水熱炭與共基質對苯酚厭氧降解的影響

邵錢祺,羅 濤,4,張士成,羅 剛,*

(1. 復旦大學 環境科學與工程系, 上海 200438; 2. 上海市有機廢棄物污染控制與資源化專業技術 服務平臺, 上海 200438; 3. 上海市污染控制與生態安全研究院, 上海 200092; 4. 上海建科環境技術有限公司, 上海 200032)

0 引 言

苯酚是一種有毒、致癌的芳香族化合物,廣泛存在于煤氣化、制藥和農藥、煉油等工業廢水中[1],也可由腐殖酸和單寧化合物等自然芳香物質降解產生[2]。據統計,每年有超過1 000萬t酚類廢水排放到環境中[3],這些含有高濃度酚類物質的廢水如未經適當處理直接排放,將會對生態環境和人體健康造成極大危害。

厭氧消化(Anaerobic Digestion, AD)是一種可持續、環保且經濟的生物過程,目前已廣泛應用于有機廢水處理[4]。苯酚的厭氧降解是復雜而緩慢的過程,其穩定性取決于微生物群落、化合物的生物降解特性和化學特性[5]。一方面,苯酚向苯甲酸鹽轉化的過程是苯酚厭氧降解的限速步驟[6];另一方面,由于苯酚及其中間產物(如苯甲酸鹽)的毒性較高[7],不利于產甲烷菌的富集,使得苯酚的乙酸發酵型產甲烷過程較為脆弱。因此,尋找合適的方法提高苯酚厭氧降解效果和產甲烷效率是關鍵。

在強化酚類化合物厭氧消化的研究中,生物刺激法是刺激原始微生物群落生長或生物活動以促進生物降解過程,主要包括添加營養素和其他化合物、優化工藝參數等方式[8]。投加共基質之后的厭氧消化過程也被稱為共代謝,是難處理物質或有毒物質常見的厭氧強化技術,然而其對苯酚厭氧降解的影響尚不清楚。此外,先前的研究中已發現水熱炭在苯酚厭氧降解中使最大產甲烷速率(Rm)提高了79.1%[9]。如果能夠同時利用水熱炭與共代謝,進一步強化苯酚的厭氧降解,對實現苯酚的高效處理與甲烷回收具有重要意義。

本研究將水熱炭與共代謝結合,探究二者耦合能否進一步促進苯酚的厭氧消化。實驗采用葡萄糖作為共基質,260 ℃水熱炭作為投加的炭材料[9],將二者同時添加至苯酚厭氧消化過程中,探究其對苯酚厭氧消化影響。此外,還評估了不同葡萄糖濃度對苯酚厭氧消化的影響,并確定最佳的添加濃度。進一步通過16S rDNA高通量測序探究其中的微生物種類和豐度變化,為苯酚降解提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用接種污泥取自處理酒精廢水的UASB反應器中的顆粒污泥,其總固體含量(Total Solids,TS)為(37.2±1.5) g/L,揮發性固體含量(Volatile Solids,VS)為(30.1±1.1) g/L,pH為7.2±0.1。苯酚(分析純)和共基質葡萄糖(分析純)分別購自阿拉丁試劑(上海)有限公司和國藥集團化學試劑有限公司。

水熱炭的制備以玉米秸稈為原料,玉米秸稈與去離子水按質量比1∶19加入1 L加壓攪拌釜式反應器中,在260 ℃下以200 r/min攪拌速率持續運行0.5 h。水熱反應結束后,用冷卻水將反應器冷卻至室溫,使用真空抽濾裝置分離水熱炭與液相產物。隨后使用四氫呋喃多次沖洗水熱炭以除去其表面的生物油,并用去離子水洗去四氫呋喃。最后將水熱炭置于105 ℃烘箱烘干24 h后進行研磨,并用孔徑為3.0 mm的不銹鋼網篩篩分。

1.2 試驗裝置及運行策略

為探究水熱炭與葡萄糖共基質同時添加對苯酚厭氧降解的影響,并確定最適的共基質添加濃度,設置了10組批式厭氧試驗,分為不加水熱炭(A)與添加水熱炭(B)兩批,每批按相同的葡萄糖濃度梯度分為5組,葡萄糖濃度梯度設置為0、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L。實驗設計見表1。

所有試驗均在118 mL血清瓶中進行,向每個反應器中加入所需量的苯酚、葡萄糖、水、水熱炭和接種污泥,最終工作體積為60 mL,各條件設置3個重復實驗。

1.3 分析方法

TS、VS和pH等均采用標準方法測定[10]。采用配有熱導檢測器的氣相色譜(GC)(GC-960,中國海信),以N2作為載氣,測量血清瓶中的甲烷含量[11]。揮發性脂肪酸(Volatile Fatty Acids,VFAs)和苯酚的濃度通過配備火焰離子化檢測器的GC(GC-2010Plus,島津)測量[12],色譜柱為Agilent HP-FFAP。

表1 實驗設計

共代謝厭氧試驗末期的微生物樣品用于16S rDNA高通量測序分析。根據 E.Z.N.A. soil DNA kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進行微生物群落總DNA抽提,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量,使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。使用通用引物515F(5′- GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA 基因 V4～V5區進行PCR擴增。將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrepDNAGel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進行回收產物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用Quantus Fluorometer (Promega, USA)對回收產物進行檢測、定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫。利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序。Illumina測序得到的PE reads進行樣本拆分后,首先根據測序質量對雙端Reads進行質控和過濾,同時根據雙端Reads之間的overlap關系進行拼接,獲得質控拼接之后的優化數據。然后使用序列降噪方法(DADA2/Deblur等)處理優化數據,獲得ASV(Amplicon Sequence Variant)代表序列和豐度信息并進一步分析。

1.4 修正的Gompertz模型

使用修正的Gompertz模型(Gompertz1,式(1))定量分析不同反應器的產甲烷過程。

(1)

式中:M(t)——時間t時的累積甲烷產量,mL;

P——最大產甲烷潛力,mL CH4;

Rm——最大產甲烷速率,mL/d;

λ——延滯期時間,d。

使用Origin 2021全局曲線擬合估計了3個參數P、Rm和λ;e值以2.718 28計,使數據和模型曲線之間的誤差平方和最小。

由于共代謝實驗中添加了葡萄糖作為共基質,葡萄糖基質產生的甲烷會干擾Gompertz1模型對苯酚產甲烷動力學參數的定量分析,使得葡萄糖濃度較高時,Gompertz1模型的難以擬合出苯酚產甲烷過程的參數。故在Gompertz1模型基礎上提出了Gompertz2模型(式(2))。該模型有助于分離葡萄糖產甲烷過程和苯酚產甲烷過程,專用于分析共代謝實驗中葡萄糖濃度較高的實驗組。當葡萄糖濃度較低時,Gompertz2模型擬合效果不佳,故仍使用Gompertz1模型。

(2)

式中,M(t)——時間t時的累積甲烷產量,mL;

P1,P2——一階段(葡萄糖)和二階段(苯酚)的最大產甲烷潛力,mL CH4;

Rm1,Rm2——一階段(葡萄糖)和二階段(苯酚)的最大產甲烷速率,mL/d;

λ1,λ2——一階段(葡萄糖)和二階段(苯酚)的甲烷化延滯期,d。

使用Origin2021全局曲線擬合估計了所有參數,實驗數據和模型曲線之間的誤差平方和最小;e值以2.718 28計。

2 結果與討論

2.1 對甲烷生成的影響

添加葡萄糖共基質對苯酚厭氧消化存在促進作用,如圖1所示,相比未添加葡萄糖的對照組,A組和B組各反應器中最高累積甲烷產量分別增加了42.52%～208.89%和16.15%～157.93%。盡管最高累積甲烷產量隨葡萄糖濃度增加,但A組與B組分別在葡萄糖濃度為1.0 g/L(A2、B2)和2.0 g/L(A3、B3)時達到最短苯酚甲烷化延滯期和最高產甲烷速率。該現象的產生可能是在高葡萄糖濃度下初始傳質阻力較大和微生物耐受性較差所致[13]。此外,共代謝動力學模型研究[14]認為,共基質和目標污染物對關鍵酶的活性位點具有競爭效應,從而產生抑制作用。表2為苯酚降解過程中產甲烷動力學參數。

表2 甲烷生產動力學參數

圖1 未添加水熱炭和添加水熱炭反應器中 累計甲烷產量變化Fig. 1 Cumulative methane production changes in reactors without hydrochar added and with hydrochar added

進一步分析表明,不同濃度葡萄糖均對苯酚甲烷化延滯期的存在縮短效果。A0組的延滯期長達77.5 d,但A1～A4組延滯期縮短到了41.4～59.3 d。同時,水熱炭對苯酚厭氧消化產生了促進作用。在相同的葡萄糖添加量下,與A組相比,B組延滯期縮短了36.3%～55.7%。此外,在水熱炭存在的情況下,較A組相比,B組中各反應器Rm分別增長了6.3%～300.0%。因此,共基質與水熱炭同時添加能夠進一步強化苯酚厭氧消化過程。

2.2 對苯酚降解的影響

如圖2所示,添加水熱炭能夠顯著促進苯酚的降解。水熱炭的添加使苯酚被完全降解所需時間從54～90 d減少至30～42 d。該結果與先前的研究結果一致[9],可能是水熱炭良好的吸附作用所致。此外,在A組觀察到,當葡萄糖濃度為0～2.0 g/L時,苯酚降解速率隨濃度提高而加快。然而,當葡萄糖濃度為4.0 g/L時,A4中的降解速率較A0未明顯增加。同時,在B組中添加2.0 g/L葡萄糖的反應器也同樣表現出了最佳的苯酚降解速率。值得注意的是,在B組中添加4.0 g/L葡萄糖的B4反應器受到高濃度共基質抑制情況并不明顯,這說明水熱炭能夠一定程度上緩解高濃度葡萄糖的競爭抑制,從而提高苯酚厭氧降解效率。

2.3 對揮發性脂肪酸積累的影響

圖3是各反應器中的VFAs變化趨勢。VFAs的積累可以根據降解基質分為兩個階段,第一階段是由葡萄糖降解主導的VFAs積累,并在18 ～24 d時進入由苯酚降解主導的VFAs積累階段。在6 d時可以觀察到,A組和B組中丁酸均為主要的VFAs組分,且其累積量隨葡萄糖濃度的增加而提升。丁酸作為葡萄糖酸化的主要代謝產物[15],其大量積累可以說明底物中葡萄糖在反應初期即被大量消耗。在24 d后,A組和B組中均無丁酸,乙酸成為主要VFAs組分。先前研究表明,乙酸是苯酚厭氧降解的最終產物[16],因此可以推測苯酚在該階段被顯著降解。此外,對比不同葡萄糖濃度的反應器,添加量為0、4.0 g/L葡萄糖的反應器在苯酚降解階段的乙酸積累量更多,且最高積累量出現的時間更晚,可能是因為這些反應器中的乙酸消耗活性較低。這一結果再次表明了高濃度共基質對苯酚厭氧消化的促進作用較低。

圖3 未添加水熱炭和添加水熱炭反應器中VFAs濃度變化Fig. 3 VFAs concentration changes in reactors without hydrochar added and with hydrochar added

2.4 微生物多樣性分析

通過α多樣性能夠量化分析各反應器中微生物群落的豐富度和多樣性。其中,Sobs指數和Shannon指數通常分別用于反映物種豐富度和群落水平的多樣性。如圖4所示,總體而言,水熱炭的添加使B組中各反應器中Sobs指數低于A組中相同葡萄添加量下的反應器,表明水熱炭添加對微生物多樣性表現出一定的負面作用,這可能是因為水熱炭添加特異性富集了部分菌群。

圖4 各反應器的微生物的多樣性指數(R2>0.99)Fig. 4 Diversity index of microorganisms in each reactor (R2>0.99)

為了研究樣本群落組成的相似性或差異性,對樣本數據在ASV水平上進行了Principal Co-ordinates Analysis(PCoA),結果如圖5所示。未添加水熱炭的A組與加炭的B組在主坐標系上差異較大,表明水熱炭對群落組成影響更為強烈。相比之下,不同共基質濃度對群落組成影響相對較小,但高濃度共基質添加的反應器(A4、B4)仍與其它組在群落組成上存在較大差異。此外,添加水熱炭的B0、B1、B2、B3反應器顯示出了非常小的群落組成差異,水熱炭可能減輕了不同共基質濃度對群落組成的影響。

圖5 各微生物群落在ASV水平的PCoA分析Fig. 5 PCoA analysis of various microbial communities on ASV level

2.5 古菌群落分析

古菌在甲烷生成的過程中至關重要,各反應器中古菌在屬水平的群落組成如圖6所示。其中Methanobacterium、Methanosaeta(又名Methanothrix)是最重要的兩個屬,兩者相對豐度之和在A組達到了所有古菌的83.79%～90.02%;B組中水熱炭的添加使其進一步提高至91.53%～94.92%。兩種菌在B組中的顯著富集可能是其微生物多樣性較A組下降的原因。進一步分析發現,在A組中Methanosaeta的相對豐度先增加后減少,與苯酚厭氧消化活性趨勢一致。然而,Methanobacterium的相對豐度則隨共基質濃度的增加先減少后增加。Methanosaeta是一種典型的耗乙酸產甲烷菌[17],在苯酚降解過程中發揮著重要作用,是苯甲酸厭氧代謝產物的主要消耗者。Methanobacterium主要利用葡萄糖和苯酚厭氧降解過程中的副產物H2進行耗氫產甲烷[18],其相對豐度從A0的57.47%上升至A4中的67.21%;這可能是A4反應器中累積甲烷是A組中最高的反應器原因之一。相反,在B組中Methanosaeta和Methanobacterium的相對豐度隨葡萄糖濃度上升分別出現先減少后增加和先增加后減少的趨勢。從圖3可知,A組較B組在前期水解、酸化階段表現出的較高的乙酸累積量,可能是Methanosaeta對A組產甲烷過程影響更為明顯的原因之一。A組、B組中不同共基質添加量下優勢菌門豐度變化趨勢的差異也反映出水熱炭對苯酚厭氧降解過程微生物群落結構的顯著影響。Methanobacterium能夠參與直接種間電子傳遞(DIET)的過程[19],已有許多研究表明[20-21],碳材料的添加能夠有效富集Methanobacterium從而加速VFAs的消耗,提升產甲烷效率,這也是同時添加共基質與水熱炭能夠進一步強化苯酚厭氧降解的另一重要因素。

圖6 古菌在屬水平的群落組成Fig. 6 Community composition of archaea at genus level

2.6 細菌群落分析

圖7為細菌在門水平的群落組成。細菌群落以Firmicutes、Chloroflexi、Bacteroidota和Desulfobacterota為主。

在A組中,Chloroflexi相對豐度隨共基質濃度的變化趨勢與苯酚厭氧消化活性相同,并在葡萄糖添加量為1.0 g/L時達到最高值14.32%,是未添加葡萄糖反應器中的2.1倍。Chloroflexi是厭氧消化過程中葡萄糖的主要消耗者,因此,其在A1～A3中的富集也是對應反應器苯酚厭氧消化性能提升的原因之一。有研究指出,Firmicutes和Bacteroidota的相對豐度之間呈顯負相關[22],在A組各反應器中也呈現了相同的現象。Bacteroidota能夠與產甲烷菌建立共生關系,并將葡萄糖靶向轉化為乙酸和H2[23],進而促進厭氧消化的穩定運行。因此,Bacteroidota在A1～A3中相對豐度的增加可能是苯酚甲烷化延滯期和苯酚降解時間縮短的原因之一。

圖7 細菌在門水平的群落組成Fig. 7 Community composition of bacteria at phylum level

值得注意的是,水熱炭的添加顯著富集了Acidobacteriota,其相對豐度從A組中的0.17%～1.51%顯著增加至B組中的6.21%～10.80%,成為優勢菌門。Acidobacteriota能夠對包括葡萄糖在內的多種糖類物質進行降解[24],其特異性富集是促使共基質與水熱炭添加提升苯酚厭氧消化性能的重要因素。

圖8進一步在屬水平上分析了細菌的群落組成。Syntrophus、Hydrogenispora、Pelotomaculum、DMER64、Syner-01和Aminobacterium是最主要的幾種微生物。其中,Syntrophus屬于Syntrophaceae科,是一種典型的苯甲酸厭氧代謝菌[25],能夠通過與消耗氫/甲酸鹽的微生物的合養以降解苯甲酸鹽和某些脂肪酸[26]。其在B組中被顯著富集,相對豐度從A組中的0.14%～0.21%上升至B組中的6.81%～18.98%。先前研究發現,Syntrophus能夠產生DIET所需的導電菌毛,并可以通過DIET生長[27]。因此,水熱炭可能通過促進Syntrophus與其合養產甲烷菌之間的DIET提高苯酚降解效率。此外,Syner-01也同樣在B組中被觀察到富集。在相同的葡萄糖濃度下,水熱炭的添加使Syner-01的相對豐度最高提高了約3.02倍。Syner-01屬于Synergistaceae科,在厭氧消化的互營乙酸氧化和氨基酸氧化過程中發揮著重要的作用[28]。

圖8 細菌在屬水平的群落組成Fig. 8 Community composition of bacteria at genus level

值得注意的是,Hydrogenispora在A4和B4中的相對豐度分別為6.50%和11.09%,是A、B組其他反應器中該屬相對豐度的38.48～355.40倍和2.13～7.11倍。Hydrogenispora在高濃度葡萄糖組相對豐度較高,這可能是因為Hydrogenispora能夠將葡萄糖向乙酸、乙醇和氫氣等轉化[29],因此在高濃度葡萄糖環境下競爭力更強。

Pelotomaculum的相對豐度則隨共基質濃度的提高呈先減后增趨勢。以A組為例,Pelotomaculum在A0和A4中的濃度可達8.83%和7.02%,而在A1～A3中最高僅為1.73%。在先前的研究中發現,Pelotomaculum在與耗氫甲烷菌Methanspirillumhungatei的共培養中,可利用2種或3種鄰苯二甲酸酯異構體進行生長,并產生乙酸鹽和甲烷等最終產物,但不能利用對羥基苯甲酸作為電子受體[30]。

同時,DMER64的相對豐度在A2、A3和B2、B3中較A、B組其他反應器顯著上升。據報道,DMER64能夠通過細菌屬將丙酸和丁酸轉化為氫[31],上述反應器內較高的丙酸和丁酸含量是促進DMER64活性的可能原因。DMER64被認為是一種潛在的互營細菌,可以與產甲烷菌建立水熱炭等炭材料介導的DIET,從而提高產甲烷效率[32]。這可能也是葡萄糖濃度在1.0～2.0 g/L苯酚厭氧降解效果最佳的原因之一。

綜上所述,適宜濃度的葡萄糖共基質和水熱炭的添加有利于相關功能微生物的富集,從而提升苯酚厭氧降解性能。

3 總 結

本研究表明,水熱炭和共基質添加均能夠促進苯酚厭氧消化,且二者同時添加能進一步提升促進效果。水熱炭和共基質添加使最高累積產甲烷量較對照組提高了16.15%～208.89%。同時,二者的添加還縮短了苯酚厭氧消化的延滯期,并且提高了甲烷生產的Rm,且葡萄糖共基質對苯酚厭氧消化的促進作用呈現隨濃度增加先增加后減少的趨勢。

對不同反應器中的微生物群落結構進行分析發現,適宜的共基質濃度和水熱炭的添加能夠有效富集功能微生物,強化苯酚厭氧降解性能。葡萄糖共基質的添加能夠富集耗乙酸產甲烷菌Methanosaeta和Chloroflexi、Bacteroidota等細菌。水熱炭的存在進一步提高了2種優勢菌門Methanobacterium、Methanosaeta的豐度和,尤其是能夠參與DIET過程的Methanobacterium。同時,也觀察到Acidobacteriota、Syntrophus、Syner-01等細菌的顯著富集。