大黃魚C型凝集素受體Clec4e的分子鑒定及凝集特性

張鑫洛， 王永陽， 吳子良， 黃小紅,，陳新華， 張偉妮,*

(1. 海水養殖生物育種全國重點實驗室，福建省海洋生物技術重點實驗室，福建 福州 350002；2. 福建農林大學，中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002)

大黃魚(Larimichthys crocea)俗稱黃花魚，屬鱸形目(Perciforms)石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬(Larimichthys)，主要分布在黃海南部、東海南部及南海北部海域。據《2021年中國漁業統計年鑒》，2020年我國大黃魚產量達25.4萬t，占海水魚類養殖總產量的14.51%，穩居養殖海水魚類之首[1]。然而，大黃魚也是病害極其多發的魚類，長期遭受溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)[2]、變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)[3]、刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)[4]和虹彩病毒(Iridovirus)[5]等病原的感染，遭受了重大的經濟損失。因此，探究大黃魚抗病原感染的分子機制，制定有效的免疫防治方案，是其產業可持續發展的重要策略。

魚類作為低等脊椎動物，具有發達的先天性免疫和相對完善的獲得性免疫。當外界病原體入侵時，先天免疫作為第一道防線發揮著重要作用[6-8]。而先天性免疫的激活依賴于模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，如Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、NOD樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)、RIG-I樣受體(retinoic acid-inducible gene-Ilike receptors，RLRs)以及凝集素受體等，它們識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，如脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白、核酸等，從而激活免疫系統來清除病原或維持內環境的穩態[9]。凝集素受體是一種以非共價可逆地結合碳水化合物的非酶蛋白或糖蛋白，最早在植物提取物中發現，具有血凝活性，現已證實廣泛存在于各種生物體中[10]。動物凝集素受體通常被分為五大類∶C型(Ca2+依賴型)、S型(又稱半乳糖凝集素)、I型、P型以及正五聚體蛋白[11]。其中，C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CTLR)是最早發現的動物凝集素之一，也是凝集素家族中種類和數量最多的一個家族，主要通過識別和結合病原微生物表面的脂多糖、肽聚糖、甘露糖及葡聚糖等糖類結構的PAMPs激活宿主先天性免疫[6]。部分CTLR含有跨膜結構域，作為膜受體發揮作用，部分CTLR也可作為分泌蛋白發揮作用。在功能上，CTLR被證實可參與多種免疫過程，包括病原體識別[12]、細胞黏附[13]、吞噬[14]、抗原遞呈細胞與T細胞的相互作用[15]、T淋巴細胞的活化與調控[16-17]等，甘露糖結合凝集素還具有激活補體的功能[13]。

目前，已經在硬骨魚中鑒定出大量的CTLR，并證實其參與了宿主抗細菌感染的防御。如香魚(Plecoglossus altivelis)CTLR—PaCD209L能夠結合革蘭氏陽性和陰性菌，用抗體阻斷PaCD209L后，單核/巨噬細胞的吞噬作用和殺菌活性顯著降低[18]；半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的CTLR (CsCD94)與細菌孵育后降低了該菌的體外存活率[19]；許氏平鲉(Sebastes schlegelii)SsLec1具有抑制細菌感染的作用[20]；嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后草魚(Ctenopharyngodon idella)甘露糖受體gcMR在肝臟、脾臟、頭腎和腸道中的表達均顯著上調[21]。在大黃魚中已被鑒定的CTLR有LcNTC和LcDC-SIGN，前者是一種具有廣譜細菌凝集活性的分泌型CTLR，在肝臟、脾臟和頭腎中的表達量經副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)刺激后均顯著升高[22]；后者為膜型CTLR，具有紅細胞凝集活性和對半乳糖的偏好性，對2種食源性致病菌大腸桿菌(Escherichia coli)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)具有凝集作用[23]。在大黃魚基因組數據庫中已注釋的CTLR家族成員達20多種[24]，因而有必要對大黃魚CTLR的分子特征及功能進行深入研究。

我們前期從溶藻弧菌感染的大黃魚頭腎組織轉錄組[25]及頭腎巨噬細胞轉錄組中，均發現一個CTLR基因—C型凝集素結構域家族4成員E基因(C-type lectin domain family 4 member E gene，Clec4e)的表達顯著上調。Clec4e又稱巨噬細胞誘導的C型凝集素(the macrophage-inducible C-type lectin，Mincle)，主要分布在單核/巨噬細胞表面[26-27]。哺乳類Clec4e已被證實能夠識別細菌、真菌等病原[28-30]，而在魚類中鮮見報道。為此，本實驗以大黃魚Clec4e為研究對象，分析其分子特征，探究其在不同組織與免疫細胞中的表達分布、細菌感染后表達模式的變化，及其凝集活性和糖結合特異性，實驗結果為進一步揭示硬骨魚CTLR在先天免疫中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用大黃魚購自寧德市富發水產有限公司，體長(15±3) cm，體重(50±10) g；小鼠(Mus musculus)、新西蘭白兔(Oryctolagus cuniculus)購自閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限公司；無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和坎氏弧菌(V.campbellii)均為實驗室保藏水產病原菌。本研究獲得了福建農林大學實驗動物管理和使用倫理委員會批準，實驗過程中操作人員嚴格遵守福建農林大學實驗動物倫理規范，并按照福建農林大學實驗動物管理和使用倫理委員會制定的規章制度執行。

Pfu DNA 聚合酶、Trans1-T1 Phage Resistan感受態細胞、Trans BL21(DE3)化學感受態細胞、pEASY?-Basic Seamless Cloning and ASSembly Kit同源重組試劑盒均購自北京全式金生物技術股份有限公司；表達載體pET-32a購自德國默克集團；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自上海普洛麥格生物產品有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自OMEGA公司；DNA Marker、Protein Marker購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；實時熒光定量PCR試劑2×SYBR Green Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖親和層析介質(Ni)購自GE公司；限制性內切酶及其緩沖液購自ThermoFisher公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、重組凝血酶購自北京索萊寶科技有限公司；培養基BHI、TSB、2216E均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 引物

本實驗所用基因LcClec4e(登錄號∶ON241310.1)和Lcβ-actin(登錄號∶XP_027140724.1)的引物均由福州博尚生物技術公司合成，具體信息見表1。

表1 引物信息Tab. 1 Primers information

1.3 LcClec4e基因克隆及生物信息學分析

前期通過對溶藻弧菌感染的大黃魚頭腎組織及頭腎巨噬細胞轉錄組分析發現Clec4e基因表達上調，因此，基于大黃魚基因組數據庫中Clec4e基因序列設計了一對特異性引物LcClec4e-F/R (表1)。以大黃魚頭腎總RNA反轉錄得到的第一鏈cDNA為模板，以LcClec4e-F/R為引物，使用Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增，PCR體系參考Pfu DNA聚合酶說明書。PCR程序∶95 °C預變性5 min；95 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min，35個循環；72 °C 5 min。PCR產物回收后與Blunt simple克隆載體連接后，轉化T-1感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序。

通過BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi) 進行序列同源性比對；利用ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)預測蛋白質的分子量(MW)和等電點(pI)，SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)預測蛋白質的保守結構域；利用TMHMMServerv.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜區；利用DNAMAN8.0進行氨基酸多重序列比對；利用MEGA 7.0中的最大似然法構建系統發育樹。構建系統發育樹所用物種氨基酸序列的GenBank登錄號見表2。

表2 大黃魚與其他魚類Clec4e氨基酸序列Tab. 2 The amino acid sequences of L. crocea and other fish Clec4e

1.4 LcClec4e在大黃魚組織與免疫細胞中的表達分析

取健康的大黃魚3尾，丁香酚麻醉后，使用真空采血管(抗凝)進行尾靜脈采血，剖取各組織(頭腎、脾臟、鰓、肝臟、頭腎、腸、胃、肌肉、皮膚、腦和心臟)，大黃魚原代頭腎巨噬細胞(primary head kidney macrophages，PKM)、原代頭腎淋巴細胞(primary head kidney lymphocytes，PKL)和原代頭腎粒細胞(primary head kidney granulocytes，PKG)的分離參照本課題組先前的方法[31]。組織和細胞RNA提取方法均按照試劑盒Promega LS1040操作說明進行，反轉錄反應參照Eastep?RT Master Mix操作說明進行。以反轉錄產物為模板，qLcClec4e-F/R為引物，qLcβ-actin為內參進行實時熒光定量 PCR，反應體系∶9.8 μL cDNA(1∶100，體積比)，0.1 μL qLcClec4e-F/qLcβactin-F，0.1 μL qLcClec4e-R/qLcβ-actin-R，10 μL 2×qPCR SYBR Green Master Mix，總體積20 μL。實時熒光定量PCR程序∶95 °C 15 min；95 °C 10 s，58 °C 20 s，72 °C 32 s，40個循環。每個樣品3個重復。

將分離后的PKM、PKL和PKG分別培養在6孔細胞培養板中，每孔細胞數為2×106個，28 °C培養5 h后，使用終濃度為1×107CFU/mL的滅活溶藻弧菌刺激，分別在1、2、4、8和16 h收集細胞，實時熒光定量PCR檢測LcClec4e基因表達水平的變化。

采用2?△△CT法[32]計算LcClec4e的相對表達量，并用SPSS17.0進行統計學分析。

1.5 構建LcClec4e胞外域(LcClec4e-ex)的原核表達載體

LcClec4e-ex基因克隆以LcClec4eORF的克隆載體為模板、LcClec4e-ex-F/R為引物，擴增LcClec4e-ex，PCR體系見Pfu DNA聚合酶說明書，PCR程序∶95 °C 5 min；95 °C 30 s，62 °C 30 s，72 °C 30 s，35個循環；72 °C 10 min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

原核表達載體的線性化使用EcoR I與Hind Ⅲ限制性內切酶對質粒pET-32a進行雙酶切線性化操作。酶切體系∶1 μLEcoR I，1 μLHindⅢ，5 μL 10×Fast Digest Buffer，質粒5 μg，無核酸酶水補齊50 μL。酶切反應條件∶37 °C 2 h。酶切完畢后使用膠回收試劑盒進行DNA純化，操作步驟見OMEGA D2500-02說明書。

LcClec4e-ex連接線性化pET-32a連接反應體系∶5 μL 2×Basic Assembly Mix，4 μL線性化pET-32a，1 μLLcClec4e-ex，總體積10 μL；程序∶50 °C 15 min。將連接產物加入50 μL剛解凍的T-1感受態細胞，輕柔混勻，置于冰上30 min。42 °C熱休克45 s，立即置于冰上2 min。加入250 μL LB培養基，37 °C 200 r/min培養1 h，取200 μL菌液均勻涂抹在氨芐抗性的LB固體培養基上，37 °C過夜培養。挑取單菌落使用通用引物進行菌落PCR，將陽性單克隆測序。

1.6 LcClec4e-ex的重組表達與純化

重組LcClec4e-ex(rLcClec4e-ex)的表達將測序正確的LcClec4e-ex原核表達載體轉化至Trans BL21(DE3)感受態細胞。挑取長勢良好的單菌落進行菌落PCR鑒定，將陽性單菌落接種至LB/Amp+液體培養基，200 r/min 37 °C培養至OD600為0.4～0.6。加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導劑，200 r/min 16 °C過夜誘導。離心收集誘導表達的菌體，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸洗滌 2次，高壓破碎，4 °C 12000×g離心10 min，將上清和沉淀分別進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測。

rLcClec4e-ex的純化向菌體破碎后的上清中加入適量體積的瓊脂糖親和層析介質(Ni)，4 °C輕搖20 min使Ni介質充分結合目的蛋白。將上清蛋白與Ni介質轉移至層析柱中并使液體流盡。向Ni柱中加入雜蛋白洗滌緩沖液(Tris 20 mmol/L，NaCl 0.2 mol/L，咪唑100 mmol/L，pH 7.4)，考馬斯亮藍G250檢測流出液，直至考馬斯亮藍G250幾乎不變藍，則說明雜蛋白已被完全洗滌。向Ni柱中加入目的蛋白洗脫緩沖液(Tris 20 mmol/L，NaCl 0.2 mol/L，咪唑300 mmol/L，pH 7.4)，用考馬斯亮藍G250檢測流出液，直至考馬斯亮藍G250幾乎不變藍，則說明目的蛋白已被完全洗脫。SDS-PAGE檢測目的蛋白純度。根據說明書用BCA法測定蛋白濃度(BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術股份有限公司)。

rLcClec4e-ex融合標簽的切除將純化的目的蛋白透析至酶切緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)。根據蛋白濃度加入適量的重組凝血酶37 °C酶切2 h。將蛋白溶液與Ni介質輕搖孵育20 min，收集流出液。

1.7 凝集實驗

參照已有文獻[22]的方法。使用抗凝采血管取小鼠、新西蘭白兔和大黃魚血液，2000×g離心15 min去除上層血漿，用10倍紅細胞體積的TBS(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.4)重懸，2000×g離心5 min，棄上清液加入適量TBS配制成2%(體積百分比)紅細胞懸液。

將無乳鏈球菌接入BHI培養基37 °C振蕩培養；嗜水氣單胞菌用LB培養基，變形假單胞菌用TSB培養基，溶藻弧菌、副溶血弧菌和坎氏弧菌用2216E培養基，28 °C振蕩培養。待菌液OD600達到約0.6 ，6000×g離心 5 min，收集菌體，TBS 洗滌 3次，每次5 min，重懸菌體，將濃度調整為2.0×108CFU/mL。

紅細胞凝集實驗在V型96孔血凝板中進行，細菌凝集實驗在96孔細胞培養板進行。將rLcClec4e-ex (1.2 mg/mL)梯度稀釋，每孔加入50 μL，再向每孔加入50 μL血細胞/細菌并充分混勻，室溫放置40 min。對溶解在TBS-Ca (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，pH 7.4)中的rLcClec4e-ex蛋白進行同樣的處理以檢測rLcClec4e-ex的凝集活性是否為Ca2+依賴性。同時用同濃度的rTrxA標簽蛋白做為陰性對照。鏡檢觀察血細胞/細菌凝集效果，記錄最小凝集濃度。實驗重復3次。

1.8 糖抑制實驗

為檢測rLcClec4e-ex的糖類特異性結合能力，以變形假單胞菌為實驗菌，選取D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、D-半乳糖、D-海藻糖、α-乳糖、蔗糖和脂多糖等9種糖類，進行糖抑制實驗。在96孔板加入25 μL梯度稀釋的上述糖類，再加入25 μL rLcClec4e-ex(濃度為對變形假單胞菌的最小凝集濃度)混合物于室溫孵育30 min后，加入50 μL的變形假單胞菌懸液(2.0×108CFU/mL)，輕輕吹打混勻，室溫孵育1 h。鏡檢每種糖類是否對凝集具有抑制作用，并記錄最小抑制濃度。實驗重復3 次。

2 結果

2.1 LcClec4e的序列分析

LcClec4e的cDNA全長為1546 bp，包含一個309 bp的5′-非翻譯區(untranslated region，UTR)，一個771 bp的開放閱讀框(ORF)，一個466 bp的3′-UTR。LcClec4eORF編碼254個氨基酸殘基的蛋白質，預測的分子量和理論等電點分別為24.3 ku和4.99。推斷的LcClec4e蛋白包含一個跨膜區域(transmembrane region，47-69位氨基酸)和一個糖識別結構域(carbohydrate recognition domain，CRD，117～249位氨基酸)(圖1)。以LcClec4e氨基酸序列在現有數據庫中進行BLASTP比對，結果顯示，LcClec4e與黃姑魚等鱸形目魚類Clec4e序列的一致性較高，約為81.89%～92.58%。多序列比對結果顯示，各序列間具有較高的相似性，LcClec4e具有CTLR典型序列WIGL，6個高度保守的半胱氨酸殘基，碳水化合物識別基序EPN和WFD以及2個Ca2+結合位點(圖2)。系統進化分析顯示，魚類Clec4e聚成一簇，遠離鳥類和哺乳類組成的分支，其中LcClec4e與黃姑魚Clec4e的親緣關系最近(圖3)。

圖1 LcClec4e 序列分析跨膜區域和糖識別結構域分別藍色和粉紅色突出顯示；方框表示跨膜區；下劃線表示糖識別結構域。Fig. 1 Sequence analysis of LcClec4eTransmembrane region and carbohydrate recognition domain are shown in blue and pink, respectively; transmembrane region is shown with square frame; carbohydrate recognition domain is shown with underline.

圖3 最大似然法構建的Clec4e系統發育樹標尺(0.1)代表遺傳距離；節點處的數字是用 bootstrapping 算法進行 1000 次重復計算出的自展值(%)。Fig. 3 Maximum likelihood phylogenetic tree constructed based on Clec4e amino acid sequencesThe scale bar (0.1) represents the genetic distance; Numbers beside the internal branches indicate bootstrap values based on 1000 replications.

2.2 LcClec4e在大黃魚不同的組織和免疫細胞中的表達特征

LcClec4e在所檢測的10種組織中均有表達，其中在肝臟中表達最高、在腸中表達最少(圖4-a)。同時，LcClec4e在所檢測的3種原代免疫細胞中也均有表達，在原代頭腎巨噬細胞(PKM)中表達最高，其次是原代頭腎淋巴細胞(PKL)，在原代頭腎粒細胞(PKG)中表達最低(圖4-b)。經滅活溶藻弧菌刺激后，LcClec4e在3種免疫細胞中的表達都顯著上調，在PKG與PKM中的相對表達量在4和8 h達到最高，隨后均出現下調趨勢，而在PKL中則是持續表達上調(圖5)。

圖4 LcClec4e在大黃魚組織(a)和免疫細胞(b)中的表達譜(a) 1. 腸，2. 腦，3. 胃，4. 脾臟，5. 鰓，6. 頭腎，7. 心臟, 8. 肌肉，9. 皮膚，10. 肝臟，(n=3)；(b) 1. 原代頭腎粒細胞，2. 原代頭腎淋巴細胞，3. 原代頭腎巨噬細胞(n=3)。Fig. 4 Expression profiles of LcClec4e in tissues and immune cells(a) 1. intestine, 2. brain, 3. stomach, 4. spleen, 5. gills, 6. head kidney, 7. heart, 8. muscle, 9. skin, 10. liver (n=3); (b) 1. primary head kidney granulocytes, 2. primary head kidney lymphocytes, 3. primary head kidney macrophages (n=3).

圖5 滅活溶藻弧菌刺激后免疫細胞中LcClec4e的表達水平變化(a)原代頭腎粒細胞，(b)原代頭腎巨噬細胞，(c)原代頭腎淋巴細胞；n=3， “*”P＜ 0.05，“**”P ＜ 0.01。Fig. 5 Expression changes of LcClec4e in immune cells after stimulation with inactivated V. alginolyticus(a) primary head kidney granulocytes, (b) primary head kidney macrophages, (c) primary head kidney lymphocytes; n=3, * P ＜0.05 and ** P ＜0.01.

2.3 LcClec4e-ex的原核表達

PCR擴增出胞外段LcClec4e-ex，回收目的片段，得到約400 bp的片段，與預期大小一致。重組質粒pET-32a-rLcClec4e-ex誘導表達和純化的結果顯示，融合蛋白的大小為28 ku (含分子量為11.8 ku的TrxA標簽蛋白)，符合蛋白預期大小(28.6 ku)(圖6)。表達菌株經誘導后超聲破碎，SDS-PAGE分別檢測上清液與沉淀，發現rLcClec4e-ex大量存在上清液中，少量存在沉淀中。大量誘導表達取破碎的菌液上清液進行Ni柱親和層析純化后，將純化的rLcClec4e-ex的融合標簽切除，再次Ni柱親和層析純化后，SDS-PAGE檢測幾乎無雜帶。

圖6 rLcClec4e-ex的表達與純化M. 蛋白 marker；1. 上清液中的總蛋白；2. 純化后的蛋白；3. 酶切后的蛋白。Fig. 6 Expression and purification of rLcClec4e-ex proteinM. protein marker; 1. total protein in the supernatant; 2. the purified protein; 3. protein after enzyme digestion.

2.4 rLcClec4e-ex的凝集活性

純化的rLcClec4e-ex在TBS-Ca中能凝集小鼠和新西蘭白兔的紅細胞，對大黃魚紅細胞無凝集作用(圖版Ⅰ)；細菌凝集實驗顯示，rLcClec4e-ex能凝集嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌和坎氏弧菌，對副溶血弧菌和無乳鏈球菌無凝集作用(圖版Ⅱ)；在沒有Ca2+的情況下，rLcClec4e-ex對各種紅細胞和細菌均無凝集作用，可見其對紅細胞和細菌的凝集作用為Ca2+依賴型。同時，在rTrxA處理的對照中沒有觀察到凝集現象。rLcClec4e-ex對紅細胞和細菌的最小凝集濃度見表3。

表3 rLcClec4e-ex對紅細胞/細菌的最小凝集濃度Tab. 3 The minimal agglutinating concentration of rLcClec4e-ex against RBCs/bacteria

2.5 rLcClec4e-ex的糖類結合特異性

糖抑實驗結果顯示，D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、α-乳糖和脂多糖預處理均可抑制rLcClec4e-ex對變形假單胞菌的凝集作用；而蔗糖、D-半乳糖和D-海藻糖不能抑制rLcClec4eex對該菌的凝集活性。各種糖的最小抑制濃度見表4。

表4 糖類對rLcClec4e-ex凝集變形假單胞菌的最小抑制濃度Tab. 4 Minimal inhibition concentration of sugar on the agglutination of rLcClec4e-ex toward P. plecoglossicida

3 討論

C型凝集素受體(CTLR)作為模式識別受體(PRR)，通過識別并結合病原體表面糖類結構的病原相關分子模式(PAMPs)，在先天性免疫中發揮著重要的作用。本研究從大黃魚中克隆并鑒定了LcClec4e，并檢測了其在不同的組織與免疫細胞中的表達譜和凝集特性。結果顯示，LcClec4e是一個具有跨膜結構的受體，無信號肽，屬于CTLR家族中Ⅱ型亞家族的成員[33]。多序列比對的結果表明，LcClec4e的氨基酸序列與許多魚類Clec4e具有較高的同源性，都具有CTLR標志性保守基序WIGL，在其C端有一個典型的碳水化合物結合域(CRD)，該CRD不僅包含4個保守的半胱氨酸殘基(C1-C4)，并且在該CRD序列的N端出現了2個額外的半胱氨酸殘基(C0和C0’)，說明LcClec4e的CRD屬于“長型”(long-form)[33]，它們是維持和穩定CRD的重要基礎[34]。同其他魚類的CTLR一樣，LcClec4e CRD包含了結合Ca2+所必需的殘基與典型的糖結合基序EPN以及WFD，表明LcClec4e具有碳水化合物親和性[35]。值得注意的是，WND是哺乳動物CTLR結合碳水化合物的一個極其重要的基序[34]，魚類Clec4e通常表現為一個類似的基序WFD，而無脊椎動物CTLR中，WND基序又可突變為FRD[36]或WSD[37]?？梢?，CTLR的保守基序可能由于進化差異在不同物種間產生突變。系統進化分析顯示，LcClec4e與其他魚類Clec4e處于同一分支中，表明本研究克隆得到的LcClec4e確實為Clec4e的同源基因，且LcClec4e與同為石首魚科的黃姑魚Clec4e的序列一致性最高，為92.58 %。以上結果表明LcClec4e具有結構的保守性，提示其功能也具有保守性。

LcClec4e在大黃魚所檢測的10種組織中均有表達，呈組成型分布，且在肝臟中表達量最高。在已報道的魚類CTLR中，有的在脾臟或鰓中表達量最高，如虹鱒[38]、大西洋鮭[39]、鯉[21]CTLR和大黃魚LcNTC[22]，也有的主要在肝臟中表達，如點帶石斑魚(E. coioides)[40]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[41]和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[42]的CTLR。除此之外，斑馬魚CTLR4在卵巢中表達量最高[43]，半滑舌鰨CsCTL1在腎臟中表達量最高[44]，香魚PaCTL在腦中表達量最高[18]。上述結果表明CTLR在不同魚類中的表達譜存在明顯差異，可能是由于魚種差異或生存環境不同所導致的。此外，LcClec4e基因在大黃魚原代頭腎巨噬細胞(PKM)、原代頭腎粒細胞(PKG)和原代淋巴細胞(PKL)均有表達，用滅活溶藻弧菌處理后，LcClec4e在3種免疫細胞中的表達量都極顯著上調，提示LcClec4e參與了大黃魚抗細菌感染的免疫應答過程。

少數CTLR的凝集作用為非Ca2+依賴型[45-47]，本實驗發現，大黃魚Clec4e的胞外段(rLcClec4eex)對紅細胞和細菌的凝集均為Ca2+依賴型，這與多數CTLR是相同的[48]。在本研究中，rLcClec4eex能夠凝集小鼠和兔的紅細胞，卻無法凝集大黃魚紅細胞，這與大黃魚膜型LcDC-SIGN的紅細胞凝集特性相同[49]，說明高等與低等脊椎動物紅細胞表面糖類分子之間存在差異。而大黃魚分泌型LcNTC[22]對人、兔和大黃魚紅細胞均具有凝集活性，可見CTLR的凝集活性也與蛋白本身結構和特性有關。細菌凝集實驗進一步證明rLcClec4eex對嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌和坎氏弧菌均具有凝集作用，而對副溶血弧菌和無乳鏈球菌沒有凝集效果，表明其可能主要在抵御革蘭氏陰性菌入侵的免疫防御中發揮作用。CTLR對紅細胞和細菌的凝集基于其與細胞表面特定碳水化合物的結合。本研究中糖抑制實驗結果顯示，rLcClec4e-ex對多種糖類均具有廣泛的結合力，包括D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、α-乳糖和脂多糖，表明LcClec4e可能是這些糖類物質的受體。尖吻鱸Clec4e已被認為是脂多糖的受體之一，脂多糖通過與其結合，誘導TNF-α和IL-6的表達[50]。與納氏海蟾魚(Thalassophryne nattereri)的Nattectin[45]不同的是，雖然LcClec4e也具有典型的糖特異性結合基序EPN，但rLcClec4eex不能結合D-半乳糖，這可能與其缺乏半乳糖特異性結合基序QPD有關。

4 結論

本研究從大黃魚中鑒定了一種新的C型凝集素受體Clec4e，其組成型表達在檢測的大黃魚各組織和免疫細胞中，滅活溶藻弧菌可極顯著上調LcClec4e在免疫細胞中的表達水平；重組LcClec4e對紅細胞和革蘭氏陰性水產病原菌均表現出凝集活性，且為Ca2+依賴型。此外，還證實重組LcClec4e對細菌的凝集基于其與各種碳水化合物的結合。本實驗結果提示，LcClec4e可能作為一種PRR通過與菌體表面的糖類PAMPs結合來識別病原菌，并參與大黃魚抗細菌感染的免疫應答。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）