水產動物維生素D3需求、吸收和轉運及其與糖脂代謝的關系

柳聲贊， 羅 智

(華中農業大學水產學院，分子營養實驗室，湖北 武漢 430070)

維生素D3是一種非常重要的維生素，在調控腸道和腎臟上皮細胞中鈣磷元素的吸收以及骨鈣的調用過程發揮了重要作用[1]。此外，維生素D3可調控先天免疫和獲得性免疫，其免疫調節作用對于機體抗病能力極為重要[2]。對于魚類來說，維生素D3的生理功能體現為促進魚體生長，增強免疫力[3]。如Sivagurunathan等[4]發現，維生素D3可顯著增加金頭鯛(Sparus aurata)全魚鈣磷比例，而維生素D3缺乏則會導致其骨骼發育異常，礦化程度降低。近年來有學者研究了維生素D3對水產動物生長發育的調控作用，確定了水產動物對維生素D3的最佳需求量，因此，有必要對近期維生素D3的研究進展進行綜述，總結維生素D3對水產動物機體代謝的調控作用和機制，以期增進我們對維生素D3營養生理功能的理解。

1 水產動物機體維生素D3來源、需求量及影響因素

1.1 維生素D3來源

維生素D是一種機體必需的脂溶性營養素，為固醇類衍生物，包含維生素D2-D7共7個成員，其中最重要且在動物體內廣泛存在的為維生素D3[5]。在動物機體內，維生素D3需要轉化為有激素活性的1α,25-二羥基維生素D3(1α,25(OH)2-VD3，1,25D3)繼而執行調節細胞代謝的功能[6]。一些陸生動物表皮內存在7-脫氫膽固醇(7-DHC)，可以在太陽光的照射下產生維生素D3并在肝臟和腎臟中進一步代謝為1,25D3[7]。除此之外，陸生脊椎動物可以通過食物獲取維生素D3，食物中獲取的維生素D3或25-羥基維生素D3(25OH-VD3，25D3)經過肝臟和腎臟的代謝產生1,25D3[8]

相對于陸生動物，水產動物受到陽光照射量和自身限制的影響而幾乎不能合成維生素D3。Garefino等[9]的研究表明，海水綠蠵龜(Chelonia mydas)暴露于太陽光照后血漿中維生素D3的含量升高，表明綠蠵龜可通過紫外線的照射產生維生素D3。然而，越來越多的研究認為，魚類因不能接收到充分的太陽輻射而幾乎不能自身合成維生素D3。Sunitarao等[10]使用和太陽光紫外線等效的300 nm紫外光照射莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)，發現魚體內的7-DHC含量有所降低，同時維生素D3的含量顯著上升，不過15 h照射的轉換效率僅為0.13%，表明魚類雖然可以像陸生脊椎動物一樣通過光化作用合成維生素D3,但卻不是自然條件下體內積累維生素D3的主要方式。Sugisaki等[11]的研究表明金魚體內7-DHC不能合成1,25D3。然而魚類肝臟和肌肉等組織中儲存著大量的維生素D3[12]。對于甲殼類和貝類，由于是底棲類動物且具有外殼，通常認為其難以合成維生素D3。因此，水產動物需通過食物獲取維生素D3。人工養殖條件下，飼料中維生素D3是水產動物機體所需維生素D3的主要來源。

1.2 維生素D3的需求量

缺乏維生素D3對水產動物產生不利影響，包括生長性能下降等[13]，飼料中適宜的維生素D3可促進水產動物的生長。Lock等[12]總結了2010年以前部分養殖魚類對維生素D3的需求量，為了避免重復，本文僅系統概括最近12年內(2011—2022年)有關貝類、蝦蟹類以及魚類共23種水產動物(包含10種淡水魚類、8種海水魚類、1種棘皮類、2種甲殼類、2種軟體動物)對維生素D3的最佳需求量 (表1)。

1.3 維生素D3需求的影響因素

飼料脂質含量對于鱸魚的研究發現，使用魚粉作為蛋白源的飼料來飼養大口黑鱸，其達到最大增重率所需維生素D3的含量[40]較使用酪蛋白作為蛋白源的飼料來飼喂歐洲鱸達到最大增重率所需維生素D3的含量高[24]。由于維生素D3在腸道中以類脂質轉運的方式被吸收[41]，因此，過多的脂質可能通過與維生素D3形成競爭關系，從而降低維生素D3的吸收，飼料中維生素D3的添加量需要相應地增加，才能滿足最佳維生素D3攝取。

水產動物的生長發育階段不同生長階段的水產動物對維生素D3的需求不同。Liu等[36-37]研究表明，達到最大生長時幼蟹對維生素D3需求量較稚蟹要高，而達到最大蛻殼頻率時幼蟹的需求量則約為稚蟹的2倍，由此可見，蟹類生長發育的早期對維生素D3需求量要高于發育后期，在魚類中也得出了類似的結論[28-29]。水產動物生長初期，代謝較強，對維生素D3的需求量也相對較高。

水產動物生存環境對比淡水和海水水產動物對維生素D3的需求量，發現海水動物需求量通常更低。原因之一可能是海水中鈣等微量礦物元素比淡水豐富，從而使海水動物對維生素D3介導的鈣磷平衡調節的依賴性比淡水動物低，因而海水動物對維生素D3的需求量相對淡水動物較低[34]，另一方面，淺海養殖的動物相比淡水動物能更多的暴露于太陽光輻射，可以合成一部分機體所需維生素D3。

評價指標通常情況下，增重率(WG)是評價維生素D3需求量的常見指標。除此之外，不同的檢測指標下水產動物對維生素D3的需求量會不同。如Liu等[36-37]以蛻殼頻率、增重率和特定生長率來評價中華絨螯蟹對維生素D3的需求量，發現飼料中維生素D3添加水平要達到10000 IU/kg，中華絨螯蟹才能達到最大的蛻殼頻率，而添加水平為5685.43和6496 IU/kg，增重率和特定生長率分別達到最大水平。日本花鱸達到最大WG所需飼料維生素D3含量為431 IU/kg，而肝臟達到最大維生素D3積累所需水平則為2444.4 IU/kg[25]。

評價需要量所用的數學模型部分研究以獲得最大增重組對應的維生素D3含量為需求量，也有研究則會在獲得相關數據的基礎上，運用數學模型回歸擬合分析得出維生素D3需求量。常用數學模型有折線回歸模型和二階回歸模型。而不同擬合模型也會影響評價維生素D3的需求量，如Shao等[26]發現，二階回歸模型下所得的大菱鲆對維生素D3的最佳需求量是折線回歸模型下的兩倍多。

水中浮游動植物豐富度自然狀態下，浮游動植物可以通過光化學反應合成維生素D3，水產動物通過浮游生物食物鏈獲取并積累維生素D3[42-43]，因此，人工養殖條件下水質中浮游動植物的豐富度可對水產動物對維生素D3的需求量有影響，水質中浮游動植物含量越高，水產動物對飼料維生素D3的需求量越低。

其他影響因素關于影響魚類腸道對維生素D3吸收的因素研究較少，部分在動物模型或模式細胞上獲得的研究結果可供一定程度的參考。如長鏈脂肪酸可抑制腸道細胞對維生素D3的吸收能力，使用混合脂肪酸則可以緩解這種抑制作用[44]。飼料中添加高比值的(單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸含量比)脂肪酸可增加血漿中維生素D3含量[45]。由于維生素D屬于甾醇類化合物，因此食物中的β-谷甾醇、植物固醇等來自植物的甾醇類化合物可和維生素D3的吸收形成競爭關系，降低腸道維生素D3的吸收[46]。

2 水產動物維生素D3吸收、轉運和代謝機制

研究表明，魚類在其生命周期中一直在積累維生素D3，且積累量隨著飼料維生素D3含量增加而增加[12,29,31]，在肝臟、脂肪和肌肉會積累大量的維生素D3[12]。水產動物維生素D3通過消化腸道吸收，經過血液循環運輸到肝臟，再經過肝臟代謝產生具有激素活性的1,25D3。

2.1 維生素D3的吸收

水產養殖動物主要從飼料中獲取維生素D3，腸道是吸收的主要器官。腸道維生素D3吸收機制和脂類類似[44]，因為腸道中維生素D3在吸收前和磷脂、膽固醇和甘油酯等形成膠團，維生素D3在膠團中占比越多，則吸收越多，膠團化的維生素D3以類膽固醇的形式參與轉運[41]。脂蛋白是盲鰻(Myxini)、灰斑竹鯊(Chiloscyllium griseum)和藍子魚(Siganus)等海水魚類25D3跨膜運輸的主要機制[47]。水產養殖動物腸道維生素D3的吸收機制尚處于推測狀態，有關哺乳動物腸道維生素D3的吸收機制未完全闡明。如Reboul等[48]研究表明，抑制腸道細胞系Caco-2中SR-BI和NPC1L1后，維生素D3的吸收顯著降低，腎臟細胞系HEK過表達SR-BI、NPC1L1和CD36則會顯著增加維生素D3的吸收，在小鼠(Mus musculus)腸道中過表達SR-BI也會顯著增加維生素D3的吸收，表明膽固醇轉運載體SR-BI、CD36和NPC1L1參與腸道維生素D3的吸收。此外，維生素D3還可通過被動擴散的方式參與轉運，但不是主要方式[48]。在腎小管維生素D3穩態調控上，存在megalin和cubilin受體蛋白介導的維生素D3-DBP復合體胞吞吸收方式[49-50]。腸道也是魚類和蝦蟹類營養物質吸收的主要部位，因此，水產動物尤其是魚類或許也通過上述方式吸收維生素D3，但仍需要進一步研究以探討水產動物腸內詳細吸收機制。

2.2 維生素D3的轉運

各種形式維生素D3在血液中與維生素D3結合蛋白(vitamin D binding protein, DBP)結合進行運輸，經血液循環到達肝臟、腎臟或其他器官進行代謝或發揮調控作用[51]。在魚類中，目前已確定了斑馬魚(Danio rerio)的DBP，該蛋白在不同動物類群之間相對保守[52]。吸收的維生素D3和其代謝物通過結合到DBP后在血液中轉運[53]，DBP和其他白蛋白一起結合了血液循環中99%的維生素D3[53]。目前尚未有蝦蟹類或軟體類DBP的研究報道。

2.3 1,25D3在水產機體內合成和代謝機制

食物中攝入的維生素D3必須經過兩步氧化步驟轉化為有活性的1,25D3才能作為激素參與到細胞生命過程。對于哺乳動物而言，維生素D3的兩步氧化過程分別發生在肝臟和腎臟中。魚類則不同，Takeuchi等[54]的研究表明，草魚和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的肝臟中存在1,25D3合成第二步所需的酶即CYP27B1，且活性比腎臟中的強，25D3在肝臟中生成后會繼續在肝臟中立即合成1,25D3，表明魚類肝臟可以替代腎臟完成活性維生素D3合成的第二步。Bevelander等[55]克隆出金頭鯛cyp27a1基因，與哺乳動物不同的是該基因在金頭鯛肝臟中的表達量非常低。Peng等[56]發現，敲除斑馬魚的cyp2r1基因后顯著降低了體內25D3的合成量，第二步cyp27b1和cyp24a1等維生素D3代謝相關基因已經得到確認。此外，斑紋隱小鳉(Kryptolebias marmoratus)和斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)體內和人類(Homo sapiens)的直系同源基因cyp2r1已得到確定[57-58]。圖1指出了魚體內維生素D3的代謝過程。

圖1 維生素D3在水產動物體內的代謝過程Fig. 1 Vitamin D3 metabolism process in aquatic animals

代謝產生的1,25D3進入血液循環到達其他細胞，作為細胞外信號調節細胞活動，也可作用到肝細胞本身從而調節肝細胞代謝。1,25D3調節細胞活動有兩種機制，第一種是作為第一信使通過與維生素D3的膜受體(membrane vitamin D receptor,mVDR)結合誘導下游激酶級聯信號通路的產生而對外界信號產生快速響應。另一種則是作為配體與細胞質中維生素D3的核受體(nuclear VDR,nVDR)結合后移位至細胞核并與核RXR(retinoid X receptor)形成轉錄因子復合物，該轉錄因子復合物可識別并結合目標基因啟動子序列上的維生素D3響應元件(VDRE)，從而調控目標基因的表達[59]。

維生素D3膜受體有兩種類型，第一種是新型維生素D3膜受體 (membrane associated, rapid response steroid-binding, 1,25D3-MARRS)，維生素D3結合到MARRS后可誘導下游產生激酶信號級聯反應，維生素D3與另一種膜受體結合則會伴隨細胞膜穴樣內陷的產生，從而產生下游的非基因組信號通路[60-61]。Larsson等[62]報道大西洋鱈(Gadus morhua)和鯉的腸上皮細胞基底側膜可能具有24,25D3的受體，此受體可在數秒內導致腸細胞內Ca2+的釋放，表明該受體介導了由24,25D3誘導產生的快速非基因組途徑響應。Larsson等[63]還發現虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腸上皮細胞基地側膜具有1,25D3受體，并可響應1,25D3而增加細胞內Ca2+含量。Nemere等[64]發現，鯉腸上皮細胞基底側膜上也具有1,25D3受體，且該受體可響應1,25D3而在5 min內顯著增加腸上皮細胞中PKC (protein kinase C)的酶活性。目前尚未分離鑒定得到水產動物1,25D3-MARRS和其他膜受體的基因序列，但可推測1,25D3是魚類機體代謝和生長的重要信號分子。

另一種維生素D3受體為核維生素D3受體[58]。眾多研究報道了水產動物體內nVDR的基因全序列以及對維生素D3的表達響應。Suzuki等[65]首次克隆出牙鲆體內vdrα和vdrβ兩種亞型，二者在氨基酸序列上具有86%的同源性，其中vdrα同人、小鼠和大鼠(Rattus norvegicus)的vdr具有70%以上的同源性。Maglich等[66]報道紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)體內亦有vdrα和vdrβ兩種亞型，其中vdrα在各組織中廣泛表達而vdrβ僅在腸道中表達。Whitfield等[67]克隆出七鰓鰻(Petromyzontidae)vdr基因，該vdr基因在COS-7細胞中表達后對1,25D3具有很大的結合活性，且結合后能反式激活包含有大鼠和人類vdre序列的報告基因，此研究首次報道魚類VDR能調控哺乳動物基因表達，說明VDR在脊椎動物中的作用具有保守性。Sugiura等[68]報道虹鱒腸道和腎臟vdr基因的表達受到低磷飼料的調節，與維生素D3協同調節機體磷穩態平衡。Lock等[69]報道三文魚體內具有全長以及兩個亞型變體的vdr表達。Howarth等[70]克隆出青鳉(Oryzias latipes)體內vdr的兩種旁系同源物vdrα和vdrβ，其中VDRβ與1,25D3的結合活性高于VDRα，為人類體內VDR的等效直系同系物。Craig等[71]報道斑馬魚肝臟和腸等器官中都有VDR蛋白表達，其中1,25D3可誘導腸道VDR蛋白表達。劉群等[72]從虹鱒腎臟中克隆出了vdrα的全長cDNA序列。Kollitz等[73]研究表明鰩(Rajiformes)和多鰭魚的VDR具有1,25D3結合活性，并能和人類的RXR形成反式激活復合體激活報告基因的表達。Cheng等[22]報道了黃顙魚體內vdr基因表達量會隨飼料維生素D3含量增加而先增加后降低。Liu等[37]報道了中華絨螯蟹肝胰腺中vdr基因的表達量隨著飼料維生素D3的添加呈現先增加后降低的趨勢。Huang等[74]克隆出皺紋盤鮑體內vdr基因序列，且vdr在肝胰腺和外套膜中的表達量顯著高于其他組織，vdr基因干擾實驗表明，維生素D3可通過VDR抑制細胞凋亡和誘導細胞自噬。Goks?yr等[75]報道大西洋鱈體內也具有vdrα和vdrβ兩種亞型。上述這些研究均表明水產動物內廣泛存在vdr基因的表達，其中魚類通常具有vdrα和vdrβ兩個亞型，這些nvdr基因可響應維生素D3而調節機體生命活動，為VDR調節水產動物機體代謝研究奠定了基礎。圖2總結了水產動物機體內維生素D3發揮作用的機制。上述眾多研究已經證實水產動物體內vdr基因響應維生素D3的表達，為后續研究奠定基礎。維生素D3轉化成1,25D3，通過VDR調控水產動物體內糖脂代謝，因而對機體生長代謝具有重要作用。

圖2 1,25D3作為第一信使和VDR配體調控魚類生命活動的機制Fig. 2 Mechanisms of calcitriol as the first messenger cooperating with VDR ligand to regulate life activity

3 維生素D3調控水產動物體內糖和脂類代謝

以往有關維生素D3的研究主要集中在對機體鈣磷平衡和骨骼代謝以及機體免疫的影響[25,76]。然而最近有關維生素D3調控機體營養物質代謝也引起重視。從營養學的角度，糖類的分解代謝可為細胞活動提供能量，而脂類是機體內的儲能物質，因此很有必要弄清楚維生素D3和糖、脂代謝的關系。

3.1 維生素D3調控糖類代謝及機制

糖類是三大營養物質之一，負責代謝產生機體生命活動所需的能量或以糖原的形式儲存能量。Miao等[14]研究表明，團頭魴血清中胰島素含量隨著飼料中維生素D3添加水平增加而先上升后下降，添加量達到2000 IU/kg達到最高，血清葡萄糖呈現先降低后上升的現象，表明添加適量維生素D3可通過升高胰島素含量而增強團頭魴機體葡萄糖分解代謝過程。Li等[38]研究表明，飼料中添加1000 IU/kg維生素D3可顯著緩解由高糖飼料導致的皺紋盤鮑血清葡萄糖含量的上升，進一步研究發現，維生素D3可增強肝胰腺中己糖激酶(HK)基因表達量和酶活性，提高肝胰腺胰島素受體基因ir和葡萄糖轉運載體基因glut1的表達量，提高肌肉中ir表達量和糖原磷酸化酶PYG及糖原合成酶GS的活性，表明維生素D3可通過增強葡萄糖分解以及糖原合成來降低血漿葡萄糖含量。

目前尚未有以水產動物為研究對象探究維生素D3對糖類代謝影響的報道。在小鼠實驗中，Mutt等[77]發現，飼料維生素D3缺乏會誘導胰島素抵抗，導致血漿葡萄糖含量升高，補充維生素D3則可通過激活PI3K-Akt-FOXO1途徑顯著抑制糖異生，并同時增加肝糖原含量從而防止胰島素抵抗。

3.2 維生素D3調控脂代謝及機制

脂類是機體內三大營養物質之一, 同時也是機體內最重要的儲能物質。國內外研究均表明維生素D3可以調節水產動物體內的脂質代謝過程。Miao等[14]的研究發現，隨著飼料維生素D3添加水平提升，團頭魴血清TG整體呈現先下降后上升的趨勢，添加水平為1000 IU/kg時達到最低，8000 IU/kg時達到最高，說明飼料適量維生素D3添加具有降低機體脂質沉積的作用，但是添加過多則適得其反。對于吉富羅非魚, 喻麗娟等[18]發現，隨著飼料維生素D3的添加, 全魚和肝臟中脂質含量呈現先上升后下降的趨勢, 當添加量超過200 IU/kg后可顯著降低脂質沉積。對于點帶石斑魚(Epinephelus coioides), He等[28]研究發現，隨著飼料中維生素D3的添加, 肝臟中脂質含量顯著下降,當維生素D3添加達到4000 IU/kg時具有最佳的降脂效果，表明飼料維生素D3的添加使得肝臟激素敏感性脂肪酶HSL、脂肪酶HL和脂蛋白脂肪酶LPL的活性呈現顯著上升后又顯著下降的趨勢，hl基因表達量呈現同樣的趨勢，表明一定劑量的維生素D3添加可通過增加脂肪酶的活性降低脂質沉積，而過多的維生素D3則正好相反。Lin等[29]的研究同樣發現點帶石斑魚血清中TG含量隨飼料維生素D3水平的增加呈現下降的趨勢，高密度脂蛋白膽固醇HDL-C呈現先上升后下降的趨勢，添加量達1000 IU/kg含量最大，表明維生素D3的添加顯著降低肝臟脂肪酸合成酶FAS活性和基因表達量，肝脂肪酶HL活性和基因的表達量呈現先上升后下降的趨勢，與He等[28]的研究結論相同。綜上所術，維生素D3可降低魚體脂質沉積，但是維生素D3在海水魚類和淡水魚類調控脂質代謝具有一定差異。在蝦蟹類，Dai等[35]研究發現，以19 200 IU/kg為界限，凡納濱對蝦肝胰腺內脂肪生成相關基因srebp、acc1和fas的表達量隨維生素D3添加水平呈現先上升后下降的趨勢，而脂質分解相關基因cpt1、aco、fabp和fatp的表達量隨維生素D3添加水平呈現上升的趨勢，表明維生素D3在一定范圍內通過增加肝胰腺脂肪含量，從而具有促生長效應，同時維生素D3可降低肝臟脂質沉積。對于貝類，Yang等[78]的研究顯示，維生素D3的添加水平為10 000 IU/kg時，馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)肝胰腺內鞘脂的代謝與添加水平為1000 IU/kg時有顯著差異。

目前有關維生素D3調控水產動物脂類代謝的機制研究較少。斑馬魚是一種模式水產動物，常被用于研究脂質代謝的分子機制。如Peng等[56]發現，將斑馬魚體內25D3合成基因cyp2r1敲除后，內臟脂肪組織脂肪細胞增多，脂肪蓄積，體外實驗表明，配體1,25D3的缺乏導致斑馬魚VDR無法結合pgc1α的啟動子區域而降低了其基因和蛋白表達水平，使得下游線粒體生物生成相關通路NRF-1和ERRα通路受到抑制，脂肪合成和攝取相關PPARγ通路得到促進，補充25D3后相應通路又得到緩解，表明正常情況下，1,25D3可通過線粒體途徑促進脂肪組織脂質代謝，避免脂質沉積。Dai等[79]的研究發現，維生素D3可顯著緩解由高脂飼料導致的凡納濱對蝦肝胰腺中肝臟脂質合成基因通路相關基因srebp、acc1和fas的表達量增加，以及脂質分解相關通路基因cpt1、fabp和fatp的表達量降低，進而緩解高脂飼料導致的肝胰腺脂質沉積，表明維生素D3可促進凡納濱對蝦肝胰腺中經典自噬通路AMPKKα-PINK1-Parkin的激活而誘導線粒體自噬，以降低肝胰腺脂質沉積。

綜上，維生素D3可通過誘導相關酶活性的變化而調控脂質代謝，其中維生素D3可通過誘導自噬而減弱糖或脂代謝對細胞的不利影響。

4 總結與展望

當前有關水產動物維生素D3營養生理的研究主要集中在對它的需要量的探討，而有關水產動物對飼料維生素D3的吸收、轉運和代謝的研究極其缺乏。同時，有關維生素D3對糖、脂代謝的影響研究還非常零碎，不系統。今后需加強有關水產動物維生素D3的代謝、調控機制，以及維生素D3調控糖、脂代謝機理的研究，為水產飼料業和水產養殖業發展提供更多參考。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）