胰激肽原酶對背部皮瓣損傷大鼠皮瓣存活及炎癥因子與氧化應激的影響

何金俊 岑瑛

[摘要]目的：探討胰激肽原酶對大鼠背部超長隨意皮瓣存活、炎癥因子和氧化應激的影響。方法：將SPF級SD大鼠分為假手術組、生理鹽水組、胰激肽原酶低劑量組和胰激肽原酶高劑量組。假手術組僅切開皮瓣，其余組做皮瓣損傷模型，生理鹽水組不給予藥物處理，胰激肽原酶低劑量組給予7.2 U/kg胰激肽原酶，胰激肽原酶高劑量組給予14.4 U/kg胰激肽原酶，治療7 d。實驗結束后，觀察大鼠皮瓣成活率，HE染色觀察大鼠皮瓣病理變化，使用原位末端轉移酶標記技術（Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色觀察皮瓣細胞凋亡情況，CD31染色觀察血管形成情況，ELISA檢測大鼠血清中TNF-α和IL-6含量，皮瓣中Nrf2/HO-1水平。結果：與生理鹽水組相比胰激肽原酶組提高了大鼠皮瓣存活率，減輕了皮瓣組織損傷，降低了血清TNF-α和IL-6含量，增高了Nrf2/HO-1水平。結論：胰激肽原酶能夠提升皮瓣存活率，減輕大鼠炎癥反應和氧化應激反應。

[關鍵詞]胰激肽原酶；皮瓣存活；氧化應激；Nrf2/HO-1

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）01-0054-04

Effects of Pancreatic Kallikrein on Flap Survival，Inflammatory Factors and Oxidative Stress in Rats with Dorsal Flap Injury

HE Jinjun，CEN Ying

（Department of Plastic Surgery/Burn，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 644000，Sichuan，China）

Abstract： Objective? To investigate the effects of pancreatic kininogenase on the survival，inflammatory factors and oxidative stress of super-long random skin flap in rats. Methods? SPF SD rats were divided into sham operation group， control group， low dose pancreatic kininogenase group and high dose pancreatic kininogenase group. The sham operation group only cut open the skin flap， the other groups made the skin flap injury model， the control group was not given drug treatment， the pancreatic kininogenase low dose group was given 7.2 U/kg pancreatic kininogenase， and the pancreatic kininogenase high dose group was given 14.4 U/kg pancreatic kininogenase for 7 days. At the end of the experiment， the survival rate of rat skin flap was observed， the pathological changes of rat skin flap were observed by HE staining， the apoptosis of skin flap was observed by TUNEL staining， the angiogenesis was observed by CD31 staining， the contents of TNF-α and IL-6 in serum and the level of Nrf2/HO-1 in skin flap were detected by ELISA. Results? compared with the control group， pancreatic kininogenase increased the survival rate of skin flap， reduced the tissue injury of skin flap， decreased the content of serum TNF-α and IL-6， and increased the level of Nrf2/HO-1. Conclusion? pancreatic kininogenase can improve the survival rate of skin flap and reduce inflammatory reaction and oxidative stress in rats.

Key words： pancreatic kininogenase; flap survival; oxidative stress; Nrf2/HO-1

皮瓣移植是整形、美容和重建手術中廣泛使用的一種主要方式，用于治療皮膚缺損。這種方法因其方便性和彈性而被用于治療創傷性皮膚損傷、難治性傷口、癌癥切除、燒傷和下肢血管潰瘍[1-3]。然而，皮瓣組織損失率從占皮瓣長度的25%～50%是最具挑戰性的問題[4]。胰激肽原酶又稱胰激肽釋放酶，是哺乳動物胰腺等器官中提取的一種蛋白水解酶，具有血管舒張、改善血液循環和微循環、防止血栓形成等作用[5]?；诖?，本研究通過測定皮瓣存活率、平均血管密度、炎癥因子、抗氧化物和Nrf-2、HO-1蛋白表達來探討胰激肽原酶對大鼠皮瓣存活的影響。

1? 材料和方法

1.1 試劑和儀器：細胞因子的酶聯免疫吸附法檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），蛋白特異性一抗（英國Abcam公司）。顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司），凝膠電泳系統及成像系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 動物造模及分組：SPF級6～8周雌性SD大鼠24只，體質量200～300 g，購自成都達碩實驗動物有限公司[SCXK（川）2020-0030]。實驗動物經華西醫院動物實驗室動物倫理委員會審批，審批編號：20230425001。適應性飼養1周，隨機分為A組（假手術組）、B組（0.9%生理鹽水對照組）、C組（胰激肽原酶低劑量組，7.2 U/kg）、D組（胰激肽原酶高劑量組，14.4 U/kg）組，每組6只。A組僅切開皮瓣，其余組給予腹腔內注射2%戊巴比妥鈉（20 mg/kg）進行麻醉后，固定、背部手術區域刮毛，設計一蒂部在尾側端長寬約8 cm×2 cm皮瓣，碘伏消毒、鋪巾，沿設計線切開皮膚至肉膜層，全層游離掀起，止血滿意后皮瓣予4-0絲線原位縫合。于術后開始給藥，C組和D組分別腹腔注射7.2 U/kg和14.4 U/kg的胰激肽原酶[6]，A組和B組等量生理鹽水腹腔注射，1次/天，連續7 d。

1.3 皮瓣成活率觀察：術后7 d，測量皮瓣存活區面積百分比。皮瓣成活率=皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%。

1.4 HE染色：術后7 d切取大鼠皮瓣距尾端3～4 cm處組織，10%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋；制3 μm切片，HE染色，于顯微鏡下觀察。

1.5 TUNEL染色：用末端脫氧核苷酸轉移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT）介導的缺口末端標記（TUNEL）染色檢測DNA斷裂程度。脫蠟、復水、封閉、10.2 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液處理，PBS洗滌后，37℃原位細胞死亡檢測試劑盒（羅氏中國，中國上海）染色30 min，DAPI染色細胞核。最后，在熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本東京）下捕獲每張玻片的6個隨機場，對TUNEL陽性細胞進行計數。

1.6 CD31染色：切片按照免疫組化試劑盒說明書進行CD31染色。先將染色切片置于低倍鏡下確定血管密度最高區域，再在高倍鏡下選取3個密度較多視野進行微血管計數并取平均值，計算出單位面積微血管數目。

1.7 ELISA檢測：術后7 d于皮瓣蒂部抽取腹壁淺動脈血液1.5 ml，4 000 r/min條件下離心15 min分離血清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，根據標準曲線計算各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量。選取部分皮瓣組織稱重后用超聲勻漿機制成10%勻漿液，于4℃下10 000 r/min離心20 min后取上清液，按照試劑盒說明書步驟進行操作，采用比色法檢測皮瓣組織中SOD活性和MDA含量。

1.8 WB檢測：取各組大鼠皮瓣組織剪碎勻漿，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定樣品濃度，取等量蛋白進行凝膠電泳分離后，轉印至PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后，4℃孵育稀釋后的一抗（VEGF-A、HIF-1α和GAPDH，1∶1 000）12 h。次日清洗后加入相應二抗孵育2 h。洗滌后，加入顯影液顯影成像。使用GAPDH抗體進行內參校正，曝光圖像用Image J軟件對條帶灰度值進行分析，用目的蛋白與GAPDH灰度值比表示目的蛋白的相對表達量。

1.9 統計學分析：采用GraphPad 8.0統計軟件對實驗結果進行分析，實驗結果用（xˉ±s）表示，兩組數據之間比較采用t檢驗，三組間及三組以上數據分析采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 皮瓣外觀觀察及成活率：各組皮瓣存活率顯著差異，與假手術組對比，生理鹽水組大鼠皮瓣存活率顯著降低（P＜0.001），與生理鹽水組對比，胰激肽原酶高劑量組大鼠皮瓣存活率顯著升高（P＜0.05），見圖1～2。

2.2 皮瓣組織病理學觀察：通過HE染色，假手術組皮瓣組織表皮結構完整清晰，角質層明顯，結構完整。生理鹽水組皮瓣組織大面積變性壞死，見壞死區域細胞結構消失，胞質溶解，胞核固縮或消失，可見皮瓣組織內不同程度出血。胰激肽原酶低劑量組皮瓣組織表皮結構較完整清晰，角質層明顯，復層扁平上皮層較薄，細胞排列整齊緊密，真皮層內膠原纖維不同程度變性壞死，見膠原纖維結構消失。胰激肽原酶高劑量組皮瓣組織表皮結構完整清晰，角質層明顯，細胞排列整齊緊密；真皮層內見少量的炎性細胞浸潤，毛囊和皮脂腺等附屬器結構完整。見圖3。TUNEL染色發現，與假手術組對比，生理鹽水組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001）；與生理鹽水組對比，胰激肽原酶低劑量組和胰激肽原酶高劑量組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.001）。見圖4。

2.3 各組大鼠血管形成情況：與假手術組對比，生理鹽水組大鼠血管數量顯著降低（P＜0.01）；與生理鹽水組對比，胰激肽原酶高劑量和胰激肽原酶低劑量組大鼠血管數量顯著增加（P＜0.01）。見圖5。

2.4 皮瓣中TNF-α、IL-6水平：與假手術組對比，生理鹽水組大鼠TNF-α、IL-6含量顯著升高（P＜0.001）；與生理鹽水組對比，胰激肽原酶高劑量和胰激肽原酶低劑量組大鼠TNF-α、IL-6含量顯著降低（P＜0.001）。見圖6。

2.5 皮瓣中生化試劑盒檢測總蛋白TP、超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA水平：各組大鼠的總蛋白含量無顯著差異。與假手術組對比，生理鹽水組大鼠SOD含量顯著降低（P＜0.001），MDA含量顯著增加（P＜0.001）；與生理鹽水組對比，胰激肽原酶高劑量和胰激肽原酶低劑量組大鼠SOD含量顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.001）。見圖7。

2.6 皮瓣中Nrf2/HO-1水平：Nrf2（細胞核，內參用histone h3）、HO-1（總蛋白，內參用β-actin）。與假手術組對比，生理鹽水組大鼠Nrf2和HO-1表達量無明顯差異；與生理鹽水組對比，胰激肽原酶高劑量和胰激肽原酶低劑量組大鼠Nrf2表達顯著升高（P＜0.05），胰激肽原酶高劑量大鼠HO-1表達顯著升高（P＜0.01）。見圖8。

3? 討論

胰激肽原酶為蛋白類水解酶，可調節血糖、血壓及炎癥反應等[7]。有研究報道，胰激肽原酶在糖尿病腎病中發揮抗氧化應激、抗炎癥反應及抗組織纖維化等重要調控作用[8]。本研究結果表明，高劑量胰激肽原酶可顯著改善大鼠背部皮瓣存活情況，促進組織結構完整，降低細胞凋亡率，促進血管生成，改善炎癥。

有研究發現，胰激肽原酶能夠有效降低血液黏稠度，抑制血小板聚集，擴張毛細血管，改善機體微循環[9-10]。本研究前期檢測了各組大鼠的皮瓣損傷，結果顯示，經胰激肽原酶治療后大鼠的皮瓣組織表皮結構變得完整清晰，細胞凋亡也顯著減少，血管數量顯著增加。這表明胰激肽原酶對皮瓣損傷具有修復作用。

皮瓣存活受到三重因素的威脅，包括灌注不良、炎癥機制和氧化應激[11-12]。隨意皮瓣無特殊血管存在，主要依靠新的毛細血管網供血[13]。由于不受特定血管的限制，造成皮瓣的柔韌性，但也容易導致組織缺血和壞死[14]。一旦血管生成和血液灌注，就會發生缺血再灌注損傷[15]，這意味著氧化應激發生在缺血組織和損傷的皮瓣上，伴有細胞凋亡[16-17]。本研究對大鼠皮瓣勻漿中炎癥因子TNF-α、IL-6和超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA檢測，結果顯示，經過胰激肽原酶干預后，大鼠皮瓣SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低，說明大鼠的氧化應激反應改善較好。

Nrf2/HO-1信號通路是細胞抗氧化防御機制的一個組成部分[18]，研究報道NRF2可通過上調HO-1表達，對抗氧化應激水平升高，減輕細胞損傷[19]。有研究表明，當Nrf2/HO-1表達上調時，活性氧類、促炎因子等顯著減少[20]。本研究結果顯示經胰激肽原酶干預后，Nrf2和HO-1的表達水平均增高，這表明胰激肽原酶能有效緩解皮瓣損傷的氧化應激和細胞損傷。

綜上所述，胰激肽原酶對皮瓣損傷大鼠表皮組織、氧化應激和炎癥反應中具有調控作用，本實驗從動物水平上初步說明了胰激肽原酶對皮瓣損傷的調節作用，后續將計劃進一步探究胰激肽原酶的具體調節作用機制，為胰激肽原酶的臨床應用及藥物研發提供更加充分的理論依據。

[參考文獻]

[1]Li D，Zhang R，Zhang Q，et al.Clinical results of ear elevations in patients with microtia using skin grafts from three donor sites： a retrospective study[J].Aesthetic Plast Surg，2020，44（5）：1545-1552.

[2]Li Y，Zhang R，Zhang Q，et al.An alternative posterosuperior auricular fascia flap for ear elevation during microtia reconstruction[J].Aesthetic Plast Surg，2017，41（1）：47-55.

[3]Aryannejad A，Gandominejad A，Tabary M，et al.Protective effect of modafinil on skin flap survival in the experimental random-pattern skin flap model in rats： The role of ATP-sensitive potassium channels and nitric oxide pathway[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg，2021，74（6）：1346-1354.

[4]Kane A J，Barker J E，Mitchell G M，et al.Inducible nitric oxide synthase （iNOS） activity promotes ischaemic skin flap survival[J].Br J Pharmacol，2001，132（8）：1631-1638.

[5]楊海霞，劉國良，郝成偉，等.胰激肽原酶治療糖尿病綜述[J].臨床醫藥文獻電子雜志，2017，4（90）：17799-17800.

[6]杜萍，冷吉燕，付軍，等.胰激肽原酶對自發性高血壓大鼠氧化損傷和心肌纖維化的影響[J].中國老年學雜志，2006（7）：941-942.

[7]趙靜，段莉莉，李超.胰激肽原酶腸溶片聯合厄貝沙坦片治療對2型糖尿病腎病伴高血壓患者TM、TNF-α、IL-18的影響[J].臨床和實驗醫學雜志，2021，20（16）：1703-1707.

[8]Cheng Y，Yu X，Zhang J，et al.Pancreatic kallikrein protects against diabetic retinopathy in KK Cg-A（y）/J and high-fat diet/streptozotocin-induced mouse models of type 2 diabetes[J].Diabetologia，2019，

62（6）：1074-1086.

[9]胡崇宇，李雅嘉，王晨旭，等.普羅布考聯合胰激肽原酶治療老年糖尿病周圍神經病變的臨床效果[J].中國老年學雜志，2018，38（5）：1034-1036.

[10]Jin J Z，Li H Y，Jin J，et al.Exogenous pancreatic kininogenase protects against renal fibrosis in rat model of unilateral ureteral

obstruction[J].Acta Pharmacologica Sinica，2020，41（12）：1597-1608.

[11]Ma X，Lin Y，Liu Y，et al.Effects of apigenin treatment on random skin flap survival in rats[J].Front Pharmacol，2021，12：625733.

[12]Souza R a C，Martinelli-Kl?y C P，D'acampora A J，et al.Effects of sildenafil and tadalafil on skin flap viability[J].Arch Dermatol Res，2022，314（2）：151-157.

[13]Zhang P，Feng J，Liao Y，et al.Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product-stromal vascular fraction gel[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，495（3）：2249-2256.

[14]馮潤荷，張金財，李小倩，等.小劑量過氧化氫預處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[J].中國應用生理學雜志，2013，29（3）：247-250.

[15]Pu C-M，Liu C-W，Liang C-J，et al.Adipose-derived stem cells protect skin flaps against ischemia/reperfusion injury via IL-6 expression[J].J Invest Dermatol，2017，137（6）：1353-1362.

[16]Enzmann G，Kargaran S，Engelhardt B.Ischemia-reperfusion injury in stroke： impact of the brain barriers and brain immune privilege on neutrophil function[J].Ther Adv Neurol Disord，2018，11：1756

286418794184.

[17]Lou Z，Wang A P，Duan X M，et al.Role of ALK5/SMAD2/3 signaling in the regulation of NOX expression in cerebral ischemia/reperfusion injury[J].Exp Ther Med，2018，16（3）：1671-1678.

[18]Yu L，Li S，Tang X，et al.Diallyl trisulfide ameliorates myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing oxidative stress and endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis in type 1 diabetic rats： role of SIRT1 activation[J].Apoptosis，2017，22（7）：942-954.

[19]Amata E，Pittalà V，Marrazzo A，et al.Role of the Nrf2/HO-1 axis in bronchopulmonary dysplasia and hyperoxic lung injuries[J].Clin Sci，2017，131：1701-1712.

[20]Wang Z，Guo S，Wang J，et al.Nrf2/HO-1 mediates the neuroprotective effect of mangiferin on early brain injury after subarachnoid hemorrhage by attenuating mitochondria-related apoptosis and neuroinflammation[J].Sci Rep，2017，7（1）：11883.

[收稿日期]2022-12-09

本文引用格式：何金俊，岑瑛.胰激肽原酶對背部皮瓣損傷大鼠皮瓣存活及炎癥因子與氧化應激的影響[J].中國美容醫學，2024，33（1）：54-58.