基于網絡藥理學探討白芍治療阿爾茨海默病作用機制*

曾慶濤，吳紅彥△，王雅樂，王 斌，黃 海，王虎平

1 深圳市羅湖區中醫院，深圳 羅湖 518000； 2 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種慢性退行進行性神經性疾病，其臨床特征主要表現為認知功能下降，發病初期偶有記憶障礙。研究發現，AD 主要是因為β淀粉樣蛋白（βA）的長期積累和Tau 蛋白的高磷酸化，導致淀粉樣斑塊和神經纖維纏結形成［1］，從而發病。據流行病學調查顯示，全世界共有4000萬人罹患AD［2-3］。

白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根，主產于浙江、安徽等地。白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等功效。研究表明，白芍含有鞣質類、單萜類、黃酮類、多糖和三萜類等成分，具有抗炎、抗氧化、保肝、鎮痛等藥理作用［4］。

基于中藥網絡藥理學軟件的整體性，系統性、多向性等特點，本次研究以白芍為主，構建“成分-靶點-通路-疾病-機制-AD”復雜絡圖［5］，以便闡釋白芍多成分-多靶點-多通路等特點，進一步探究白芍治療的AD具體作用機制。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺［6］（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），對白芍所有有效成分進行挖掘。由于有效成分眾多，以藥代動力學參數［7］為依據，設置選擇條件，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物類似度（drug-likeness，DL）≥0.18設為篩選條件［8］。篩選后的有效成分為研究對象。

1.2 活性成分靶點的獲取運用TCMSP 數據庫平臺，利用蛋白質數據庫UniProt（http：//www.uniprot.org/），限定物種為“human”的UniProt KB數據，利用perl語言校正預測的靶點名稱。

1.3 疾病相關靶點基因獲取利用人類在線孟德爾遺傳數據平臺（OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）查找AD的遺傳成分，以“Alzheimer disease”作為關鍵詞，檢索AD 的相關靶點。合并兩次檢索的靶點，刪除重復的靶點。運用R 語言獲取白芍有效成分靶點和疾病靶點的交集，得到韋恩圖。

1.4 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖的構建將白芍有效活性成分靶點和AD 相關的靶點取交集，獲得的靶點即為白芍治療AD 的關鍵靶點。利用Cytoscape 3.7.1 軟件（http：//www.cytoscape.org）安裝JAVA 軟件，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。圖中節點（node）代表白芍藥物有效成分與關鍵作用靶點；邊（edge）代表藥物、成分、靶點、疾病之間的連接。整個網絡構建并展示了藥物-成分-靶點-疾病之間的聯系，通過該系統可以深入探究白芍治療AD 的作用機制。設置好中介中心度和網絡節點度值篩選條件，充分挖掘圖中的核心節點。

1.5 構建PPI（protein-proteinInteraction）將白芍治療AD 的潛在靶點輸入STRING 數據庫平臺（https：//string-db.org）中，限定物種為“Homo Sapiens”，獲取預測靶點，以TXT 文件保存。運用Cytoscape 3.7.1 軟件，設置好相關條件，對PPI圖進行相關網絡化和可視化的優化處理［9］。點擊軟件中的Network Analyzer 插件進行網絡分析，分析介度中心性、分析其度中心性及緊密度中心性等拓撲值。

1.6 GO注釋及KEGG通路分析利用目前最常用的Bioconductor生物包，通過R 語言工具，輸入相關生物包，便于分析GO注釋信息。ClusterProfiler包是R 語言作為基因數據分析包之一，可搜索Bioconductor 提供的GO 注釋信息和KEGG［10］數據庫平臺（http：//rest.kegg.jp/link/hsa/pathway），進行通路富集分析。運用上述軟件，設置篩選條件以P＜0.05 為目的，進行信號通路富集分析，同時將富集分析結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 活性成分篩選運用TCMSP 軟件平臺篩選到白芍有效成分有110 個，以OB≥30%和DL≥0.18為限制條件進一步篩選，得到白芍的潛在的有效活性成分13個。見表1。

表1 白芍活性成分

2.2 白芍有效成分治療AD 的潛在作用靶點預測通過GeneCards、OMIM平臺搜索AD相關靶點合，并刪去重復疾病靶點，運用R語言“VennDia-gram”程序包將與13 個白芍有效成分相關的靶點和疾病靶點取交集，獲得白芍中有效活性成分治療AD的靶點，同時繪制韋恩圖。得到共同靶點60 個，表明白芍可調節多個靶點發揮治療AD 的作用。見圖1。

圖1 白芍有效成分作用靶點及AD靶點交集

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖運用Cytoscape 3.7.1對白芍有效活性成分及其治療AD 形成的作用靶點進行關系網絡繪制和統計。經分析，白芍發揮重要作用的生物活性成分與對應作用靶點的相互關系見圖2。中介中心度和網絡節點度值揭示了節點在網絡圖中核心度的高低，度值越高，說明該節點在網絡圖中就越重要。本研究按Degree 值和BC 值大小排序篩選核心成分和靶點，結果顯示，槲皮素、小檗堿、小檗紅堿、（R）-卡納丁、柏林濱、巴馬汀、黃連堿、沃勒寧等靶點是整個網絡的核心節點，揭示這些節點是白芍治療AD形成的有效成分或靶點。見表2。

圖2 白芍治療AD形成的藥物-成分-靶點-疾病網絡

2.4 白芍治療AD 形成的關鍵靶點利用PPI 網絡分析登陸STRING 數據庫平臺，輸入白芍有效活性成分治療AD形成的靶點，設定置限制條件＞0.9，將獨立于網絡之外的蛋白予以排除，得到白芍有效活性成分對應的靶點PPI網絡，見圖3。網絡圖中的“節點”代表藥物靶點，“邊”表示靶點之間的相互作用關系。邊數越多表示該節點對應的靶點在網絡中的作用越重要。運用R 語言抽取網絡中的關鍵靶點的信息條形圖，見圖4。結果表明，IL-6、JUN、PTGS2、CAPS3、MMP9、CXCL8、MYC、EGF 等蛋白的度值較高，說明這些蛋白在網絡中的作用顯著，是和其他蛋白互通的紐帶。

圖3 關鍵靶點PPI網絡

圖4 關鍵靶點信息條形圖

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析GO信號通路顯示，白芍治療AD 形成的關鍵靶點富集顯著的前10 個生物學功能主要為受體配體活性（13 個靶點），細胞因子受體結合（12 個靶點），細胞因子活性（11 個靶點），血紅素結合（9 個靶點），四吡咯結合（9 個靶點），內肽酶活性（9 個靶點），泛素樣蛋白連接酶結合（8 個靶點），DNA 結合轉錄激活活性，RNA 聚合酶Ⅱ特異性（8 個靶點）等，表明白芍有效成分可通過調控多種生物學途徑而發揮治療AD的作用，見圖5。運用KEGG通路富集分析，獲取24條信號通路圖，將P＜0.01 為篩選條件，得到有效4條信號通路。見圖6。富集分析發現，基因顯著富集在NF-kappaB（11 個基因）、AGE/RAGE（17 個基因）、IL-17（16 個基因）、TNF（16 個基因）等信號通路上。

圖5 關鍵靶點基因生物功能注釋信息

圖6 關鍵靶點KEGG通路富集分析

3 討論

經網絡拓撲分析結果顯示：berberine、berberrubine、epiberberine、（R）-Canadine、Berlambine、palmatine、quercetin、coptisine、Worenine 等為治療AD 的主要有效成分。槲皮素屬于黃酮類化合物其中之一，在植物中廣泛存在。本研究主要是探討木犀草素對認知功能是否具有保護作用，淀粉樣β（Aβ）肽對大鼠的腦損傷及其相關作用機制。動物行為測試木犀草素能改善Aβ誘導的學習記憶障礙。木犀草素可以逆轉乙酰膽堿酯酶活性的增加，還可使海馬勻漿乙酰膽堿含量升高，丙二醛含量降低。木犀草素能提高Bcl-2/Bax 比值。這項研究表明，木犀草素可能具有治療AD 的潛力［11］。小檗堿對轉基因AD 小鼠的記憶、空間尋找能力有明顯的改善作用，其作用機制可能與增加自噬水平LC3-Ⅱ調控Akt/mTOR 信號通路，同時增加PSD95 蛋白的表達水平及數量有關［12］。

KEGG 通路富集分析揭示，白芍治療AD關鍵靶點基因顯著富集在AGE/RAGE（17 個基因）、IL-17（16 個基因）、TNF（16 個基因）、NF-kappaB（11個基因）等信號通路上。劉繼平等［13］通過對Western blot 進行觀察發現，七福飲復方可以通過降低模型組SD雄性大鼠海馬中AGEs的含量，下調大腦皮層和海馬中RAGE受體和NF-кB信號通路上相關基因的表達，隨著劑量逐步遞增發現本方可逆轉AGEs引起的IL-1β水平的升高。揭示了七福飲復方可抑制AGEs/RAGE/NF-KB 信號通路上相關基因的激活，可通過降低大鼠大腦炎癥反應發揮治療AD的作用［14］。

IL-17 信號通路，與炎癥的發生有密切的關系，現已發現主要是由6個成員IL-17A、IL-17B等組成，IL-17 為受體家族，主要由5 個成員IL-17RA、IL-17RB 等組成。到目前為止，所有的IL-17 受體都招募Act1 作為下游信號傳導的銜接分子。以神經內科住院患者104 例為研究對象［14］，研究發現AD患者體內IL-17表達明顯升高。通過對IL-17 與認知功能評分的關系進行研究，發現在修正了年齡后，IL-17 與簡易精神狀態檢查評分相關性不顯著，而與認知功能檢查量表評分有關聯。

腦部疾病的發生一定程度上與炎癥反應有關聯。TNF超家族具有多種生理功能，可以調節神經系統的平衡。SHAMIM 等［15］研究發現，AD 膠質細胞一旦被激活后，將合成并同時釋放大量TNF-α，更進一步誘導神經炎癥反應，致復雜的神經元反應，促進了神經疾病的進展。在中樞神經系統中TNF-α引起的炎癥反應可誘導β-淀粉樣（amyloid-β，Aβ）蛋白斑塊的沉積，而按照目前Aβ蛋白聯假說，Aβ蛋白在腦細胞內外的積累可能促進了AD 的發展［16］。目前研究發現，在AD的發病過程中，免疫因子引起的慢性炎癥也受到了重視，早期階段TNF-α在參與免疫應答的同時啟動炎癥反應，誘導補體Aβ等的合成，作用于神經元和膠質細胞，影響神經的生長。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學初步篩選了白芍治療AD 的有效成分，并闡釋其作用機制，結果表明，在治療過程涉及了多個有效活性成分、作用靶標及多個信號通路，其作用機制十分復雜，并非僅通過單個成分、作用單個靶標或調控單條通路發揮作用，與中藥治療疾病的多靶點、多通路特點相吻合。為進一步從白芍中提取有效活性成分治療AD提供了參考。但從網絡藥理學層面，來探究白芍藥物有效活性成分治療AD的作用機制，只是一種理論性的探討，仍需通過相關實驗來驗證。