白腐菌與厭氧污泥共培養強化秸稈濕式厭氧發酵

袁文典, 于麒麟, 張耀斌

(大連理工大學 環境學院 工業生態與環境工程教育部重點實驗室, 遼寧 大連 116024)

0 引 言

在我國農業向規?；?、專業化發展的道路上,農作物秸稈和畜禽糞便等廢棄物的處理成為農業前進的桎梏。根據農業農村部2022年的數據,我國仍有8 700萬噸左右的秸稈未能有效利用[1]。厭氧消化技術因其能耗低、能量轉化率高,除能生產清潔能源沼氣外,發酵的殘余物沼液、沼渣還可用作有機肥等優點,已成為農業廢棄物能源化利用的重要技術路線,是實現我國“雙碳”目標的重要手段之一。秸稈類生物質主要成分包括32%～47%的纖維素、19%～27%的半纖維素和5%～24%的木質素[2]。然而目前以木質纖維素作原料的濕式發酵水處理技術仍有一些難題,如以木質素為主體的框架阻礙微生物對于秸稈的分解利用,發酵次產物限制微生物種間電子傳遞等[3]。當前,國內外的主要解決辦法仍以預處理為主,如通過蒸汽爆破、酸堿預處理、真菌預處理、酶發酵等物化生手段,使秸稈改性或易利用組分暴露,從而實現后續厭氧消化的高效運行[4]。然而由此產生的人力、物力與時間空間成本,制約了秸稈濕式厭氧消化技術推廣。

自然環境中,白腐菌是秸稈、樹木木質素的主要分解者。在氧氣參與下,白腐菌氧化輔酶產生過氧化物,進而在多種過氧化物酶的作用下,進攻木質素的苯環并產生苯氧自由基,誘發木質素裂解[5]。大量研究表明,真菌利用氧氣降解木質纖維素時伴隨有醌基氧化還原循環和腐殖質形成[6]。GRINHUT等指出白腐真菌可以促進分解和礦化一些較難腐解的有機物[7]。CHEN利用黃孢原毛平革菌腐熟秸稈并研討不同時間段對堆肥情況的影響,發現在腐熟過程中,碳氮比降低而腐殖化程度升高[8]。大量研究報道,腐殖質由于醌基的存在,可以作為電子穿梭體,增強產甲烷菌群的胞外電子傳遞[9-10]。此外,氧氣也常是促進難分解底物厭氧消化的一種手段,有研究報道微好氧下秸稈厭氧發酵效果有所提高[11]。

此外,白腐真菌的種類繁多,絕大部分為擔子菌,少部分為子囊菌,其對木質素的降解通常有兩種形式:選擇性和非選擇性。在選擇性降解中,較難被利用的木質素可以被優先降解,而易被利用的纖維素和半纖維素部分幾乎沒有發生降解;非選擇性降解中,木質纖維素生物質所有部分同時發生降解。TANIGUCHI等發現,在其研究的菌株中(P.chrysosporium、C.subvermispora、Trametesversicolor、Pleurotusostreatus),P.chrysosporium(黃孢原毛平革菌)在選擇性降解木質素成分方面最成功,而更高的選擇性也意味著可生化性的最大保留,能為后續產甲烷菌群留存更多營養物質[12]。

因此,本研究在傳統濕式厭氧消化體系中引入黃孢原毛平革菌(后稱白腐菌),在微氧條件強化秸稈懸浮液濕式發酵,同時,通過分析共培養體系的代謝過程,探究在不經預處理下木質素底物甲烷化的效果與可行性。

1 實驗方法與材料

1.1 實驗材料

接種污泥取自大連某污泥處理廠的厭氧污泥消化罐,污泥含固率約為15%。使用20目篩網將污泥過篩后,用人工廢水活化一周后備用,活化后部分指標見表1。人工廢水采用葡萄糖為主要碳源(COD濃度為5 000 mg/L),NH4Cl和KH2PO4作為氮源和磷源(COD∶N∶P=200∶5∶1)。使用酵母浸粉作為維生素和微量元素補充劑,濃度約0.4 g/L。采用NaHCO3調節初始pH為7.0～7.2。秸稈收集自江蘇連云港附近某玉米農田,機械粉碎后過100目篩,陰涼干燥處保存備用,秸稈部分物性參數見表2。黃孢原毛平革菌購自北納生物河南省工業微生物菌種工程技術研究中心,使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化,在30 ℃培養5 d后,使用無菌水沖刷刮取菌落獲得孢子懸濁液,稀釋至OD600測量值為1.0,加入甘油至比例為30%,-20 ℃保存用作后續實驗接種。

其余實驗試劑均購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

表1 實驗厭氧污泥初始指標

1.2 實驗設置

實驗采用半連續模式。在500 mL的雙通絲口瓶中進行,加入50 g厭氧污泥,加去離子水使最終體積為500 mL。兩通一出口連接氣袋采集氣體,另一出口連接軟管收集實驗固液混合物。在實驗第0天與第6天向實驗組投加1 mL上述接種孢子懸浮液,向對照組投加1 mL滅菌后孢子懸浮液。每組設3個平行。實驗設置水力停留時間(HRT)為30 d,每3 d取樣50 mL,并補充底物進水。取樣時振蕩搖勻后用作后續分析檢測。配置底物進水采用秸稈作為唯一碳源,NH4Cl和KH2PO4作為氮源和磷源,濃度分別控制在40、2、1 g/L。采用NaHCO3調節進水pH為7.0～7.2,同時曝N2控制溶解氧在0.6 mg/L。放入37 ℃恒溫房(專門用作恒溫培養的房間)中進行厭氧消化,以一個水力停留時間段為一個周期,運行2個周期。

表2 實驗秸稈物性參數

1.3 分析方法

實驗部分指標測定方法及儀器詳情見表3。實驗中多糖、蛋白質常規指標測定參照水和廢水監測分析方法(第四版);COD的測定方法:取搖勻后的固液混合物,直接測量總體的COD為TCOD,離心后(8 000 r/min,10 min)取其上清液的COD為SCOD,測量儀器為COD快速測定儀,所用試劑為硫酸-硫酸銀和重鉻酸鉀;TS和VS用質量法測定;氣體體積用注射器測定,氣體成分及占比通過氣相色譜分析;采用電化學工作站循環伏安法(CV)測定污泥的電容性或充放電能力(鉑電極為工作電極,Ag/AgCl為參比電極,鉑電極為對電極)。

三維熒光光譜(EEM)分析使用Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計分析,激發波長Ex=190～560 nm,發射波長Em=230～600 nm,激發和發射波長的狹縫寬度均為10 nm,激發和發射波長的掃描間隔分別為2、5 nm,掃描速度為1 200 nm/min。

紅外分析時,泥樣放入冷凍干燥機中,加蓋冷凍干燥20 h,冷凍干燥條件:壓力1.0 Pa,溫度-54 ℃。采用Thermo Nicolet IS50高級傅里葉變換紅外光譜儀,掃描范圍4 000～400 cm-1,掃描32次,分辨率4 cm-1。

半連續實驗結束后,收集實驗組對照組反應器內的污泥樣品,采用高通量16S rRNA的焦磷酸測序來分析微生物的群落結構。污泥樣品的脫氧核糖核酸(DNA)利用土壤快速DNA提取試劑盒提取,隨后分別對古菌和細菌的V3-V4與真菌的ITS區16S rRNA序列,區進行PCR擴增。匯集和純化后的PCR產物采用IlluminaTruSeqDNA文庫的制備方案進行構建并利用IlluminaHiseq2000測序儀進行測序。

表3 部分指標分析方法及儀器

2 結果與討論

2.1 白腐菌共培養對厭氧發酵秸稈降解的影響

第1周期前10 d,實驗組SCOD更高,最高達到1 200 mg/L(圖1),這可能是由于白腐菌優先利用反應器中的微量氧氣,從而減少污泥中兼性菌的耗氧分解,保留了更多的營養物質;而在后20 d中,實驗組和對照組差異較小,SCOD上升緩慢,從373.2 mg/L增加到477.0 mg/L,而TCOD不斷上升。這可能是秸稈液化困難,難以被利用,導致總有機物積累。其原因可能有二:(1)厭氧污泥難以利用秸稈,這與以往研究中厭氧發酵處理秸稈只有15%～25%的降解率相符[13];(2)反應器設計溶解氧量0.6 mg/L,白腐菌在氧氣不足時增殖緩慢,因此在實驗初期(1～30 d),實驗組與對照組并沒有表現出較大差距。

第2周期實驗組對秸稈的降解效果明顯優于對照組。從第31天開始,實驗組表現出在TCOD和SCOD上的差異,并且差異逐漸擴大。實驗45 d后差異逐漸穩定,此時實驗組TCOD去除率為36.7%,較對照組(27.4%)提高了34.7%。同時,實驗組SCOD((830.6±1.6)mg/L)也比對照組((734.7±17.2)mg/L)提升13%。未投加白腐菌時,厭氧菌群可能利用秸稈結構中側鏈裸露的多糖纖維素進行厭氧發酵[14]。此外有研究報道,厭氧腸道微生物也可降解部分秸稈木質素,降解率一般在23%～37%,這與對照組TCOD的降解率相符[15]。投加白腐菌后,實驗組白腐菌繁殖并利用微量氧氣裂解秸稈中木質素復合體,從而使更多纖維素、半纖維素等易利用組分暴露,促進其降解。這與自然情況下白腐菌對于木質素降解規律相符。此外,實驗組秸稈降解率在第42天后難以繼續提高,可能原因是氧氣不足。

圖1 厭氧發酵混合物有機物濃度變化曲線Fig. 1 Concentration change curve of organic mixture in anaerobic digestion

2.2 白腐菌共培養對厭氧發酵產甲烷的影響

第一個周期的前20 d,實驗組累計產生了511.5 mL甲烷,略高于對照組(470.9 mL)。效果僅微弱提升可能是由于部分秸稈在白腐菌增殖過程中被分解利用,但總體由于白腐菌正處于從孢子向菌絲體轉變的增殖階段,與實驗組差異較小。24 d后,實驗組產甲烷性能與對照組表現出差距,甲烷日產量不斷提高(圖2(a))。45～60 d,實驗組平均日甲烷產量為(109.7±8.3) mL,底物甲烷產率為75.76 mL/g VS,較對照組((75.6±6.2)mL、52.21 mL/g VS)提升了45%。

圖2 甲烷產量曲線Fig. 2 Methane yield curves

甲烷產率提高比例高于降解率的提高比例,推測是由于白腐菌除了通過分解秸稈提供額外的營養物外,還利用了其他途徑刺激產甲烷過程?？赡艿脑驗榘赘到饽举|素的代謝產物更好地促進了產甲烷體系的代謝途徑。根據GUILLéN的研究,木質素經白腐菌代謝后產生的產物中醌基的含量提高,而醌基則作為電子穿梭體的核心官能團可加快產甲烷菌群的胞外電子傳遞,進而促進產甲烷代謝,提高甲烷產量[16-17]。本文2.4節將進一步測定醌基的相對含量。由甲烷累計產量(圖2(b))可知,實驗組在60 d運行中累計產生1 750.5 mL甲烷,而對照組累計產生了1 279.3 mL甲烷,提高了36.8%。

2.3 電化學測量循環伏安曲線

圖3顯示了共培養污泥的循環伏安曲線(CV)測量結果。圖3(a)是初期污泥與實驗結束后實驗組和對照組的污泥電活性測量結果。圖中非線性可逆氧化還原電流是污泥電活性組分由于充放電過程引起的,而循環伏安曲線的積分面積對應共培養污泥的電容[18]。

圖3 共培養污泥的循環伏安曲線Fig. 3 Cyclic voltammetric curves of co-cultured sludge

實驗末期共培養污泥所對應的氧化還原電流最大,為7.44 μA/cm,其比電容也最大8.26×10-5F,初始污泥和末期對照組污泥2個樣品的最大電流值與比電容分別為2.64 μA/cm與4.64×10-5F和2.00 μA/cm與2.92×10-5F。在電容方面,實驗末期污泥相較于實驗開始時提升了78.0%,相較于對照組提升182.9%。推斷出,白腐菌與污泥共培養有助于污泥的電容提高,并可能參與促進胞外電子傳遞。相較之下,對照組電容反而減小,可能是污泥原有電活性物質的流失造成的,也與上文對照組末期甲烷產量不佳的表現一致。

此外,實驗組循環伏安曲線出現了明顯的氧化還原峰,氧化峰位于0.478 mV,還原峰位于-0.571 mV。從圖3(b)觀察,總體上峰型對稱,且在不同掃描速度下氧化還原峰位置不變,說明實驗組末期污泥中存在可逆的氧化還原物質,存在白腐菌通過代謝產生電活性物質促進厭氧產甲烷的可能性。根據氧化還原峰電位以及兩者差值推測可能歸類于腐殖質[9,19-20]。此外,在20 mV/s的掃速下,反掃過程還原峰與氧化峰并不對稱,說明污泥中存在不可逆的還原性組分,這可能與木質素代謝產物相關。

2.4 傅里葉紅外透射檢測

圖4 共培養污泥紅外透射圖譜Fig. 4 Infrared transmission spectra of co-cultured sludge

根據以往對于白腐菌降解木質素的代謝過程的相關研究,白腐菌的過氧化物酶利用過氧化物基團進攻木質素的苯環,促使其向苯氧自由基轉變,進而誘發苯環的裂解。同時由3種單體對羥基苯基(p-hydroxyphenyl, H)、愈創木酰(Guaiacyl, G)和紫丁香酰(Syringyl, S)構成的木質素,存在大量的醚鍵,一般分為β-O-4型、β-β型、β-5型,又以β-O- 4型為主要連接方式[21]。白腐菌的多種過氧化物酶可作用于這些醚鍵,解除木質素復合體的交聯。因此從紅外圖譜中可以看到,相較于對照組,實驗組醚鍵振動峰的信號有所下降,說明木質素復合體中醚鍵斷裂,交聯結構分解;同時1 650 cm-1處峰值的提高說明醌基組分提高,這與白腐菌降解木質素時會形成醌類物質的研究相一致。KAWAI等的文章中報道了漆酶能將β-1型木質素分解形成2,6-二甲氧基-1,4-苯醌,這也與循環伏安檢測的結果一致[22]。

2.5 三維熒光光譜分析

對不同天數的實驗組和對照組污泥進行三維熒光光譜(EEM)表征,如圖5所示,從上至下分別為0、20、40和60 d的結果。根據CHEN等的研究,EEM譜圖可分為5個區域(表4)[23]。已有研究表明,黃腐酸類物質(區域Ⅲ)與腐殖酸類物質(區域Ⅴ)相比,分子質量相對較低,芳香度和氧化程度上都弱于腐殖酸,但在生物可利用性上表現更好[24]。

圖5 實驗各階段污泥EEM譜圖Fig. 5 EEM of sludge at various stages of the experiment

表4 EEM譜圖區域劃分及代表物質

隨時間推移,總體趨勢為從代表芳香性蛋白組分的Ⅰ、Ⅱ區向代表腐殖質的Ⅲ、Ⅴ區轉化;而與微生物代謝產物相關聯的Ⅳ區的整體熒光信號是減弱的;也注意到前20 d中,代表腐殖酸的Ⅴ區的熒光信號都有不同程度的下降。在這一段培養期間,一方面污泥中攜帶的有機物在不斷被消耗,代謝產物不斷向腐殖質轉變;另一方面污泥世代時間短于水力停留時間,導致了生物量的下降,微生物代謝產物濃度降低。

以實驗組與對照組之間的對比分析,差異表現在兩方面:一方面,運行時實驗組代表黃腐酸類物質的Ⅲ區熒光信號顯著高于對照組,意味著實驗組確實有更多的黃腐酸類物質生成,白腐菌刺激了底物腐殖化;另一方面,運行20 d后,代表腐植酸類物質的Ⅴ區,只在實驗組中出現熒光信號強度回升,代表腐殖質物質又有所增加。根據已有研究表明,白腐菌確實參與了自然界中的腐殖化過程。根據PAUL等的研究,白腐菌可以加速堆肥腐殖化,能以植物殘體中的木質素降解產物為骨架,先縮合形成黃腐酸,之后芳香度不斷提高向腐殖酸方向演化,這與實驗組EEM譜圖的變化過程是一致的[25]。對照組因為難以將秸稈液化,厭氧消化和腐殖化過程緩慢。

2.6 微生物群落分析

取運行結束實驗組污泥進行16S rRNA鑒定,在屬層面進行分析(圖6)。

圖6 實驗組末期污泥微生物豐度圖Fig. 6 Plot of microbial abundance at the end of the experimental group

在真菌層面分析顯示,投加的P.chrysosporium占有真菌相對豐度的5.8%,說明黃孢原毛平革菌確實在共培養體系中穩定存在。污泥中占主導地位的是Tarzetta,其相對豐度為60.8%,根據HYDE等的研究表明該菌可以腐殖化朽木,同時與脲酶的活性有顯著的正相關[26-27];其原因或許是共培養體系胞外酶降解發酵形成了尿素,為該細菌提供了代謝底物。

在古菌層面,占主導地位的是Methanothrix與Conexivisphaera菌,其相對豐度分別為41.0%與36.8%。據報道,Methanothrix主要以乙酸裂解途徑產生甲烷,此外Methanothrix有種間直接電子傳遞(DIET)能力,在互氧代謝中可以借助DIET利用有機物產甲烷[20],而Conexivisphaera菌是一種嗜酸嗜熱古菌,并且具有硫鐵還原能力[28]。這2種菌的大量存在說明污泥中存在圍繞胞外呼吸的微生物活動,很可能存在DIET過程[29]。

在細菌層面,Levilinea是占主導地位的菌屬,相對豐度為27.1%。其與相對豐度占比為6.7%的Longilinea菌屬經常被一起提及,歸因于它們降解喹啉和吲哚的能力[30]。同時Levilinea也作為丙酸鹽氧化細菌與Methanothrix配合一起被報道,推測共培養體系并非以短鏈揮發性脂肪酸為主要底物進行厭氧產甲烷,而是以木質素開環后形成的長鏈脂肪酸為底物。這些細菌菌屬豐度的提高,有利于共培養菌群降解秸稈代謝產物中含氮雜環類物質。

3 結 論

本研究將黃孢原毛平革菌與傳統厭氧污泥在微氧情況下共培養,實現了在不經預處理情況下對秸稈木質素濕式發酵利用,證明了共培養體系的可行性。一方面,通過在微氧下構建白腐菌和產甲烷菌復合菌群,形成了新的共培養污泥群落,同時促進了秸稈的液化、腐殖化;另一方面,白腐菌對秸稈的木質素復合體的解聚開環中形成的大量醌基和類腐殖質物質有助于產甲烷菌群的胞外電子傳遞過程,推動了厭氧產甲烷。然而,黃孢原毛平革菌引入后群落的代謝仍需要進一步研究,特別是氧氣參與下木質素的解聚與腐殖質的形成機理和細菌古菌與真菌的互作共生機制仍不充分。這些發現有望為木質素的高效生物精煉利用提供參考信息。