circ-0030042通過miR-145/PTEN軸調控對增生性瘢痕成纖維細胞增殖及遷移的影響

張毓姣 郭智輝 孟艷斌 高亞麗 段鵬 郝振明

[摘要]目的：探討circ-0030042與人第10號染色體缺失的磷酸酶（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的相互作用關系，并分析其在增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）患者中對成纖維細胞增殖與遷移的影響及作用機制。方法：通過circRNA序列和定量聚合酶鏈反應（PCR技術）檢測正常皮膚成纖維細胞（NSFBs）和增生性瘢痕患者成纖維細胞（HSFBs）中circ-0030042的表達。用CCK8檢測法檢測轉染48 h后的HSFBs細胞增殖情況。利用stubRFP-sensGFP-LC3基因轉染、流式細胞儀及電子顯微鏡觀察circ-0030042對miR-145/PTEN軸調控VEGF水平的表達。利用生物信息學分析、RNA免疫沉淀、免疫熒光檢測等方法，揭示circ-0030042介導HS患者成纖維細胞增殖與遷移的作用機制。結果：circ-0030042在增生性瘢痕中顯著上調，過表達時作為VEGF海綿抑制miR-145誘導的成纖維細胞，維持體內穩定性。此外，circ-0030042通過海綿化VEGF水平并阻斷其miR-145捕獲轉錄因子（FOXO1）mRNA來影響自噬，而circ-0030042誘導FOXO1的抑制被VEGF水平過表達或circ-0030042結合減少所抵消。過表達circ-0030042對成纖維細胞的增殖抑制與VEGF表達的抑制作用被過表達miR-145部分抵消。結論：干擾circ-0030042通過靶向下調miR-145/PTEN軸進而抑制HSFBs細胞的增殖與遷移，進一步誘導惡性細胞凋亡。

[關鍵詞]circ-0030042；miR-145/PTEN軸；增生性瘢痕；成纖維細胞；細胞遷移/增殖

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）01-0049-05

Effect of circ-0030042 on Proliferation and Migration of Fibroblasts in Hypertrophic Scar by Regulation of miR-145/PTEN Axis

ZHANG Yujiao1，GUO Zhihui2，MENG Yanbin1，GAO Yali3，DUAN Peng2，HAO Zhenming1

[1.Department of Burn Ⅱ， 2.Department of Burn Ⅰ， 3.Department of Dermatology， General Hospital of Taiyuan Iron and Steel （Group） Co.，Ltd.，Taiyuan 030000，Shanxi，China]

Abstract： Objective? To investigate the interaction relationship between circ-0030042 and Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten （ PTEN ）， and to analyze its effect and mechanism on fibroblast proliferation and migration in patients with proliferative scar （HS）. Methods? The expression of circ-0030042 in normal skin fibroblasts （NSFBs） and fibroblasts （HSFBs） of patients with proliferative scars was detected by circRNA sequence and quantitative polymerase chain reaction （PCR）.The proliferation of HSFBs cells after transfection 48 h was detected by CCK8 assay. The expression of circ-0030042 on the miR-145/PTEN axis to regulate VEGF levels was observed by stubRFP-sensGFP-LC3 gene transfection， flow cytometry and electron microscopy. Bioinformatics analysis， RNA immunoprecipitation， immunofluorescence and other methods were used to reveal the mechanism of CIRC-0030042 mediating fibroblast proliferation and migration in HS patients. Results? Circ-0030042 is significantly up-regulated in hypertrophic scars. Overexpression of circ-0030042 acts as a VEGF sponge to inhibit miR-145-induced fibroblasts and maintain stability in vivo. In addition， circ-0030042 affects autophagy by spongeizing VEGF levels and blocking its miR-145-capturing transcription factor （FOXO1） mRNA， while circ-0030042-induced inhibition of FOXO1 is offset by overexpression of VEGF levels or decreased binding of circ-0030042. The proliferation inhibition of fibroblasts and VEGF expression by overexpression circ-0030042 were partially offset by overexpression miR-145. Conclusion? Interference with circ-0030042 inhibits the proliferation and migration of HSFBs cells by targeting down-regulating the miR-145/PTEN axis， and further induces apoptosis in malignant cells.

Key words： circ-0030042; miR-145/PTEN shaft; hypertrophic scarring; fibroblast; cell migration/proliferation

增生性瘢痕（HS）主要特點為大量的膠原沉積和成纖維細胞的增生。目前，手術切除、藥物和激光等是臨床治療的主要手段，但因瘢痕的復發率較高，所以研究其病因和尋找有效治療措施具有重要意義[1-2]。miRNA是一種以自身功能為基礎的微型非編碼RNA，參與了纖維細胞的增殖和纖維化等過程，它可以對目標基因進行負向調節[3]。有研究表明[4]，miR-145在HS皮膚組織中的水平是正常人的3倍。已有的研究發現PTEN對人瘢痕成纖維細胞HSFb及HS組織的表達有明顯的下調[5]。通過基因綜合表達數據庫發現circ-0030042尚未被深入研究，目前只發現circ-0030042對動脈粥樣硬化具有保護作用，能有效抑制血管內膜纖維化，但其在HS中的作用機制尚不清楚[6]。然而，circ-0030042是否能調控miR-145/PTEN對HS產生影響尚不清楚?；诖?，本研究旨在探討circ-0030042通過調控miR-145/PTEN軸對瘢痕成纖維細胞的作用，闡明circ-0030042在HS中發揮的作用及具體作用機制，為HS治療提供有效靶點。

1? 資料和方法

1.1 試驗材料：正常皮膚成纖維細胞（NSFBs）和增生性瘢痕患者成纖維細胞（HSFBs），SYBR Premix Ex TaqⅡ染料法熒光定量PCR試劑盒（上海古朵生物科技有限公司），新生牛、胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司），Opti-MEM、RPMI 1 640培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司），Lipofectamin 2 000脂質體轉染試劑（Invitrogen公司）。β-actin（鼠抗）、HRP標記的抗鼠、抗兔二抗[為翌圣生物科技（上海）股份有限公司]，C-MYC、CCND1、p-Akt抗體（Invitrogen公司），JNK1（上海恒斐生物科技有限公司）。10%正常羊封閉血清（北京諾博萊德科技有限公司），免疫熒光染色二抗稀釋液[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。Ly294002（P13K/AKT阻斷劑）（Cayman Chemical公司產品）。

1.2 方法

1.2.1 標本收集：收集筆者醫院HS患者的病理組織與鄰近正常皮膚組織各25例，HS患者經臨床病理診斷確診。將皮膚樣品儲存于液氮中留存備用。所有患者均對本研究內容知情同意，并且簽署知情同意書。該試驗方案由醫院倫理委員會批準。

1.2.2 細胞培養：取HSFBs和NSFBs細胞系進行常規復蘇后，取兩組適量細胞，用含10%的胎牛血清培養基在恒溫箱中進行傳代培養及計數，傳代培養結束分別用RPMI 1 640和37℃的CO2細胞培養箱中進行培養。在轉染1 d后，將該細胞進行傳代，當其融合程度達到40%時，再進行轉染。HSFBs細胞按處理方式分成下列類型：①空白組：細胞未做處理；②hsa-NC組：細胞轉染hsaRNA NC；③hsa-circ-0030042組：細胞轉染hsa-circ-0030042；④hsa-circ-0030042+anti-NC組：細胞共同轉染hsa-circ-0030042和miRNA inhibitor陰性對照（anti-NC）；⑤hsa-circ-0030042+anti-miR-145組：細胞共同轉染hsaRNA circ-0030042（hsa-circ-0030042）和miR-145 inhibitor（anti-miR-145）；⑥miR-NC組：細胞轉染miRNA mimics陰性對照（miR-NC）；⑦miR-145組：細胞轉染miR-145；⑧miR-145+VEGF組：細胞共同轉染miR-145和VEGF空載體；⑨miR-145+信號傳導血管內皮生長因子（VEGF）重組過表達質粒（pcDNA-VEGF）組：細胞共同轉染miR-145 mimics和pcDNA-VEGF。用Li-pofectamine 3 000試劑進行細胞轉染，48 h后進行下一步試驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測：按照GREENspin組織/cRNA快速萃取試劑盒的操作程序，對每一組進行了細胞RNA的提取[7]。通過使用Takara RNA聚合酶鏈式反應Kit（AMY），進行反轉錄。用RT試劑盒對RNA進行反向轉錄，用cDNA 1鏈作為模板進行PCR檢測。聚合酶鏈反應產物瓊脂糖凝膠電泳和DNA吸光度分析；該顯色條帶圖像分析系統（Alpha Imager 2 000）對其積分吸光度進行檢測，并且用該內參β-actin條帶的比率作為mRNA的表達水平參量。miR-145在HSFBs和NSFBs細胞中的表達，用U6 mRNA作為內參量進行檢測。GAPDH為circ-0030042及VEGF的內參mRNA，引物序列：miR-145正向：5＇-TCCATCCTGCAGAAGAAGCC-3＇，反向：5＇-TGCTTTGAATCCAAAAACCTTACT-3＇；circ-0030042正向：5＇-TGGATGGAGATACATTGGATT-3＇；反向：5＇-ATTGAGCATCCACCAAGAcAC-3＇；VEGF mRNA正向：5＇-GC-ATTACGCTTAAGGCCTA-3＇，反向5＇-CAATGGGCACTCCGGGATCG-3＇。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因試驗：將含miR-145序列的circ-0030042（circ-0030042-WT）及其突變序列（circ-0030042-MUT）、VEGF UTR（VEGF 3′UTR-WT）和其突變序列（VEGF 3′UTR-MUT）構建基因載體，再用miR-NC、miR-145共轉染OVCAR-3細胞，48 h后進行熒光酶活性的測定[8]。

1.2.5 CCK8實驗檢測細胞增殖活性：取OVCAR-3對數生長周期的細胞進行調劑，使其濃度達到5×105/ml。用96孔板接種100 μl的細胞懸浮液，在37℃下用5% CO2培養皿中培養。在24、48和72 h后，添加CCK8 10 μl的溶液，再進行4 h的培養，用酶標儀測定45 nm的吸光度（OD）值[9]。

1.2.6 Western blot檢測：采用RIPA熱裂解溶液進行酶解，在4℃下，12 000 g的離子體進行15 min的離心，然后采用上清-BCA方法進行定量分析，將少量蛋白質用上樣緩沖液制備成蛋白質，在95℃下加熱，經SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜處理，PTEN、Akt.p-Akt、GAPDH一抗于4℃下經TBST處理[8]。TBST對未結合的一抗進行2 h的二次免疫培育，將未經連接的二抗用TBST洗滌，在暗室內用化學發光劑ECL將條帶進行曝光和顯像，用Image J軟件測量各條帶灰度，以GAPDH作為內參數并計算各蛋白相對表達量[10]。

1.3 統計學分析：采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計量資料均以（xˉ±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 敲減circ-0030042抑制HS細胞的增殖、遷移和侵襲：hsa-circ-0030042組與空白組、hsa-NC組相比，circ-0030042的相對表達水平顯著下降（P＜0.05），表明hsaRNA-circ-0030042的基因轉染效果良好。細胞功能實驗結果顯示，與空白組和hsa-NC組比較，hsa-circ-0030042組細胞培養在24 h、48 h、72 h后，其增殖活性明顯降低（P＜0.05），且在24 h內，其遷移和侵襲的數目明顯減少（P＜0.05）。見表1。

2.2 circ-0030042靶向miR-145：利用生物信息學網站Circinteractome，本文預測circ-0030042和miR-145具有結合位點（見圖1）；雙熒光素酶實驗結果顯示，與hsa-NC+circ-0030042-WT共轉染組相比，miR-145+circ-0030042-WT共轉染組的螢光素活性明顯降低（P＜0.05），見圖2；qRT-PCR結果顯示hsa-circ-0030042組與空白對照組及hsa-NC組相比，miR-145在hsa-circ-0030042組中的相對表達水平明顯增高（P＜0.05），見圖3。提示通過靶向circ-0030042可以明顯地降低HSFBs中miR-145的基因水平。

2.3 circ-0030042靶向miR-145調控HSFBs細胞的增殖、遷移和侵襲：與hsa-NC組相比，hsa-circ-0030042組在培養48、72 h后，細胞增殖活性均有顯著下降（P＜0.05），而在24 h其細胞遷移與侵襲數目較hsa-NC組減少（P＜0.05）；與hsa-circ-0030042+anti-NC組比較，在48、72 h培養條件下，hsa-circ-0030042+anti-miR-145的細胞增殖活性均有顯著提高（P＜0.05），其在24 h內的細胞轉移和浸潤數量明顯增多（P＜0.05），見表2。

2.4 circ-0030042靶向miR-145調控VEGF的表達：本次試驗利用TargetScan，發現miR-637與VEGF3' UTR存在結合位點（見圖4）；雙熒光素酶實驗結果顯示，與miR-NC+VEGF 3’UTR WT共轉染組比較，miR-145+ VEGF 3' UTR WT共轉染后，其熒光素酶活力顯著下降（P＜0.05），表明miR-145可與VEGF的3'UTR靶向相互結合，見圖5；RT-qPCR及Western blot分析表明hsa-circ-0030042+anti-miR-145組VEGF mRNA及蛋白質的相對表達率均顯著高于hsa-circ-0030042+anti-NC的對照組，VEGF mRNA及蛋白質的相對表達率均有顯著提高（P＜0.05），見表3、圖6。

2.5 miR-145靶向VEGF調控HSFBs細胞的增殖、遷移和侵襲：Western blotting試驗表明，miR-145組的VEGF mRNA及蛋白的表達比miR-NC組顯著下降（P＜0.05）；miR-145+pcDNA-VEGF組細胞VEGF mRNA及蛋白表達含量顯著高于miR-145+pcDNA組（P＜0.05），見圖7、表4。

3? 討論

HS是由于人體受到創傷、炎癥、燒傷、外傷或自發形成的一種過敏性病變，表現為大量的膠原、糖蛋白等在細胞外基質中堆積，膠原纖維的分布不均勻[11]。目前HS的發病率高達4%～16%，嚴重者不僅影響美觀，還會導致組織、器官發生不同程度的功能障礙，甚至會造成殘疾，對患者正常的生活與工作造成影響，給患者帶來生理和精神上的損害[12]。目前，對HS的治療方法并不理想。在瘢痕的形成中，成纖維細胞是影響移植的主要因素，因此，在瘢痕修復中，抑制其生長和分化對臨床治療瘢痕具有重要意義。既往大量研究表明，circRNA可較好抑制miR-145的作用，但circ-0030042在HS中對miR-145是否具有調控效用尚未有研究證實。

miRNA是一類長度約22 nt的非編碼小分子RNA。它能夠以完全或不完全互補的形式，識別并結合相關的靶基因，通過溶解或抑制靶基因的mRNA翻譯過程，在轉錄后水平上調控基因和（或）蛋白的表達。miR-145已被證明可以在多種癌癥中起到抗腫瘤的效果，但是miR-145同樣可以刺激腹膜組織纖維化[13]。circRNA是一類含有多個外顯子的環狀RNA，廣泛分布于多種生物細胞。其含有豐富的miRNAs結合位點，可通過競爭性內源RNA發揮作用，充當miRNAs的“海綿”，使其解除對靶基因的抑制，通過調節其它RNA的表達影響疾病的發生發展。加上circRNAs作為高度穩定且具有組織特異性的非編碼RNA，因此，circRNAs是一種極具潛力的生物標志物，也是一種極具應用前景的目標靶點。既往Wu Y等[14]認為circ_0005105不影響miR-26a的表達，但抑制其轉錄活性，從而上調其靶標NAMPT的表達，circ_0005105抑制Ⅱ型膠原蛋白和聚集膠的表達，促進MMP-13和ADAMTS-4的表達，促進PGE2、IL-6和IL-8的生成；Ai Y等[15]研究顯示，circ_0001461通過海綿miR-145調節口腔鱗狀細胞增殖，遷移和侵襲。此外，circ_0001461通過調節miR-145/TLR4/NF-κB途徑促進TNF-α誘導的口腔細胞凋亡。本次研究結果顯示，circ-0030042在HS組織和細胞高水平表達；細胞功能試驗顯示，circ-0030042對HS細胞增殖、遷移及侵襲有一定的抑制作用，提示circ-0030042參與HS的發生發展，與上述實驗結果相符合。

細胞的功能試驗顯示VEGF的過度表達可抑制miR-145細胞增殖、遷移和侵襲的活性。結果表明，circ-0030042為miR-145的主要載體，其作用機制是調節其目標基因VEGF的表達，進而對細胞的增殖、遷移和侵襲起到一定的作用；而miR-145可以與VEGF的3'UTR靶點相結合，證明circ-0030042或miR-145可以抑制VEGF mRNA及蛋白質的表達，對miR-145的抑制可以逆轉circ-0030042對VEGF mRNA及蛋白質的表達。分析原因可知，VEGF是一種有絲分化的因子，它可以刺激血管內皮細胞的生長，VEGF與細胞膜上VEGF在低氧環境下與VEGF的受體發生相互作用，從而使VEGF增殖加快；VEGF能提高PA和PAI-1 mRNA的含量，從而提高PA的活性，進而加速細胞外蛋白水解，加速新的毛細血管生成[16-17]。而miRNA能夠調控靶蛋白3'UTR區域基因并與之結合，從而實現靶基因的轉錄后調控，進而調節相關疾病的發病和發展[18]。此次利用聯機生物資料庫，本研究發現circ-0030042與miR-145之間存在著一個結合位點，并利用此結合位點進行了基因工程分析，證明circ-0030042能夠與miR-145進行靶基因的融合，從而使細胞的增殖、遷移和侵襲受到了抑制，其效應與敲除circ-0030042的活性相吻合，而miR-145的抑制作用可以使circ-0030042活性發生逆轉，說明circ-0030042可以通過與miR-145的競爭性結合來改變HSFBs的惡性生物學特性。

綜上所述，circ-0030042可以與miR-145進行競爭性的相互作用，間接地調節其靶向因子VEGF的表達，從而調節HSFBs的增殖、遷移和侵襲。因此，circ-0030042/miR-145/PTEN軸位可以作為HS的發病機理和可能的治療靶點。

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[收稿日期]2023-02-28

本文引用格式：張毓姣，郭智輝，孟艷斌，等.circ-0030042通過miR-145/PTEN軸調控對增生性瘢痕成纖維細胞增殖及遷移的影響[J].中國美容醫學，2024，33（1）：49-53.