馬里苷對糖尿病小鼠肝臟和胰腺組織形態及自噬的影響*

張 芳，祖力皮亞·阿布拉，克迪熱亞·卡迪爾，宋志鵬，張博翔，張雁潮，彭小雨，李 甜

新疆醫科大學,新疆 烏魯木齊 830011

糖尿病是以體內血糖調節失衡為特征的代謝紊亂性疾病。根據胰島素的相對或絕對性缺乏，糖尿病分為1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）。T1DM 是由胰腺β細胞受損導致的胰島素缺乏的自身免疫性疾??；T2DM 的特征是由于胰島素分泌的逐漸性減少而導致胰島素相對不足，亦或是目標組織如肝臟、骨骼肌、脂肪組織中的胰島素受體作用降低，也稱為胰島素抵抗［1］。高血糖是兩種類型糖尿病的共同特征。慢性高血糖不僅損害相關臟器以及外周靶組織，也會造成機體代謝紊亂，累積形成嚴重的各種并發癥［2-4］。

馬里苷是一種黃酮類化合物，提取自稀有高寒、功效獨特的野生植物兩色金雞菊。已有研究證實兩色金雞菊具有抗氧化、降血壓、降血糖、降血脂、抗腫瘤的生物學功效［5-6］。馬里苷是兩色金雞菊中重要的黃酮類化合物，能夠改善胰島素抵抗、抑制糖異生并促進糖原合成，但其具體作用機制還需進一步研究［7-8］。本研究通過研究馬里苷對糖尿病小鼠肝臟和胰腺的組織形態的影響進而對其調節自噬的功能進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇因瘦素受體基因缺陷造成自發形成糖尿病的10 只db/db 小鼠和30 只db/m小鼠為研究對象。小鼠購自江蘇常州卡文思實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：IACUC-20190226-20。飼養條件：實驗小鼠單籠、單只飼養，自由飲水，每隔兩天更換墊料，SPF 動物飼養室模擬自然晝夜條件，日間相對溫度（20±2）℃，相對濕度（45±5）%，每日日照時間為12 h。本實驗按照《新疆醫科大學實驗動物護理與使用指南》進行動物實驗（倫理批準號：IACUC-20190226-20）。

1.2 試劑及儀器馬里苷（法國Extrasynthese公司，貨號：C00007893）；二甲雙胍（上海施寶制藥有限公司，批號：H20023370）；GAPDH 抗體（北京國鼎昌盛生物技術有限公司，批號：GA003-R）；二抗IgG H&L/HRP（Bioss，批號：Bs-0295G-HRP）；兔抗LC3 Ⅱ/I、P62、ATG、Beclin（Cell Signaling Technology，批號：12741，39749，12994，3495）；HE染色試劑盒（Biosharp，批號：BL700B-1）；山羊血清、羊抗兔二抗、DAB 顯色試劑（中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9065，2010D1217，ZLI-9018）。043BR39035 型垂直型電泳槽、BIO-RAD 型凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；DM3000 型拍照顯微鏡（Leica公司）。

1.3 分組及處理10 只雄性db/m 小鼠為對照組，30只雄性db/db小鼠分為模型組、二甲雙胍陽性藥組、馬里苷給藥組，每組10 只。小鼠飼養于新疆醫科大學動物實驗中心SPF 級動物飼養室。各組小鼠均喂養轉基因敲除小鼠飼料和基礎飼料，二甲雙胍陽性藥組給予二甲雙胍溶液灌胃，劑量為280 mg/kg，馬里苷給藥組給予馬里苷溶液灌胃，劑量為50 mg/kg。各組灌胃體積0.02 mL/g，持續8周。8周后處死小鼠，收集各組小鼠胰腺和肝臟組織樣本，并進行后續實驗。

1.4 標本采集用10%戊巴比妥鈉溶液麻醉處死小鼠后，小心摘取肝臟和胰腺，注意不要破壞其結構?？v向將肝臟和胰腺剖成兩半，用4%多聚甲醛在4 ℃冰箱固定一夜，經石蠟包埋固定成型。

1.5 觀察指標

1.5.1 小鼠肝臟和胰腺病理學觀察 標本進行脫蠟后，100%、90%、80%酒精處理各5 min，并分別用自來水沖洗5 min；蘇木精染色5 min，流水沖洗；5%乙酸分化1 min，組織變色呈現藍色；伊紅染色1 min，流水沖洗；70%、80%、90%、100%酒精脫水各10 s，再用二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ10 min透明化處理，晾干切片后用中性樹脂進行封片。每組隨機選取4 只小鼠的組織切片，在光學顯微鏡下觀察小鼠肝臟和胰腺的組織形態。

1.5.2 免疫組化染色對肝臟組織P62 的定位、定量分析 光鏡下觀察不同組小鼠肝臟P62 的表達，HE 染色后將小鼠肝臟組織制成石蠟塊。經脫蠟、復水、蒸餾水洗滌切片后，將其浸泡于10 mol/L濃度的檸檬酸鹽溶液中。進行抗原修復后，緩沖液洗3 min/2 次，之后將切片浸泡于3%過氧化氫溶液10 min。用PBS 溶液進行洗滌切片后，0.5%Triton X-100 溶液浸泡切片10 min。最后封閉（5%BSA 溶液）切片45 min，將配置好的一抗溶液在37 ℃孵育1～2 h。孵育結束后，用PBS溶液清洗切片3 次，加酶標二抗在室溫中孵育30 min，再次用PBS 溶液洗滌切片3 次后，用DAB 顯色液顯色5 min，之后用自來水充分沖洗，復染，脫水，透明化處理，最后在光學顯微鏡下進行形態學觀察和取圖。

1.5.3 Western Blotting 檢測小鼠肝臟組織內自噬相關蛋白的表達水平 小鼠斷頸處死后，取其肝組織，提取目的蛋白并采用蛋白免疫印跡檢測。將小鼠肝臟組織剪碎，與生理鹽水混合離心，反復此步驟，直至離心上清液無色透明；吸去離心上清液，加入裂解液，之后將裂解產物在冰浴中用超聲機，超聲后離心吸去上清，獲取肝組織蛋白質。電泳前進行溶液配置、制膠，將提取的蛋白質電泳、轉膜、封閉，進行一抗、酶標二抗孵育，最后加入酶底物，化學顯色。用Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像，用Image-lab 軟件對Western-blotting結果進行帶密度測定分析。

1.6 統計學方法選擇SPSS 26.0 軟件對各組數據進行統計學分析，GraphdPadPrism 8.0 軟件輔助作圖，多組數據采用單因素方差分析進行統計，P＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肝臟組織病理學改變對照組小鼠肝臟組織內肝小葉結構完整清晰，肝細胞板排列整齊，肝細胞呈多邊形，1～2 個細胞核居中，胞漿豐富；門管區將相鄰肝小葉分隔開，較易識別。模型組小鼠肝臟組織內肝小葉結構模糊，肝索紊亂，部分部位索狀結構消失，肝細胞體積變大呈圓形，伴有氣球樣變，胞核移向胞膜，胞膜完整結構破壞，界限不清，部分可見細胞彌漫性脂肪空泡變性。門管區可見大量炎癥細胞浸潤，相對于模型組小鼠，二甲雙胍陽性組與馬里苷給藥組小鼠肝小葉結構較清晰，肝細胞排列成索狀，部分肝細胞體積較大，呈圓形，胞膜結構不清晰，門管區少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理學觀察（HE，×200）

2.2 小鼠胰腺組織病理學改變對照組小鼠胰腺組織結構飽滿，胰島在胰腺腺泡間散在分布，形態呈圓形或卵圓形，與周圍組織分界清晰，未見明顯異常；胰島內胰島細胞排列整齊，胞核呈圓形居中，胞漿豐富；模型組小鼠的胰腺組織出現明顯肥大，胰島萎縮，形態不規則，邊緣不整齊，與周圍組織界限不清晰，并有纖維組織增長，胰島細胞排列紊亂，并且部分胰島細胞出現空泡狀甚至出現核固縮和核溶解現象。相對于模型組，二甲雙胍陽性藥組和馬里苷給藥組小鼠胰島形態較正常，邊界比較清晰，胰島細胞排列有明顯改善，胰島細胞空泡狀變性減少。見圖2。

圖2 各組小鼠胰腺組織病理學改變（HE，×200）

2.3 小鼠肝臟自噬相關蛋白P62 表達模型組與對照組小鼠相比，肝臟組織細胞P62 表達顯著增高，而二甲雙胍和馬里苷干預可緩解逆轉糖尿病引起的P62表達。見圖3。

圖3 各組小鼠肝臟組織P62免疫組化圖（免疫組化染色，×200）

2.4 小鼠肝臟自噬相關蛋白LC3Ⅱ/I、P62、ATG5和Beclin1 表達與對照組比較，模型組小鼠P62水平顯著增高（P＜0.01），LC3Ⅱ/I 比值、Beclin1和ATG5 水平均下降（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍和馬里苷干預后均能降低糖尿病小鼠P62的表達，增加LC3Ⅱ/I、Beclin1 及ATG5 的表達水平（P＜0.05）。見圖4—5。

圖4 各組小鼠肝臟自噬相關蛋白P62、LC3Ⅱ/I含量水平比較

圖5 各組小鼠肝臟自噬相關蛋白ATG5、Beclin1含量水平比較

3 討論

慢性高血糖造成機體代謝紊亂，同時損害相關臟器以及外周靶組織。肝臟作為物質代謝的中間場所，從一開始就處于糖尿病發展過程中代謝網絡的核心位置，并直接或間接地參與整個機體物質代謝過程［9-10］。糖尿病會造成肝臟病理性損害，表現為肝小葉和肝細胞形態學改變［11］。本實驗主要通過觀察對比db/db 糖尿病小鼠組與馬里苷藥物組小鼠的肝小葉結構、肝細胞板圍繞中央靜脈形態和肝細胞形態的不同，發現馬里苷對于糖尿病小鼠肝臟損傷具有緩解及糾正作用。

胰腺內的胰島細胞可產生胰島素、胰高血糖素，它們可以調節機體血糖的變化，對于糖尿病疾病的轉化發展具有非常重要的作用［12］。實驗證明馬里苷可顯著改善db/db 小鼠胰腺體積增大及胰島細胞排列紊亂，同時能增加其胰島素分泌量并升高血漿胰島素水平，因此馬里苷對于糖尿病小鼠胰腺損傷的也有著明顯的治療作用［13］。

細胞自噬與人類健康和疾病防治有著密切的關系。自噬過度還是自噬不足都可能導致疾病發生［14］。在胰島素抵抗的情況下，器官和組織的自噬被明顯抑制。自噬對于維持細胞內代謝平衡，調控細胞各種活動，保護細胞完整性，維持細胞自穩具有重要作用［15］。自噬體在形成過程中有兩種自噬有關蛋白質是必須參與的，即ATG5 和Beclin-1（酵母ATG6 同源物），二者除了促進自噬體的形成，還被認為是調控細胞自噬和凋亡的分子開關蛋白［16］。LC3 是自噬的重要標志物，當自噬被激活時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ/I 比值的大小可以估計自噬水平的高低。P62蛋白稱作SQSTMI，因其與LC3 的相互作用表達在自噬體上，在正常生理情況下易被自噬降解，P62表達量的升高意味著自噬的缺陷，是與自噬強度呈負相關的標志分子［17-18］。實驗表明馬里苷可以顯著增加糖尿病小鼠肝臟自噬相關蛋白LC3Ⅱ/I、ATG5 和Beclin1 的表達，降低P62 的表達，促進糖尿病小鼠肝臟自噬表達。

綜上所述，自噬參與調控機體對胰島素的敏感性及其應答，并影響肝臟組織胰島素信號的傳遞，調控肝臟胰島素抵抗的發生［19］。肝臟胰島素抵抗的發生，影響機體糖代謝，破壞肝臟組織結構和功能，會進一步加重糖尿?。?0］。從本實驗可以得出，馬里苷通過誘導自噬調節肝臟胰島素抵抗，起到治療糖尿病的作用。