玉米須總黃酮抗大鼠高尿酸血癥及腎臟保護作用

黃宇涵,徐 莎,房 偉,宋 瑋,賀雅靜,張玉霞,馬振勇

1)商丘醫學高等?？茖W校藥學院 河南商丘 476005 2)商丘醫學高等?？茖W?；A醫學院 河南商丘 476005 3)河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450000 4)商丘市第一人民醫院病理科 河南商丘 476100 5)商丘醫學高等?？茖W校臨床醫學院 河南商丘 476005

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)主要由體內嘌呤代謝紊亂,尿酸(uric acid,UA)生成增加和(或)排泄減少引起。長期的高UA水平會誘發痛風性關節炎,導致腎臟損傷[1]。近年來研究[2]顯示,我國HUA患病率已高達18.4%,且逐漸年輕化。目前,控制HUA主要依靠別嘌呤醇、苯溴馬隆、非布司他等藥物,但長期應用可誘發超敏變態反應綜合征、胃腸道功能失調、肝臟毒性等不良反應[3-5]。因此,尋找無毒副作用的抗HUA藥物已成為藥學研究的一個熱點[6-7]。

玉米須是禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱頭,是傳統的中藥材,味甘、性平、無毒,具有利尿、解熱、平肝、利膽等作用。玉米須總黃酮(total flavonoids from corn silk,TFCS)是玉米須的主要功能成分[8],可用于治療糖尿病、高血脂、肝臟腫瘤等疾病[9-10]。研究[11-12]發現TFCS可降低血清UA水平,但具體機制尚不明確。本研究建立HUA大鼠模型,分析TFCS對UA合成關鍵酶活性及代謝相關轉運蛋白表達的影響,探討TFCS對HUA的治療價值及安全性,以期為進一步開發抗HUA藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠60只,體重180～200 g,由鄭州市華興實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(豫)2019-0002。溫度20～25 ℃,濕度50%～60%,每日照明12 h,單籠適應性飼養7 d。

1.2 主要試劑與儀器TFCS浸膏粉,由貴州中醫藥大學藥學院實驗室提取,使用紫外光分光度法(中國藥典總黃酮測定方法)測量,以蘆丁為對照的總黃酮的質量分數為42.86%,實驗時用蒸餾水溶解配制成所需濃度,現用現配。

乙胺丁醇(批號S31547)、腺嘌呤(批號S18012)、別嘌呤醇(批號B27249)均購自上海源葉生物科技有限公司,UA、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黃嘌呤氧化酶(XOD)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,HE染色試劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。UA轉運體1(URAT1)一抗購自Affinity公司,HRP標記的山羊抗兔二抗購自Bioworld公司。PBS購自北京索萊寶科技有限公司,BSA購自上海雅酶生物科技有限公司,DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司,反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自安諾倫(北京)生物科技公司,RNA提取試劑購自上海雅酶生物科技有限公司。核酸定量儀為賽默飛世爾科技公司產品,LightCycler480型qPCR儀為羅氏公司產品。

1.3 實驗分組和HUA大鼠模型的建立60只SD大鼠適應性飼養7 d后,隨機分成正常對照組,模型組,別嘌呤醇組和TFCS低、中、高劑量組,每組10只。除正常對照組外,其余各組給予250 mg/(kg·d)乙胺丁醇和100 mg/(kg·d)腺嘌呤的混懸液灌胃,用于構建HUA大鼠模型[7],正常對照組給予相同體積的生理鹽水,14 d后檢測大鼠血清UA水平,參考文獻[13]的標準判斷是否成功建立HUA大鼠模型。造模成功后,別嘌呤醇組給予50 mg/(kg·d)別嘌呤醇灌胃,TFCS低、中、高劑量組分別給予0.5、1.0、2.0 mg/(kg·d) TFCS灌胃,正常對照組和模型組給予等體積的生理鹽水,共灌胃14 d。

1.4 大鼠一般情況觀察每天觀察大鼠精神狀態、毛色、墊料及飲食等情況,測量并記錄給藥后第1、5、10、14天大鼠的體重。

1.5 大鼠血清中UA、Cr、BUN、XOD及尿液中UA水平檢測末次給藥后當天,收集大鼠24 h尿液,酶比色法檢測UA水平。末次給藥后第2天,大鼠乙醚麻醉后經心臟取血并分離血清,酶比色法檢測UA水平,肌氨酸氧化酶法檢測Cr水平,脲酶法檢測BUN水平,雙抗體夾心法測定血清XOD水平。

1.6 大鼠腎臟指標檢測末次給藥后第2天處死大鼠,取其左側腎臟,一部分用40 g/L多聚甲醛固定,另一部分液氮急凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.6.1腎組織形態觀察 取經40 g/L多聚甲醛固定的大鼠腎臟組織,乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片、HE染色、中性樹膠封片,光鏡下(×400)觀察組織形態學改變。

1.6.2腎組織中URAT1蛋白表達的免疫組化SP法檢測 取經40 g/L多聚甲醛固定的大鼠腎組織,乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片、中性樹膠封片,3 μm厚連續切片。血清封閉30 min后加URAT1一抗(按1∶700稀釋),4 ℃孵育過夜;加HRP標記的山羊抗兔二抗,孵育50 min。陰性對照使用PBS代替一抗。DAB顯色,蘇木精復染。細胞核呈棕黃色為URAT1表達陽性細胞。利用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統半定量URAT1蛋白的表達[6],結果以平均積分光密度表示。

1.6.3腎組織中GLUT9 mRNA的qRT-PCR法檢測 取冷凍保存的腎組織,用Trizol提取總RNA,微量紫外分光光度計測定其濃度及純度,反轉錄成cDNA。使用qRCR儀進行基因擴增。GLUT9上游引物序列: 5’-GGGACTTTGGACGAGACGTT-3’,下游引物序列:5’-TGGTCGTAAACCCAGC CATC-3’,產物大小為178 bp;內參β-actin上游引物序列:5’-TGACGATATCGCTGCGCTC-3’,下游引物序列:5’-CAGTTGGTGACAATGCCGTG-3’,產物大小為178 bp。反應體系20 μL:上、下游引物均1 μL,2×NovoStart SYBR High-Sensitivy SuperMix 10 μL,模板1 μL,RNase Free Water 7 μL。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,40個循環;最終72 ℃ 10 min中止。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達,實驗重復3次。

1.7 統計學處理采用SPSS 26.0分析。6組血清UA、Cr、BUN、XOD水平,尿液UA水平,以及URAT1蛋白、GLUT9 mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析和Dunnett-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 6組大鼠一般情況比較6組大鼠體重變化情況見圖1。給藥后第1、5、10、14天,與正常對照組大鼠比較,其他各組體重降低; 給藥后第10、14天,與模型組比較, TFCS中劑量組大鼠體重增加。實驗過程中正常對照組大鼠精神狀態良好,毛色光滑,活動自如。模型組進食較少,精神較差,毛色晦暗,排尿增多,墊料潮濕。與模型組比較,別嘌呤醇組及TFCS各劑量組大鼠的精神狀態及毛色等情況好轉。

F組間=12.870,P<0.001;F時間=16.495,P<0.001;F交互=12.688,P<0.001;*:與其他組比較,P<0.05;#:與模型組比較,P<0.05。

2.2 6組大鼠UA及XOD水平比較與正常對照組比較,模型組血清UA、XOD水平升高,尿液UA水平降低;與模型組比較,別嘌呤醇組與TFCS低、中、高劑量組血清UA、XOD水平降低,尿液UA水平升高(表1)。

表1 6組大鼠血清UA、XOD和尿液UA水平比較(n=10)

2.3 6組大鼠血清Cr和BUN水平比較與正常對照組比較,模型組大鼠血清Cr及BUN水平升高;與模型組比較,別嘌呤醇組與TFCS低、中、高劑量組血清Cr及BUN水平均降低(表2)。

表2 6組大鼠血清Cr和BUN水平比較(n=10)

2.4 6組大鼠腎組織病理學變化正常對照組大鼠腎小球、腎小管結構正常,邊界清晰。模型組大鼠腎小球腫脹;腎小管上皮邊界不清,細胞腫脹、變性,腎間質可見炎性細胞浸潤。與模型組比較,別嘌呤醇組及TFCS各劑量組大鼠腎小管上皮損傷程度減輕,TFCS高劑量組大鼠腎組織損傷最輕,其次是TFCS中劑量組和別嘌呤醇組(圖2)。

A:正常對照組;B:模型組;C:別嘌呤醇組;D、E、F:分別為TFCS低、中、高劑量組。

2.5 6組大鼠腎組織URAT1蛋白和GLUT9 mRNA表達比較與正常對照組比較,模型組大鼠URAT1蛋白和GLUT9 mRNA表達升高;與模型組比較,TFCS低、中、高劑量組及別嘌呤醇組大鼠URAT1蛋白和GLUT9 mRNA表達降低(圖3、表3)。

表3 6組大鼠腎組織URAT1蛋白和GLUT9 mRNA表達水平的比較(n=10)

A:正常對照組;B:模型組;C:別嘌呤醇組;D、E、F:分別為TFCS低、中、高劑量組。

3 討論

本研究利用乙胺丁醇和腺嘌呤復制HUA大鼠模型,分析TFCS對HUA大鼠的影響,結果顯示,TFCS能夠降低HUA大鼠的血清UA水平,促進腎臟UA排泄。此外,HUA模型大鼠腎組織發生病理變化,TFCS可以降低血清Cr及BUN水平,改善腎組織損傷,對腎功能有一定的保護作用。

HUA的病因與機體內UA的合成量增加和(或)排泄降低相關。動物和人的肝臟均能合成XOD并釋放到血液中,XOD是機體內合成UA的關鍵酶。腺嘌呤核苷首先被轉化為次黃嘌呤,XOD將次黃嘌呤氧化成黃嘌呤,繼而又將黃嘌呤氧化成UA。梁圓等[14]發現抑制XOD活性能夠有效降低小鼠UA水平。本研究結果顯示,TFCS能夠提高HUA大鼠的抗氧化能力,推測可能與抗氧化活性物質有關系。

腎臟是機體排泄UA的主要器官,腎小管上皮通過UA轉運蛋白參與UA鹽的代謝,對UA鹽進行分泌和重吸收。UA轉運蛋白是促進機體UA排泄藥物的主要作用靶點[15],URAT1和GLUT9是腎小管上皮重吸收UA鹽的主要運載體。有機和無機陰離子可以在腎小管上皮與管腔之間形成電化學梯度或者濃度差,URAT1利用所產生的濃度差將腎小管管腔內UA重吸收到上皮細胞,完成重吸收的第一步;同時,GLUT9對UA有高親和力,可以將UA從腎小管管腔重吸收至上皮細胞內,也能將細胞內的UA轉運到腎間質,完成重新收入血的過程[15]。譚珊等[16]研究表明,通過下調HUA小鼠腎臟URAT1的表達水平,可以有效降低UA水平,并改善HUA引起的腎損傷。本研究結果顯示TFCS各劑量組的大鼠腎組織URAT1蛋白和GLUT9 mRNA表達水平降低,這與既往文獻報道[12]結果一致。本研究結果亦顯示,TFCS對于HUA大鼠腎功能有一定的保護作用,推測可能與其抗炎作用及促進UA排泄有關。

綜上所述,TFCS可以降低XOD水平,減少UA生成;抑制腎組織URAT1蛋白和GLUT9 mRNA表達,提高腎臟的UA排泄量,有效調控血清UA水平,從而達到治療HUA的目的。