清腸溫中方聯合糞菌移植對潰瘍性結腸炎小鼠腸黏膜免疫的調控作用*

孫中美，李軍祥，路瓊瓊，丁龐華，姜 慧，施曉軍，毛堂友△

1 北京中醫藥大學東方醫院，北京 100029； 2 天津市南開醫院，天津 300102

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及黏膜及黏膜下層的結腸、直腸的慢性非特異性炎癥性疾病。UC 的病因尚不明確，目前亦無治愈方法［1］。糞菌移植是通過調節腸道菌群治療UC 的新興療法，主要是將健康供菌者糞便中的功能菌群，移植到患者胃腸道內，通過重塑腸道菌群結構，從而達到治療目的［2］。但越來越多的研究發現糞菌移植治療UC 的療效存在局限性，尤其是長期療效不明確。中醫藥治療UC 歷史悠久，可通過調節人體陰陽平衡、達到五臟調和。前期研究發現，清腸溫中方治療UC 療效確切，且聯合應用糞菌移植可明顯緩解UC 的腸道炎癥及病理損傷，但具體機制不明［3］。本研究在前期工作的基礎上，以腸黏膜免疫為切入點，通過檢測γδT 細胞、CD4+T 細胞、分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）及其相關因子的表達，探究清腸溫中方聯合糞菌移植治療UC 小鼠的免疫學機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物30 只6～8 周的SPF 級健康雌性C57BL/6 小鼠，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養于北京中醫藥大學東方醫院SPF 級動物房，12 h 光照/黑夜循環，溫度25 ℃，濕度60%，自由進食飲水飼養。動物的飼養及干預過程，嚴格遵守北京中醫藥大學東方醫院實驗動物中心操作規范進行，實驗過程已通過北京中醫藥大學東方醫院實驗動物倫理委員會審查（實驗動物倫理批準號：201922）。

1.2 實驗用藥清腸溫中方（藥物組成：黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，青黛3 g，地榆炭15 g，苦參9 g，木香6 g，炙甘草6 g）配方顆粒購自于北京中醫藥大學東方醫院顆粒藥房，藥物制備及質控由北京康仁堂藥業有限公司完成。

1.3 試劑及儀器DSS（MW 36000-50000Da，MP Bio-medical）；便潛血試紙（珠海貝索生物技術有限公司，批號：B191101）；10%中性福爾馬林固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200917）；HE染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200904）；小鼠sIgA Elisa 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：201909）；One Step TB Green?Prime Script?RT-PCR Kit Ⅱ（Takara Bio，批號：AJC1834A）；RPMI1640 培養基（Hyclone，批號：AF2954630）；胎牛血清（Hyclone，批號：DD19362264）。 FITC-CD3，BV605-CD4，BUV395-TCRγδ（BD Pharmingen、Biolegend、eBioscience），UCT 型超薄切片機（Leica）；LSRFortessaTM型流式細胞儀（BD Bio-sciences），7300 Real Time PCR System（App-lied Biosystems）；Synergy H1 型多功能酶標儀（Bio-Tek）；BX51 顯微鏡（Olympus）。

1.4 造模及分組將30只雌性C56BL/6小鼠，按1∶4 的比例隨機分為空白組、干預組，普通飼料喂養，晝/夜12 h/12 h 交替，溫度25 ℃，濕度60%?？瞻捉M小鼠全程自由進食飲水，自第8 天起，每日接受無菌水灌胃（0.1 mL/20 g），并于每天早上10 點采集新鮮糞便，制作糞便濾液；糞便濾液制作方法在前期研究的基礎上進行部分更改［4-5］，具體步驟如下：腹部輕柔按摩或者搔刮法刺激小鼠排便，稱定質量后按照1∶5 的比例將糞便溶解并勻漿于無菌水中，在4 ℃，2000 r/min 離心1 min后，分離上清液，保存在4 ℃冰箱保存，按照0.1 mL/20 g 劑量灌胃。干預組小鼠予2.5% DSS 水溶液自由飲用7天造模后，隨機分為4組：模型組、清腸溫中方組、糞菌移植組、聯合組。自第8 天起，模型組小鼠予無菌水灌胃（0.1 mL/20 g），清腸溫中方組予清腸溫中方水溶液（1.8 g/kg，0.1 mL/20 g）灌胃，糞菌移植組予糞菌濾液（0.1 mL/20 g）灌胃，聯合組予清腸溫中方（1.8 g/kg，0.1 mL/20 g）聯合糞菌濾液（0.1 mL/20 g）灌胃。各組干預7天，監測小鼠疾病活動指數（disease activity index，DAI），光鏡下觀察HE 染色結腸組織石蠟切片，評價病理變化。干預結束后，麻醉后處死小鼠，取脾臟置于含有10%FBS 的RPMI1640 培養基中，用于流式細胞術檢測。取1 cm 結腸置于10%中性福爾馬林固定液中固定，用于制作HE 染色石蠟切片，其余結腸組織置于液氮中凍存，用于相關基因及蛋白的檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 小鼠DAI 評價 DAI 的評分［6］=（體質量下降指數+糞便性狀+糞便潛血）/3。見表1。

1.5.2 小鼠結腸組織病理學評分 各組小鼠結腸組織病理學評分由炎癥程度及病變深度兩個維度進行評價［7］。見表2。

表2 結腸組織病理學的評分標準

1.5.3 流式細胞術檢測UC小鼠免疫系統指標 將小鼠脾臟分別置于含有2 mL 冰RPMI1640 培養基（含10%FBS）的60 mm 培養皿中，使用注射器膠栓輕輕研碎，使用70 μm 白篩網過濾，經過裂紅、洗滌，以2000 r/min 離心5 min 后重懸細胞。加入CD3、CD4、TCRγδ 流式抗體，4 ℃避光孵育30 min進行細胞膜表面染色，洗滌離心后重懸細胞，進行流式細胞檢測。

1.5.4 RT-qPCR 法檢測UC 小鼠結腸TLR2、pIgR mRNA 的表達 Trizol 法提取小鼠結腸總RNA 后，利用One Step TB Green?PrimeScript?RTPCR Kit Ⅱ按照說明書進行反轉錄及擴增，以GAPDH 為內參，以2-△△Ct法對數據進行分析。本研究中所用的引物序列見表3，引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

表3 引物序列

1.6 ELISA 法檢測UC 小鼠結腸sIgA 的表達稱取結腸組織質量，以冰生理鹽水制成10%的組織勻漿，嚴格按照ELISA試劑盒說明書，在450 nm波長下測定吸光度值，繪制標準曲線計算sIgA含量。

1.7 統計學方法應用GraphPad prism 8 進行數據統計及繪圖。計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況除聯合組2 號小鼠在實驗第12 天不明原因死亡，其余小鼠均對造模及藥物干預較為耐受。造模期間，各干預組小鼠開始出現不同程度的糞便潛血陽性，并最終出現肉眼血便，伴隨毛發光澤減退，反應遲緩、懶動、大便稀溏、體質量增加趨勢放緩，且自第5 日起體質量明顯下降。而停用DSS 水溶液后，小鼠臨床表征均開始緩解，且各干預組小鼠呈現相對快速地恢復過程。

2.2 小鼠DAI指數DAI由體質量、糞便性狀、糞便潛血三個維度構成。造模成功后各自干預7天，與空白組比較，模型組小鼠DAI明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，糞菌移植組、清腸溫中方組以及聯合組小鼠DAI指數均明顯下降（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠DAI評分、病理評分、γδT細胞、CD4+T細胞、TLR2 mRNAp、IgR mRNA及sIgA比較（）

表4 各組大鼠DAI評分、病理評分、γδT細胞、CD4+T細胞、TLR2 mRNAp、IgR mRNA及sIgA比較（）

注：與空白組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

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2.3 小鼠結腸組織病理學表現模型組小鼠結腸黏膜隱窩結構紊亂，伴中性粒細胞浸潤，結腸黏膜連續性破壞，病理評分顯著升高（P＜0.01）。清腸溫中方組、糞菌移植組、聯合組小鼠結腸黏膜炎性細胞浸潤等均有不同程度的減輕，黏膜連續性破壞明顯減少，且聯合組小鼠結腸病理評分較模型組明顯降低（P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織病理學表現（HE，×20）

2.4 小鼠γδT 細胞含量運用流式細胞術檢測脾臟γδT細胞發現，模型組γδT細胞含量較空白組明顯升高（P＜0.01），而各治療組與模型組相比明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表4、圖2。

圖2 各組小鼠γδT細胞比較

2.5 小鼠CD4+T 細胞表達量與空白組相比，模型組小鼠CD4+T 細胞比例及TLR2 mRNA 表達明顯升高（P＜0.01），經過清腸溫中方、糞菌移植干預后，與模型組相比，干預組小鼠CD4+T 細胞及TLR2 mRNA表達明顯降低（P＜0.05），見表4、圖3。

圖3 各組小鼠CD4+T細胞分化比較

2.6 小鼠結腸sIgA 及其受體表達量與空白組相比，模型組小鼠結腸sIgA、pIgR mRNA表達明顯降低（P＜0.05），經過清腸溫中方聯合糞菌移植干預7天后，干預組小鼠結腸sIgA、pIgR mRNA 較模型組表達明顯升高（P＜0.05）。見表4。

3 討論

UC 因病程長，炎癥反復發作，導致結腸癌發病風險明顯增高，嚴重影響患者的生存質量，因此早發現早治療是UC 的重要策略［7-8］。目前UC 的發病機制尚不完全清楚，越來越多的證據表明本病與腸黏膜免疫紊亂密切相關［9］。

γδT細胞是一類特殊的T細胞，是腸道上皮間淋巴細胞的重要組成部分，構成宿主抵抗腸道病原菌及外來抗原入侵的天然屏障［10］。作為腸黏膜免疫系統的關鍵效應細胞，當有病原微生物入侵時，γδT 細胞不受MHC 限制，無需經過抗原提成細胞處理，即可迅速活化和增殖，直接識別入侵微生物的表面抗原，從而發揮殺傷性T 細胞的作用，介導腸道免疫反應［11］。但若免疫應答過強，導致大量炎癥細胞和炎性細胞因子在腸道局部積聚，則會造成結腸黏膜損傷，誘發腸道炎癥。研究發現，UC患者腸黏膜中γδT細胞的表達量較正常人群明顯升高，且其細胞數量與疾病嚴重程度相關［12］。本研究發現，UC小鼠γδT細胞明顯升高，而聯合組治療1 周后，γδT 細胞明顯降低，提示其治療UC 的作用機制可能與γδT細胞介導的腸黏膜免疫應答有關。

CD4+T 細胞是人體內主要的T 細胞之一，根據其分泌的細胞因子及介導的功能，又可分為Th1、Th2、Th17、Treg等亞群。CD4+T細胞與炎癥性腸病的發生發展密切相關。研究發現，炎癥性腸病患者腸道CD4+T細胞浸潤明顯，且分泌大量的促炎因子IFN-γ［13］，從而促進腸道炎癥的發生。γδT細胞是固有免疫和適應性免疫之間的橋梁，γδT 細胞具有抗原提呈細胞的功能，如Vδ2γδT 細胞激活后能夠將抗原呈遞給CD4+T細胞、CD8+T細胞，誘導兩者的增殖分化［14］。CD4+T 細胞的增殖活化同時受到Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）調節，TLR 主要參與病原微生物產物的識別［15］，其中TLR2 主要識別革蘭氏陽性菌的膚聚糖，是溝通腸道菌群與機體免疫的主要媒介。研究發現，UC 患者腸黏膜的TLR2較正常組明顯增強，而當TLR2被激活后，CD4+T 細胞增殖加快，誘導IL-6 及IL-17等促炎因子的表達，促進腸道炎癥的發生發展［16-17］。本研究發現，模型組小鼠CD4+T 細胞含量及結腸TLR2 mRNA表達明顯升高；經過1周的治療后，聯合組小鼠CD4+T 細胞、結腸TLR2 mRNA 表達明顯降低。

sIgA 是腸黏膜上的主要免疫球蛋白，腸道黏膜上的第一道防線，對各種內源共生菌及外源入侵的病原體都有抵抗作用。CD4+T 輔助細胞可調節B細胞發育為成熟漿細胞，從而產生sIgA，并由聚合免疫球蛋白受體（pIgR）從黏膜上皮細胞的基底表面轉移到頂端表面，進而與腸道菌群形成串擾，維持腸道穩態。而當sIgA 產生減少或分泌障礙時，腸黏膜免疫屏障受損，促進炎癥性腸病的發展。本研究采用清腸溫中方聯合應用糞菌移植作為協同干預手段，可使結腸pIgR mRNA、結腸sIgA表達較模型組明顯升高。

綜上所述，清腸溫中方聯合糞菌移植能夠有效抑制UC 小鼠腸道炎癥，促進黏膜修復，其機制可能與調控γδT 細胞及其介導的腸黏膜免疫應答有關，本次研究為臨床中西醫結合治療UC 提供了新的科學依據。