基于網絡藥理學探討“山藥-杜仲”藥對治療骨質疏松癥的作用機制*

郭 超，張興彩，王衛國，劉曉晨，呂文學，蔡余力△

1 山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 2 山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種常見的全身性代謝性骨?。?］。流行病學調查顯示，隨著中國人口老齡化的加劇，罹患OP 的患者人數不斷增加，絕經后婦女尤為突出，由骨質疏松導致的骨折例次也在不斷上漲，OP 已成為我國老年人面臨的重要健康問題［2］?；谥袊鴤鹘y醫學理論體系，OP 按其癥狀表現和致病機理應歸屬“骨萎”“骨枯”“骨痹”等范疇?！端貑枴ゐ粽撈分兄赋觯骸澳I主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿”，可見腎氣的充盈與否，是OP 發病的重要因素［3］?！饵S帝內經》云：“谷入氣滿，澤注入骨，骨屬屈伸”，說明脾氣充盛，運化水谷，充髓養骨。若脾氣不足，運化乏力，亦可以導致筋肉骨骼失養而發為骨質疏松［4］。故治療OP當以補腎健脾為主。全國名中醫藥專家曹貽訓教授結合多年臨床經驗采用“益腎健脾法”治療OP 臨床療效顯著，尤以山藥、杜仲最為常用，且用量較大。山藥為健脾要藥，具有補中益氣，滋腎益肺等功效?！侗静萁洝吩疲骸吧剿帤鉁仄?，味甘，無毒，主傷中……益氣力，長肌肉；杜仲味辛平，主腰脊痛，補中，益精氣［5］。杜仲為補腎強骨要藥，能補肝腎，強筋骨。補腎健脾中藥配伍應用，符合益腎健脾治療原則，在臨床中常常取得良好療效［6-8］。

網絡藥理學是一種基于基因組學和蛋白組學的新興科研方法。它通過網絡數據庫檢索，高通量組學數據分析等技術，揭示“藥物-基因-靶點-疾病”的關系網絡，通過關系網絡預測中藥潛在藥理作用及分子機制，評估藥物療效及副作用等［9］。本研究運用網絡藥理學方法，探究益腎健脾藥對“山藥-杜仲”藥對在抗骨質疏松中的作用機制，為進一步探索益腎健脾法治療OP提供研究思路和理論依據。

1 資料與方法

1.1 杜仲、山藥活性成分的獲取與篩選在TCMSP 數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中分別以“山藥”“杜仲”為關鍵詞進行檢索，獲得山藥、杜仲的成分信息，以OB≥30%及DL≥0.18 為條件進行篩選，獲取山藥、杜仲的活性成分。

1.2 山藥、杜仲活性成分靶點預測與活性成分-靶點網絡構建通過TCMSP 數據庫搜尋山藥-杜仲活性成分的潛在作用靶點，并通過Uniprot 數據庫（http：//www.uniprot.org /）將作用靶點進行規范，剔除非人源、重復靶點，轉化為基因靶點。并將基因靶點與對應活性成分輸入“Cytoscape 3.7.2”，構建山藥、杜仲“活性成分-靶點”網絡。

1.3 OP 靶點的獲取與收集在GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）檢索OP關鍵詞“Osteoporosis”獲取靶點信息，根據靶點信息的Score值，篩選出與OP聯系緊密的關鍵疾病靶點。

1.4 山藥、杜仲與OP 共同靶點篩選與蛋白互作網絡構建為明確山藥-杜仲活性成分靶點與OP靶點之間的聯系，將獲取的靶點進行對比后，取兩者交集，繪制Venn 圖。將交集靶點導入STRING 11.0 數據庫（http：//string-db.org），物種限定為“Homo sapiens”，構建“藥物-疾病”關鍵靶點蛋白互作網絡（key target protein protein interactions，PPI）。同時將PPI 網絡導入“Cytoscape 3.7.2”，對關鍵作用靶點進行分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析將藥物-疾病相互作用的關鍵靶點信息上傳至Metascape（http：//metascape.org）平臺，分別選定對關鍵基因所涉的生物進程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular components，CC）和京東基因與基因組全書（Kyoto enlyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 山藥、杜仲活性成分的收集及網絡構建經TCMSP 數據庫在線檢索得到山藥的化學成分71個，杜仲化學成分147 個。通過ADME 參數篩選后得到山藥的活性成分16 個，杜仲活性成分28 個。剔除無作用靶點的活性成分，最終得到山藥-杜仲活性成分共38 個（山藥活性成分12 個，杜仲活性成分26 個，無重復活性成分），見表1。將基因靶點與對應活性成分輸入“Cytoscape 3.7.2”，構建山藥、杜仲“活性成分-靶點”網絡。見圖1。

圖1 “山藥—杜仲”藥對成分靶點網絡圖

表1 “山藥—杜仲”藥對主要成分

2.2 山藥-杜仲活性成分抗OP 的潛在作用靶點預測在TCMSP 數據庫中收集“2.1”項中山藥-杜仲的活性成分所對應的靶點蛋白，剔除無效和重復的靶點后，得到山藥-杜仲的活性成分作用靶點共225 個。通過GeneCards 數據庫檢索OP 的作用靶點，共得到OP 的作用靶點4315 個，根據Score 值大于中位數篩選出關鍵基因1376 個。利用維恩圖在線繪制平臺制作維恩圖。見圖2。

圖2 “山藥—杜仲”藥對活性成分靶點與OP靶點Venn圖

2.3 藥物-疾病關鍵靶點PPI 構建將關鍵交集靶點基因80 個導入至STRING 平臺構建PPI，獲得PPI網絡共有80個節點、1250條邊，將該網絡各節點信息上傳至“Cytoscape 3.7.2”，進行PPI 網絡加工制作，見圖3。根據各節點Degree 值、緊密度、介度等信息，查閱相關文獻進一步分析各節點與OP 的關聯程度。其中與OP 關聯程度較高的靶點主要有白蛋白（albumin，ALB）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腺苷酸激酶同工酶1（ATK1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、抑癌基因p53（tumor suppressor gene p53，TP53）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）等。

圖3 “山藥—杜仲”藥對作用于OP靶點的PPI網絡圖

2.4 GO 和KEGG 富集分析結果應用Metascape數據庫將篩選出的山藥-杜仲藥對與OP交集的80個關鍵靶點進行GO 和KEGG 分析，80 個關鍵靶點共涉及5030 個生物進程，564 個分子功能，392 個細胞成分，富集在422條通路上（P＜0.01）。根據P值大小排列，分別選取BP、MF、CC前20位的進行分析。其中生物過程主要涉及細胞增殖的負調控、凋亡信號通路、細胞分化的負調控、對脂多糖的反應等。分子功能主要涉及：受體調節活性、轉錄因子結合 、蛋白酶結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等。細胞成分主要包括細胞外基質、細胞質核周區域、內吞小泡、質網腔、核膜。見圖4—6。KEGG通路分析顯示，關鍵靶點富集在與骨質疏松相關的重要通路主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、T 細胞受體信號通路、p53 信號通路、TGF-β信號通路等，選取P值前20的通路進行分析，繪制高級氣泡圖，見圖7。

圖4 “山藥—杜仲”藥對作用于OP關鍵靶點的GO生物學過程分析

圖5 “山藥—杜仲”藥對作用于OP關鍵靶點的GO分子功能分析

圖6 “山藥—杜仲”藥對作用于OP關鍵靶點的GO細胞成分分析

圖7 “山藥—杜仲”藥對作用于OP關鍵靶點的KEGG分析氣泡圖

3 討論

OP 作為發病因素多樣的慢性全身代謝性骨病，其病理機制復雜，好發于老年人，尤以絕經后婦女常見，增加了老年人骨折的風險［10］。目前抗OP 的一線藥物主要是雙膦酸鹽類藥物，這類藥物能夠抑制骨的過度吸收，達到抗OP 的目的，但副作用較大［11-12］?！饵S帝內經》中指出：“脾胃強健，飲食水谷……充養骨髓；反之，脾胃虛弱……無以充養后天之精，勢必精虧髓枯而百骸萎廢”，說明OP的發生多責之于腎虧脾虛。曹貽訓教授在“益腎健脾法”的理論指導下，以大劑量“山藥-杜仲”為主藥治療OP，療效顯著。

本研究在相關數據庫搜索及查閱文獻，共獲得“山藥-杜仲”藥對存在明確作用靶點的活性成分有薯蕷皂苷元、花旗松素、槲皮素、山柰酚等38個。研究表明，山藥中的薯蕷皂苷元可促進成骨細胞增殖、分化及抑制破骨細胞形成，減緩骨質疏松的進展［14］?；ㄆ焖伤鼐哂辛己玫目寡趸?、抑制細胞焦亡、抗炎作用，且能抑制破骨細胞活性并降低破骨細胞特異性基因的表達［15-16］。研究表明，杜仲提取物可顯著抑制去卵巢大鼠骨質疏松模型、骨密度的降低及骨微結構的改變［13］。槲皮素和山柰酚是杜仲的主要成分，山柰酚是一種存在于植物中的膳食生物類黃酮，有廣泛的藥用特性。WONG 等［17］發現，山柰酚可以抑制脂肪生成、炎癥、氧化應激、破骨細胞自噬和成骨細胞凋亡，同時激活成骨細胞自噬，實現骨保護。此外，YUAN 等［18］發現槲皮素可以促進骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）增殖和成骨分化，并保護MSCs 免受TNF-α 誘導的成骨損傷，從而顯著改善VOX大鼠OP。

PPI 網絡顯示山藥-杜仲藥對作用于OP 的關鍵靶點有ALB、IL-6、ATK1、VEGFA、MMP9、TP53、ESR1等，ALB和IL-6是介導炎性反應的重要成分，可加速骨質疏松進程［19-20］。MUKHERJEE 等［21］研究發現，ATK1是成骨細胞分化的負調節因子，且ATK1在成骨細胞偶聯破骨細胞生成的過程中，具有強陽性介質的獨特作用，因此ATK1 的抑制能夠明顯的增加骨重塑，有效控制OP。MMP-9 是屬于MMPs 家族的一類依賴鋅離子來水解胞外基質的蛋白水解酶，在骨質疏松中發揮著重要作用。研究發現，破骨細胞中MMP-9的基因表達度較高，應用MMP-9合成抑制類藥物，可以有效抑制破骨細胞的吸收［22-23］。雌激素缺乏引起的絕經后OP是最常見的骨質疏松類型，雌激素受體主要有兩種結構相似的亞型，即ESR1 和ESR2。研究證明ESR1 有與髖部骨密度呈顯著相關性的基因位點，且具有遺傳傾向，運用ESR 調節劑可有效增高PMOP 患者的骨密度，降低骨折風險［24-26］。此外，TP53、VEGFA 也通過基因的多態性表達影響OP的發生［27-28］。結合相關文獻及蛋白互作網絡發現，藥物作用于疾病的靶點集中在炎癥反應、成骨-破骨的動態偶聯和人體內分泌穩態等方面，與OP的發病因素的多樣化一致。

KEGG 分析可見，“山藥-杜仲”藥對作用于OP的通路主要包括AGE-RAGE信號通路、T細胞受體信號通路、p53信號通路、TGF-β信號通路、HIF-1信號通路等。研究表明，AGE-RAGE 信號通路在骨質疏松的治療中起著關鍵作用［29-30］。HIF-1α 是HIF-1信號通路的主要激活蛋白，且具有促進破骨細胞形成、增強破骨細胞活性的作用［31］。此外，p53 信號通路、TGF-β信號通路、T細胞受體信號通路都是作用于OP 的重要通路，能夠刺激P53、TGF-β等調節因子的釋放，加重骨質疏松的發展［27，32］。

綜上所述，益腎健脾藥對“山藥-杜仲”可能參與細胞的增殖、分化、凋亡等生物進程，通過細胞因子的生成與釋放、調節相關基因轉錄等方面發揮作用，調節AGE-RAGE 信號通路、HIF-1 等信號通路關鍵基因的表達對OP 可以起到治療作用，進一步揭示益腎健脾藥對“山藥-杜仲”與骨質疏松之間“多成分-多靶點-多通路”的作用。