D打印的PCL螺釘表面制備HA涂層,并通過動物實驗探究HA涂層對前交叉韌帶重建術后骨整合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器12周成年雄性新西蘭大白兔20只,體重(2.6±0.5) kg,購于鄭州大學實驗動物中心,雙下肢活動度良好,無紅腫和畸形,前抽屜實驗和Lachman實驗均為陰性。動物實驗方案均符合鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會要求,并獲審核通過(倫理審核編號:KY-2021-0235)。HA(上海華藍化學科技有限公司),多巴胺、聚甲基丙烯酸甲酯(美國Sigma-Aldrich公司),戊巴比妥鈉(德國MERCK公司),1.5倍模擬體液(青島捷世康生物科技有限公司);邁普醫療3D打印機(河南省3D打印中心),Micro-CT攝影系統(瑞士SCANCO Medical AG公司),掃描電鏡(武漢賽維爾生物科技有限公司),Instron電子萬能材料試驗機(鄭州大學物理學院提供)。

1.2 含HA涂層的PCL螺釘的制備通過3D打印機設計、制作直徑3.0 mm、長14.5 mm、多孔PCL螺釘(圖1A)。根據文獻[5]方法采用聚多巴胺仿生法制備HA涂層。首先將鹽酸多巴胺溶解于10 mmol/L Tris-HCl緩沖液中制備2 g/L的多巴胺溶液并將其pH值調整為8.5,燒杯中加入多巴胺溶液以及用乙醇洗凈的PCL螺釘,置于37 ℃恒溫搖床中孵育24 h,取出螺釘,并用大量去離子水反復沖洗以洗去附著的鈣磷離子,得到含有聚多巴胺涂層的螺釘。將含有聚多巴胺涂層的PCL螺釘與1.5倍模擬體液加入燒杯中并置于37 ℃恒溫搖床中孵育72 h,取出螺釘并用大量去離子水沖洗,HA涂層制備完成(圖1)。掃描電鏡下測量含和不含HA涂層的PCL螺釘的孔隙直徑及孔隙率。

A:3D打印模型圖;B:PCL螺釘大體觀;C:掃描電鏡下PCL螺釘微觀結構;D:含HA涂層的PCL螺釘大孔;E:掃描電鏡下含HA涂層的PCL螺釘表面觀。

1.3 實驗動物分組兔雙側后肢均制備前交叉韌帶重建模型,左右側隨機植入含HA涂層的PCL螺釘(實驗組)和不含HA涂層的PCL螺釘(對照組)并標記,各20個。

前交叉韌帶重建模型的構建:實驗動物用30 g/L戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)靜脈注射麻醉,雙側后肢常規備皮,用碘和體積分數70%乙醇的混合溶液清洗消毒,于膝關節正中做3 cm縱向皮膚切口,依次切開皮膚筋膜層,于膝關節脛骨內髁找到半腱肌肌腱,沿兩端盡可能長地游離切取肌腱,兩端用手術縫合線編織固定,置于生理鹽水中用于后續移植;髕骨外翻脫位后暴露關節腔,明確前交叉韌帶止點后,于兩端切斷前交叉韌帶;分別于股骨、脛骨止點沿前交叉韌帶走行方向以3.0 mm鉆頭鉆孔制作股骨、脛骨隧道,將制備好的肌腱移植物穿過骨隧道,助手暫時穩定兩端,沿股骨外髁植入經環氧乙烷消毒的界面螺釘用于固定移植物(圖2),隨后將移植物脛骨端加強固定于骨膜上,充分止血后沖洗關節腔,縫合創面;術后自由活動,肌內注射青霉素10萬U/(kg·d),連續5 d。

A:取出半腱肌肌腱;B:植入界面螺釘。

1.4 標本收集術后6、12周分別采用高濃度二氧化碳窒息法處死10只兔,使用手術刀剔除膝關節附近軟組織,離斷后交叉韌帶及內外側副韌帶,用手工鋸切下股骨近端、脛骨遠端,制備股骨-前交叉韌帶-脛骨復合物標本,用于后續觀察和檢測。

1.5 組織學觀察隨機抽取5只兔的股骨-前交叉韌帶-脛骨復合物標本,于40 g/L多聚甲醛中固定72 h后,經乙醇溶液梯度脫水、聚甲基丙烯酸甲酯包埋后,使用硬組織切片機將骨組織切割成50 μm厚薄片,Masson染色后于光鏡下觀察螺釘與骨組織界面。

1.6 Micro-CT掃描剩余5只兔的10個股骨-前交叉韌帶-脛骨復合物標本放入-80 ℃冰箱保存,測試前放入4 ℃冰箱內過夜融化。采用Micro-CT掃描后使用軟件自動分析計算距關節面5 mm、骨道周圍2 mm以內股骨骨道的骨長入參數:骨體積分數、骨小梁數量、骨小梁分離率、骨密度。

1.7 生物力學測試Micro-CT測試結束后,將股骨與脛骨分別用縫線固定在Instron電子萬能材料試驗機夾具上,測定預載1 N、拉伸速率15 mm/min條件下韌帶斷裂時的最大拉力峰值。

1.8 統計學處理應用SPSS 22.0處理數據。采用重復測量數據的方差分析分析涂層和時間對骨體積分數、骨小梁數量、骨小梁分離率、骨密度及最大拉力峰值的影響,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩種螺釘的基本參數掃描電鏡測得不含HA涂層的PCL螺釘大孔長(470±25) μm、寬(406±29) μm、孔隙率(45±5)%,含HA涂層的PCL螺釘大孔長(375±20) μm、寬(310±27) μm、孔隙率(41±6)%。

2.2 傷口愈合情況和Masson染色結果見圖3。植入螺釘后兔切口均愈合良好,未出現紅腫、流液等排異反應。術后6周,對照組螺釘與骨組織間有薄層纖維組織及少量新生骨形成,實驗組HA 涂層下可見少量皮質骨上有新生骨形成;術后12周,實驗組和對照組均可見大量新生骨組織,但實驗組新生骨組織浸潤深度和量均明顯優于對照組。

A1、A2:分別為對照組6周和12周;B1、B2:分別為實驗組6周和12周;藍色為新生骨組織,紅色為成熟骨組織。

2.3 Micro-CT觀測結果術后6周,兩組骨隧道內新生骨較少,新生骨小梁稀疏,術后12周,兩組新生骨均較6周時增多,新生骨小梁排列緊密;術后6、12周,實驗組均優于對照組。具體指標見表1。與術后6周相比,兩組術后12周骨體積分數、骨小梁數量、骨密度均升高,骨小梁分離率降低;實驗組以上指標均優于對照組。

表1 兩組術后6周和12周Micro-CT觀測指標的比較(n=5)

2.4 生物力學測試結果見表2。由表2可知,6周時螺釘與骨界面的愈合強度較小,12周時愈合強度增大,且實驗組均高于對照組。

表2 兩組最大拉力峰值比較(n=5) N

3 討論

理想的骨植入材料應能夠提供早期負重又能加快骨整合,其中制備HA涂層是促進骨整合的常用方法。目前,HA涂層的制備尚無公認標準。Jalali等[8]利用溶膠-凝膠法在鈦種植體表面制備HA和二氧化鈦中間層介孔薄膜,生成的HA復合材料涂層為多孔連續結構,具有良好的滲透性,過程易控制,操作方便,但是凝膠干燥過程中易開裂,較高的孔隙率導致涂層與基體的結合強度降低;秦杰等[9]利用微弧氧化技術制備HA涂層,該技術得到的HA涂層與基底材料貼合良好,可在復雜的幾何表面及內部形成均勻的涂層,但微弧氧化技術成本高昂,不適合大量制備。聚多巴胺仿生法操作簡單、價格低廉,是近年來的研究熱點之一。研究[7,10-13]發現該方法幾乎可在任何形狀、任何材質的基底材料上形成聚多巴胺,且形成的HA涂層與基底材料結合緊密。此外,研究[14-15]發現利用聚多巴胺改性基底,可顯著改善細胞的貼附能力,而且有利于固定成骨因子,使得細胞的增殖、分化以及成骨基因表達功能得到改善;聚多巴胺本身還能夠作為中間層吸附各種離子、生物大分子及藥物等。

影響聚多巴胺涂層形成的因素有很多,如浸泡時間、溫度、Tris-HCl緩沖液pH值、多巴胺質量濃度等[16-17]。有研究[9,17]表明制備聚多巴胺涂層的最佳多巴胺質量濃度為2 g/L、Tris-HCl緩沖液pH為8.5,此時制備出的聚多巴胺涂層為規則圓球狀、大小均一的聚多巴胺納米球,因此本實驗將PCL螺釘浸泡在2 g/L的多巴胺Tris-HCl溶液中(10 mmol/L,pH 8.5)來制備聚多巴胺涂層,然后將含聚多巴胺涂層的PCL螺釘轉移至1.5倍模擬體液中,聚多巴胺中的兒茶酚基團和模擬體液中的金屬離子強烈結合,鈣離子和磷酸鹽離子共沉淀形成HA涂層。研究[9,14]發現該方法制備的HA涂層在強超聲作用1 h后仍然保持穩定,HA仍然牢固地附著在基底材料上。本研究將聚多巴胺仿生法制備的含有HA涂層的PCL螺釘用于兔后肢前交叉韌帶重建術,術后通過Masson染色、Micro-CT和生物力學測試等手段觀測,結果顯示術后6、12周,HA涂層具有加快周圍骨組織長入、加強骨愈合強度的作用,同時材料植入后切口均愈合良好,未出現紅腫、流液等排異反應,說明HA涂層生物相容性好,能夠促進前交叉韌帶重建術后骨整合,提高界面螺釘生物力學穩定性,HA良好的生物活性可能在PCL螺釘置入后早期的生物力學穩定性中起主導作用。