河南省育齡人群中4種常見遺傳代謝病孕前攜帶者篩查

王艷麗,王 強,孔祥東,劉莉娜,劉國濤,張超楠,孔明月,祁少可,位婷婷

1)國家衛生健康委員會出生缺陷預防重點實驗室;河南省人口缺陷干預技術研究重點實驗室;河南省生殖健康科學技術研究院優生遺傳研究實驗室 鄭州 450002 2)鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心 鄭州 450052

遺傳代謝病是因編碼體內某些酶的基因發生突變造成遺傳缺陷,導致機體生化代謝紊亂,引發一系列臨床癥狀的一組疾病[1],常見的有500～600種,總體患病率高達1/3 000[2],大多數無有效治療手段。我國婦幼機構雖然已經開展了新生兒的遺傳代謝病篩查,但屬于三級預防。絕大多數遺傳代謝病為常染色體隱性遺傳,患兒父母多表型正常。對育齡夫婦進行遺傳代謝病攜帶者篩查,可以判別出可將遺傳代謝病傳遞給后代的高風險夫婦,提前評估生育風險,做好改善預后和提高患兒生活質量的充分準備。

本研究選擇我國北方地區較常見的4種遺傳代謝病高苯丙氨酸血癥(PAH、PTPS基因),肝豆狀核變性(ATP7B基因),甲基丙二酸血癥(MMACHC、MUT基因),眼皮膚白化病(TYR、OCA2基因),采用高通量測序技術對河南省612對育齡夫婦進行7個致病基因攜帶者篩查,探討育齡人群中遺傳代謝病致病基因的攜帶情況,同時為其遺傳咨詢和生育指導提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象以2022年7月至12月參加河南省孕前優生健康檢查項目的育齡夫婦為研究對象。為保證樣本的全省代表性,考慮到不同基因在不同地區、不同性別人群中分布的特點,兼顧流行病學調查的需求,充分考慮分層因素、失訪等因素的影響,根據樣本量計算公式[3],計算樣本量。設計效率取1.30,α=0.05。為滿足各個基因疾病所需的樣本量,文獻報道4種遺傳代謝病最低攜帶率為2.5%[4],最大容許誤差取1%時,所需樣本量約為1 217人。最終選取河南省17個地市作為項目地區,每個地區選取1個縣,每個縣選取4個鄉,每個鄉隨機抽取9對夫婦,共調查612對夫婦。納入標準:夫妻雙方均無已知的單基因疾病家族史,自愿參與本研究并簽署知情同意書,接受并能夠配合研究工作。排除標準:患有嚴重心、肝、腎等疾病,不適合懷孕或不孕者;近期計劃長期外出者;參加其他臨床遺傳學觀察者。本研究獲河南省生殖健康科技學院倫理委員會批準(批準號HIRHST-IRB-2022-10)。

1.2 致病基因測序采集育齡夫婦靜脈血2～3 mL,EDTA抗凝,-20 ℃冰箱中保存備用。使用全血DNA磁珠法提取試劑盒(中國志昂生物)抽提外周血白細胞基因組DNA,采用QubitTMdsDNA HS試劑盒(美國生命技術公司)測定DNA濃度。采用二代測序技術對7個致病基因進行篩查?；蛐蛄衼碜詇ttp://www.ensembl.org.和http://genome.ucsc.edu,針對外顯子、外顯子-內含子交界處設計雙向探針。使用Ion AmpliSeqTMLibrary 2.0試劑盒進行文庫構建,基于Dynabeads MyOne Streptavidin C1珠粒試劑盒和Ion OneTouch ES儀進行模板富集和分離,在Ion PGM測序平臺上使用Ion PGMTMSequencing 200 v2試劑盒進行測序。

1.3 測序數據的分析采用Ion Torrent Suite 5.18軟件處理測序數據,并應用序列比對插件、coverage插件、varrentcaller插件分析及注釋變異,并與NCBI dbSNP數據庫、Hapmap數據庫和千人基因組計劃數據庫進行比對。通過檢索ClinVar數據庫(https://www.ncbi.nlm.gov/clinvar/)、人類基因突變數據庫(Human Gene Mutation Database,HGMD,http://www.hgmd.org/)、VarCard數據庫(http://varcards.biols.ac.cn/)及ACMG指南來評估變異的致病性。

1.4 統計學處理根據測序結果統計4種常見遺傳代謝病雜合子的攜帶率,根據雜合子攜帶率,應用Hardy-Weinberg定律估算河南省4種遺傳代謝病的患病率。

2 結果

2.1 河南省4種遺傳代謝病致病基因攜帶情況612對夫妻共1 224人中,致病基因攜帶者107人,總體攜帶率為8.74%;其中1種遺傳代謝病致病基因攜帶者102人,2種遺傳代謝病致病基因攜帶者5人;PAH、PTPS、ATP7B、MMACHC、MUT、TYR、OCA2基因攜帶率分別為2.53%、0.33%、2.04%、1.72%、0.74%、1.63%、0.16%。

1 224人中各致病基因攜帶率的地域分布情況見表1。致病基因總攜帶率豫北地區最高,豫中地區最低。其中PAH、ATP7B、MUT和TYR基因攜帶率最高的均是豫北地區(0.98%、0.82%、0.33%和0.57%,PTPS基因攜帶率最高的是豫南地區(0.25%),MMACHC基因攜帶率最高的是豫東地區(0.65%)。

表1 1 224人各致病基因攜帶率的地域分布情況 人(%)

2.2 河南省4種遺傳代謝病致病變異檢出情況共檢出的致病變異112個,每個個體攜帶0～2個,平均每人攜帶0.092個致病變異。高苯丙氨酸血癥致病變異檢出最多,PAH基因致病變異檢出19種,其中c.721C>T檢出率最高(0.41%,5/1 224);PTPS基因致病變異檢出2種,分別是c.166G>A和c.259C>T,檢出數均為2人。肝豆狀核變性ATP7B基因致病變異檢出9種,其中c.2333G>T檢出率最高(0.49%,6/1 224)。甲基丙二酸血癥MMACHC基因致病變異檢出10種,其中c.609G>A檢出率最高(0.41%,5/1 224);MUT基因致病變異檢出6種,其中c.1663G>A檢出率最高(0.33%,4/1 224)。眼皮膚白化病TYR基因致病變異檢出9種,其中c.929_930insC9檢出率最高(0.57%,7/1 224);OCA2基因僅檢出1種變異c.1182+1G>A。詳見表2。

表2 檢出數≥2的變異檢出情況

2.3 河南省4種遺傳代謝病患病率估計根據Hardy-Weinberg定律計算,河南省4種遺傳代謝病的總體患病率約為1/2 018,高苯丙氨酸血癥患病率約為1/6 236,肝豆狀核變性患病率約為1/9 588,甲基丙二酸血癥患病率約為1/6 659,眼皮膚白化病患病率約為1/12 382。未發現有夫婦同時攜帶同種致病變異。

3 討論

近年來,高通量測序技術的出現極大地提高了基因檢測效率并降低了檢測成本,使得攜帶者篩查從單一疾病(或特定種族)的篩查發展到多種疾病的擴展性篩查。本研究通過高通量測序技術在河南省612對孕前夫婦中對4種遺傳代謝病7個基因進行攜帶者篩查。

高苯丙氨酸血癥根據病因分為苯丙氨酸羥化酶缺乏癥和四氫生物蝶呤缺乏癥兩種類型,對應的基因為PAH和PTPS。本研究結果顯示,河南省育齡夫婦PAH基因攜帶率為2.53%,PTPS基因攜帶率僅有0.33%;PAH基因攜帶率高于已報道的白種人(1.75%)及中國全國人群(1.89%)[5];豫北地區致病變異攜帶率最高,且多為錯義突變,其中c.721C>T(p.Arg241Cys)突變頻率最高。研究[6-7]顯示,1985～2018年中國大陸PAH缺乏癥的發病率為1/(11 144～11 614),且呈現“北高南低”的趨勢。文獻[8]報道吉林遼寧地區c.728G>A(p.Arg243Gln)突變頻率高達15.75%。以上研究結果提示PAH基因存在高度異質性,突變種類和頻率存在明顯地域和種族差異,因此有必要針對不同地域進行PAH基因突變檢測。

肝豆狀核變性是一種由ATP7B基因突變引起的銅代謝障礙的常染色體隱性遺傳疾病,在世界范圍的患病率為1/(2 600～30 000),ATP7B基因攜帶率約為1/90[9]。本研究中ATP7B基因攜帶率為2.04%,高于世界水平,與Zhang等[10]的報道(約1/50)相近。目前已報道的ATP7B基因致病變異多達900余種,但我國主要為c.2333G>T、c.2975C>T和c.2804C>T這3個高頻變異,占所有致病變異的50%～60%[11]。本研究中c.2333G>T變異攜帶率0.49%,與全國篩查結果相似,且豫北地區攜帶率最高,多為錯義突變。我國的一項研究[12]表明一些致病變異與肝豆狀核變性亞型和臨床特征有一定關系,c.2755C>G(p.Arg919Gly)與神經亞型有關,c.2333G>T(p.Arg778Leu)與發病年齡小、銅藍蛋白和血清銅水平低有關。

甲基丙二酸血癥是我國先天性有機酸代謝異常中最常見的疾病,單純型甲基丙二酸血癥多由MUT(OMIM,609058)基因突變引起,合并型最常由MMACHC(OMIM,611935)基因突變引起。我國甲基丙二酸血癥患病率約為1/3.7萬,河南省患病率為1/6 032[13],遠高于全國水平,所以有必要在河南省行孕前攜帶者篩查。本研究中MMACHC基因攜帶率為1.72%。目前全世界范圍內報道的甲基丙二酸血癥致病突變大約有一百余種,在白種人群中,c.271dupA最為常見[14]。Wang等[15]報道,在中國人群中c.609G>A約占MMACHC基因所有突變的47.63%。本研究結果顯示,c.609G>A是河南省育齡人群最常見的致病變異。有報道[16],在我國較常見的MUT基因致病突變是c.729_730insTT、c.323G>A以及c.1106G>A。然而本研究結果顯示,在河南省育齡人群中c.1663G>A攜帶率最高。

中國人群中眼皮膚白化病的患病率約為1/18 000,OCA-1型是主要類型,約占64.3%,OCA2型占11.7%[17]。OCA-1型由TYR基因突變所致。本研究結果顯示,河南省育齡人群中TYR+OCA2基因攜帶率為1.80%,略高于溫佶俐等[18]報道的1.55%;TYR基因攜帶率為1.63%,以c.929_930insC、c.896G>A為主;攜帶OCA2基因致病變異2人,均為c.1182+1G>A,主要集中在豫北地區。OCA具有危害性、可遺傳性和無法醫治性,目前所能采取的唯一應對措施就是婚前、孕前、產前早診斷早發現。

如上所述,4種遺傳代謝病致病基因的攜帶率及其常見變異在國內外不同種族人群中存在較大差異。目前,除美國外的其他地區關于攜帶者篩查的指南或共識非常有限,國外的行業指南對攜帶者篩查疾病種類及變異位點的納入標準也可能不適用于我國,所以有必要在我國擴大遺傳代謝病攜帶者篩查,出版適合我國的攜帶者篩查指南或共識。