青皮竹花形態結構與雌、雄配子的發育研究

閆瀛丹，周 麗，王曙光,3＊

(1. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2. 西南林業大學竹藤科學研究院，云南 昆明 650224；3. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，西南林業大學，云南 昆明 650224)

植物開花是高等植物由營養生長到生殖生長的重要節點[1]，竹類植物開花現象十分罕見，自然條件下竹類植物要經歷幾十年甚至上百年的營養生長階段才會開花，且不同竹種的開花周期有所不同，如紫竹（Phyllostachys nigra(Lodd. ex Lindl.)Munro）、 冷箭竹（Bashania fangiana(A.Camus) Keng f. et Wen）、 毛竹（Ph.edulis(Carrière) J. Houz.）開花周期約為50 a，而角竹（Ph. fimbriligulaT. W. Wen）開花間隔期至少在60 a 以上[2]，但由于地域性影響和環境變化會對竹子開花周期的考察記錄產生局限性，因此前期記載的竹類植物開花周期數據可能存在誤差。竹子開花現象常常伴隨著竹子的死亡，且大多數竹類植物的結實率低，尤其是一些栽培種[3]。竹類植物開花的這些特點嚴重阻礙了科研工作者對竹類植物的生殖生物學和胚胎學等的探索和研究。近年來隨著開花竹種逐漸增加，國內對竹子花器官的形態與解剖結構相關的研究報道也隨之增加，主要集中在竹子花器官及雌雄配子發育的研究，如雷竹（Ph. PraecoxC. D, Chu et C. S. Chao cv. Prevernalis）[4]、巨龍竹（Dendrocalamus sinicusChia et J. L. Sun）[5]、鵝毛竹（Shibataea chinensisNakai）[6]、孝順竹（B. multiplex(Lour.) Raeusch. ex Schult. &Schult. f.）[7]、青絲黃竹（B. eutuldoidesMcClure var. basistriata McClure）[8]、綿竹（B. intermediaHsueh et Yi）[9]、新小竹（Neomicrocalamus prainii(Gamble) P. C. Keng）[10]、‘霞早’綠竹 (B.oldhami‘Xia Zao’ ZSX)[11]、硬頭黃竹（B. rigidaKeng & P. C. Keng）[12]等竹種。

青皮竹（Bambusa textilisMcClure）屬于禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）箣竹屬（Bambusa）竹種，產于廣東、廣西等地，江浙地區、福建、湖南、貴州、云南都有引種栽培，稈為優良的竹編用材和造紙用材，是廣東省造紙廠的主要原料[13]。目前國內對青皮竹的變種及變型、竹林培育、病蟲害防治及材性研究[14]，尤其是力學性能方面[15]等方面進行了相關研究報道，國外關于青皮竹的研究大多與其竹葉提取物相關[16]，但有關青皮竹花器官的研究未見，缺乏對自然生長條件下的青皮竹花器官具體的形態觀察描述及胚胎發育、敗育方面的系統性研究。本研究通過解剖及石蠟切片等手段，對青皮竹花器官進行形態與解剖觀察，系統的描述青皮竹花器官的形態與解剖特征，分析青皮竹花器官雌、雄配子體發育過程，進而探討青皮竹自然狀態下結實率低的原因，并可為竹類植物分類學及生殖生物學研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 實驗地概況

實驗材料于2013 年3 月采集自云南省昆明市西南林業大學珍稀竹種園（25°03' N，102°45' E），僅發現一叢青皮竹竹叢開花，其他竹叢均未開花。由于該竹叢引種歷時久遠，未查閱到相關引種記錄。

西南林業大學竹園面積1 900 m2，紅土，偏酸性。該地區海拔1 891 m，屬于北緯低緯度亞熱帶高原山地季風氣候，季節差異不明顯但分旱、雨兩季，5 月—10 月雨水較多為雨季，11 月—來年4 月降水稀少為旱季，年平均降水量1 450 mm，偶爾受北方冷空氣影響出現降雪天氣。全年溫差較小，年均溫14.7 ℃，最冷月氣溫7.7 ℃，年積溫（≥10 ℃）4 480 ℃，日最低氣溫≤0 ℃日數18 d，極端低溫-5.4 ℃，年平均有霜日數80 d。

1.2 研究方法

選取并采集各個發育階段的青皮竹小花，將花枝及小穗剪下快速浸泡于FAA 固定液（50%乙醇∶甲醛∶冰醋酸＝18∶1∶1）中，帶回實驗室并真空抽氣保存。

對固定保存后的小穗及小花進行解剖和石蠟切片。使用體式解剖鏡（Olympus HO11）對花器官進行解剖，按照順序剝離小穗上的小花，并對各個小花的每個部位進行拍照、測量。將剝離出來的不同發育階段的子房和花藥進行逐級脫水、浸蠟包埋、染色及石蠟切片[17]，切片厚度約為7 μm，番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察并使用二維測量軟件 DS-3000 拍照。

2 結果與分析

2.1 花序及小穗的形態結構

青皮竹的每個花枝各節約有3～5 個小穗（圖1A），青皮竹小穗形狀飽滿，呈淡黃色或黃色，小穗基部常包裹著2～3 枚黃棕色苞片，近似卵形，無毛，苞片一般不脫落，附著在小穗基部（圖2B）。小穗基部具有潛伏芽，可通過產生新的花芽生長成新的小穗，而老的小穗逐漸脫落，這具有有限花序的特征（圖2A）。小穗軸節間清晰可見，但小穗柄不發達。青皮竹每個小穗具有8～10 朵小花，基部小花較大，長約1.80～2.00 cm，靠近頂端小花逐漸減小，長約0.90～1.20 cm（圖1B）?？拷∷腠敳康男』ㄍl育不正常，而靠近小穗基部的花先發育，同一小穗的小花由下至上的發育程度逐漸降低（圖1M），具有明顯的無限花序特征。通常小穗基部的小穗軸較短，一般約為0.30 cm，中部及上部的小穗軸較長，一般約為0.60 cm。小穗成熟后，相鄰小花之間小穗軸易折斷（圖1C）。小穗軸各節頂寬底窄，寬度不相同，頂寬均長0.10 cm，底寬均長0.06 cm。小穗軸呈“喇叭狀”上部中空，由上至下直徑逐漸減小。表面光滑，具棱，棱間具4 脈，棱上有刺毛，未成熟小花小穗軸為淺黃色或白色，成熟小花小穗軸顏色較深（圖2D）。

圖1 青皮竹花序及小穗的結構Fig. 1 The structure of inflorescence and spikelet of B. textilis

圖2 青皮竹花的解剖形態Fig. 2 Morphological anatomy of florets in B. textilis

2.2 青皮竹小花形態結構

青皮竹每朵小花可分為外稃、內稃、雄蕊、漿片、雌蕊五部分（圖1E～L）。青皮竹的小花含內、外稃各1 枚，同一小穗下部小花的內、外稃最長，分別約為1.20 cm 和1.80 cm（圖1E）。越往上部，內、外稃越小，頂部小花的內、外稃最小，分別約為0.40 cm 和1.00 cm（圖1L）。未成熟小花的外稃長度遠遠大于內稃，但成熟小花內外稃長度相差較小，這與《中國竹類圖志》記載的內、外稃長度相似的結論一致[18]。外稃呈橢圓形，內外表面均光滑無毛，無棱，尖端較鈍，約有20 脈（圖2E）。內稃披針狀，對生于外稃內側，由外稃包裹，形狀較扁平且質地較軟，更易舒展。內稃具兩脊，脊上覆有密而短的纖毛，脊間光滑，具8～10 脈，脊外每邊各具4 脈（圖2E）。內、外稃隨著小花的成熟發生褐化（圖2F）。漿片3 枚，大小不一，長0.20～0.50 cm 不等，呈透明膜質魚鱗狀，與金佛山方竹（Chimonobambusa utilis(Keng) Keng f.）[19]的肺形、 斗竹（Oligostachyum spongiosum(C. D. Chu & C. S.Chao) G. H. Ye）[20]和筆竹（Pseudosasa viridulaS. L. Chen & G. Y. Sheng）[21]的卵圓形不同，邊緣具有較多較長的纖毛，圍生于子房下部，與內稃、子房相鄰（圖2I）。與雷竹[22]等花相同，青皮竹小花成熟后，漿片通過吸水膨脹加厚撐開向外擠壓內、外稃，露出柱頭和花藥，完成傳粉后漿片全部褐化（圖2J），所以青皮竹花也屬于開放型花。雄蕊6 枚，將雌蕊包圍在中間（圖3A）。成熟花藥均長約1.20～1.50 cm?；ㄋ幷w外形呈梭形，顏色為淡黃色和黃色?；ㄋ幭榷溯^尖，基部分兩尖，花藥四室縱裂散粉（圖2G），與巨龍竹[5]、毛竹[23]、青絲黃竹[8]、新小竹[10]、鵝毛竹[6]的花藥形態相似，雄蕊成熟后會發生褐化（圖2H）。雌蕊1 枚，未成熟時子房呈黃色，柱頭為淺黃色或白色。成熟后子房下部呈乳白色，上部與花柱連接處呈黃色，柱頭為黃色。成熟子房下部飽滿光滑，呈花瓶狀，直徑約為0.20 cm。子房上部與花柱相連接處及花柱處均生長有密而短的纖毛，越靠近花柱纖毛越長?；ㄖL約0.10 cm，柱頭為三分支羽毛狀，長約0.50～0.70 cm（圖2K）。子房成熟后會發生褐化（圖2L）。張文燕和馬乃訓[24]根據稃片開合情況及柱頭的長度將雌蕊分為長花柱型與短花柱型，青皮竹花的子房花柱較短，柱頭遠長于花柱，因此為短花柱長柱頭型。青皮竹未成熟的子房上部同樣具纖毛，且比成熟子房的纖毛更密更明顯。青皮竹雌蕊分化出孢原細胞時，藥室內的小孢子已經發育到小孢子母細胞時期，為雌雄異熟，應屬異花授粉。

圖3 青皮竹花藥解剖結構Fig. 3 Anther anatomical structure of B. textilis

2.3 青皮竹花藥解剖結構與發育

青皮竹花藥屬于基著藥，4 藥室，兩兩對稱，成熟后縱裂散粉。通過解剖青皮竹小花花藥發現，花藥每個藥室的橫切面形狀大多呈圓形，少數為橢圓形（圖3A）?；ㄋ幈诘慕Y構隨著花藥發育時期的不同而發生變化?；ㄋ幏只跗?，藥隔組織將花藥分為4 個藥室，每個藥室角域處，表皮細胞下各含有1 個孢原細胞，細胞較大，細胞質濃厚（圖3B）。孢原細胞通過平周分裂形成初生壁細胞和初生造孢細胞，進入初生造孢細胞時期（圖3C），此時期藥室內的造孢細胞數量較少，花藥壁開始出現分化。

初生造孢細胞繼續分裂，進入次生造孢時期，此時期的造孢細胞數量增加，細胞質濃厚，細胞間緊密排列。同時，初生壁細胞經過平周分裂和垂周分裂形成兩層次生壁細胞，外層次生壁細胞發育成為藥室內壁細胞，內層次生壁細胞經過多次分裂，分化成兩層細胞，分別為中層細胞和絨氈層細胞。絨氈層細胞屬于腺質型，細胞質濃厚，核仁明顯，花粉粒成熟后絨氈層會退化成為一薄層，緊貼藥室內壁。中層細胞一般由1～2 層細胞組成，后期受到另外兩層壁細胞的擠壓導致嚴重變形，最后退化消失。此時期具有明顯的4 層細胞結構，由內到外依次為絨氈層（Ta）、中層（Ml）、藥室內壁（En）、表皮細胞（Ep）（圖3D）?？v切花藥發現，次生造孢時期各個藥室的造孢細胞發育程度基本一致（圖3F）。

次生造孢組織發生游離分散（圖3E），發育成為小孢子母細胞，此時期細胞明顯增大，細胞核較大，細胞質濃厚（圖3G）。此時花藥壁的中層細胞和部分表皮細胞仍可見細胞核。小孢子母細胞隨后進行減數分裂，通過第一次減數分裂（圖3H），小孢子母細胞分裂形成二分體，二分體進行第二次減數分裂形成四分體，產生的四分體呈平面左右兩兩對稱型（圖3I）。青皮竹每個花藥的各個藥室之間小孢子母細胞發育時期不同步，相同藥室的小孢子發育時期也存在差異，因此青皮竹花藥進入減數分裂時期的發育程度也并不完全不一致。減數分裂完成后，四分體的四個子細胞彼此分離形成4 個單核小孢子，此時期的小孢子細胞細胞質濃厚，無液泡，核位于細胞中央，被稱為單核中央期（圖3J）。隨著小孢子體積逐漸增大，細胞質液化，形成中央大液泡，液泡將細胞核推向細胞壁一側，中層與絨氈層細胞逐漸退化，此時期為單核靠邊期（圖3K），小孢子壁處已經出現萌發孔（圖3L）。隨著花粉粒逐漸成熟，液泡被擠壓消失，細胞質重新填滿細胞，細胞核開始進行有絲分裂，形成雙核（圖3M）或3 核花粉粒（圖3N）。

在花藥成熟過程中，花藥壁中層細胞逐漸被擠壓消失，花粉粒成熟以后，絨氈層完全退化為一層薄膜，與藥室內壁緊密貼合。藥室內壁的徑向壁纖維增厚，纖維層逐漸生成，此時成熟的花藥壁僅余纖維層和表皮細胞共2 層細胞（圖3O）。相鄰藥室的花藥壁因未發生纖維化而縱向開裂，釋放花粉。通過對青皮竹早期的花器官進行縱切可以發現，處于發育早期階段的花藥基部組織形態呈鈍圓形，并不尖銳，與成熟的花藥基部差別較大，因此花藥基部是在花藥發育成熟的過程中逐漸突起變尖的。通過縱切也可以發現，花藥的維管束與小穗軸以及子房的維管束連接在一起（圖3P）。

2.4 青皮竹花藥發育異常

通過對青皮竹的成熟花藥進行解剖和石蠟切片觀察發現，青皮竹花藥有較多的敗育類型，這可能是導致青皮竹結實率低的主要原因。

觀察到的青皮竹花藥的敗育類型主要有以下幾種：（1）花藥壁的表皮細胞發育良好，但其他幾層細胞發育異常，藥室完全皺縮，藥室內物質成團（圖4A）；（2）花藥室中空，無花粉粒形成（圖4B）；（3）小孢子發育成僅具有萌發孔但無完整細胞結構的空殼花粉粒（圖4C）；（4）成熟花粉粒開裂（圖4D）；（5）花藥壁過度發育，向內侵占藥室空間（圖4E）。

圖4 青皮竹花藥發育異常Fig. 4 Abortive anthers of B.textilis

2.5 青皮竹子房形態結構與發育及發育異常

青皮竹子房1 室，側膜胎座，倒生胚珠，雙層珠被（圖5A）。孢原細胞時期子房胚珠的雙珠被原基開始分化。孢原細胞位于珠孔端珠心表皮下方的第一層細胞，孢原細胞體積較大，細胞質較濃厚，細胞核較顯著，核仁清晰（圖5A）。孢原細胞進行分裂發育成大孢子母細胞（圖5B），隨后大孢子母細胞進行減數分裂，形成二分體和四分體，四分體靠近珠孔端的大孢子發育成功能大孢子，功能大孢子進行多次分裂，形成二核胚囊及四核胚囊（圖5C），最終發育成具成熟胚囊的雌蕊。由于實驗材料有限，觀察到的子房不同發育時期較少，僅觀察到孢原細胞、大孢子母細胞時期和四核胚囊時期，由于切片角度以及樣品數量的問題，僅切到兩核。成熟的種胚表明青皮竹的胚囊可以正常發育及受精（圖5D），但在野外收集小穗時，并未采到成熟的種子。經解剖及石蠟切片縱切青皮竹成熟子房和不育小花發現，青皮竹的子房同樣存在發育異常的現象，胚珠發生皺縮、退化，緊貼子房壁（圖5E～F）。

3 討論

McClure[25]根據小穗基部是否具有潛伏芽將竹類植物的花序分為有限花序和無限花序兩種類型，耿伯介[26]進一步定義花序為有限真花序和無限假花序，而林樹燕等[27]通過對翠竹[28]、‘霞早’綠竹[11]等花序的研究，認為竹類植物的花序皆為混合花序。青皮竹小穗下部的小花先發育，具有無限花序的特征，同時小穗的基部具有潛伏芽，該潛伏芽能發育成新的小穗，并且產生新的潛伏芽，又具有有限花序的特征，因此青皮竹也應屬于混合花序。

竹子的小花一般是由外稃、內稃、漿片、雄蕊和雌蕊五部分組成，它們在形態、數量和顏色上因竹種的不同而產生差異[2]，青皮竹的小花同樣具有這五部分。青皮竹小花包括內、外稃各1 枚，外稃呈橢圓狀，內稃對生于外稃內側，較外稃短，呈披針狀，這與筆竹[21]、金佛山方竹[19]內、外稃均為披針狀的稃片形狀略有差異。漿片3 枚，呈透明膜質魚鱗狀，邊緣具發達纖毛，開花時，漿片吸水膨脹，撐開內、外稃，促使雄蕊和柱頭伸出小穗外，屬于開放型花，與斗竹[20]、筆竹[21]和雷竹[22]等開放型花特征一致，但青皮竹小花屬于雌雄異熟，異花授粉。雌蕊1 枚，子房1 室，側膜胎座，倒生胚珠，雙層珠被；花瓶狀且光滑不具棱，上部被絨毛，短花柱長柱頭，具有三分支羽毛狀柱，因此與青絲黃竹的子房在形態上類似[8]。雄蕊6 枚，花藥4 室，未成熟花藥的花藥壁4～5 層，由內向外分別為絨氈層、中層、藥室內壁和表皮；成熟后僅剩纖維層和表皮細胞兩層。絨氈層為腺質型，隨花藥成熟發生退化，僅余一薄層緊貼花藥壁。黃堅欽等[4]認為，在雷竹雄配子體發育過程中，其花藥壁沒有藥室內壁的存在，表皮層不僅行使一般的保護功能，而且在花藥成熟時有幫助花藥開裂的作用，行使了藥室內壁的功能。成熟花粉粒為2 或3 核花粉粒，這與綿竹[9]、青絲黃竹[8]報道類似。

通過切片可觀察到，青皮竹的6 個雄蕊原基在發育過程中存在不同步性，靠近雌蕊前端的1 個花藥原基首先發育，其次是雌蕊兩邊的4 個原基，最后是雌蕊后端的1 個花藥原基發育，由此導致同一小花不同花藥間發育程度的差異。此外，同一花藥的不同藥室之間也存在發育的差異性，其發育程度并不完全一致，同一花藥的4 個藥室可能同時存在相鄰的兩個或三個發育時期。

竹類植物在自然條件下授粉難、開花少及結實率低等問題一直都是竹類植物胚胎學研究的重點[2]，且竹類植物生殖周期長且難以預測，使研究工作更加困難。近幾年國內關于竹類植物花粉敗育和結實率低的報道逐漸增多，在竹類植物的有性生殖過程中，雄配子發育異常，雌配子發育正常的竹種有月月竹（Chimonobambusa sichuanensis(T.P. Yi) T. H. Wen）[29]、巨龍竹[5]、雷竹[19]、毛竹[30]、慈竹（B. emeiensisL. C. Chia & H. L. Fung）[31]等，而在孝順竹[7]、水竹（Ph. HeterocladaOliver）[32]中，其花藥發育正常而子房發育異常。青皮竹的花藥出現了多種敗育情況，可能是青皮竹小花結實率低的重要原因。青皮竹雄蕊發育存在異常，從雄蕊原基開始到形成小孢子母細胞時期，細胞和花藥壁均未見結構和發育異常，但從小孢子母細胞減數分裂開始到花粉粒成熟期間的各個階段，細胞及花藥壁開始出現異常，主要表現為花藥的藥室收縮變形至完全皺縮；花藥中空，無花粉粒形成或小孢子發育成僅具有萌發孔但無完整細胞結構的空殼花粉粒；花藥壁徑向壁未加厚，無纖維層形成；花藥壁過度發育，向內侵占藥室空間。青皮竹雄蕊中花藥藥室皺縮和空殼花粉粒形成的現象，在棉花竹（Tongpeia fungosa(T. P. Yi) Stapleton）[33]、綿竹[9]、青稈竹（B. tuldoidesMunro）[34]、龍竹（D.giganteusWall. ex Munro）[35]等竹種中均有發現。青皮竹雌蕊發育過程中也存在敗育現象，子房受精后胚珠發育異常也是青皮竹結實率低的一個原因。綜上所述，在自然條件下竹類植物大多數敗育花藥在成熟過程中已經處于異常狀態，甚至花粉成熟后無法正常釋放花粉粒，這與de Souza[36]報道的花粉粒在花藥成熟開裂釋放后失去活性的結論不同，另外，雌蕊敗育也是導致結實率低的重要原因，雌蕊和雄蕊任何一方出現異常都會導致種子無法正常形成。王曙光[5]、林樹燕[37]認為除了內在原因外，外部條件如季節、氣候和傳粉條件等都會影響竹類植物的結實率。

4 結論

青皮竹小花屬于開放型花，具有內、外稃各1 枚，漿片3 枚，雌蕊1 枚，雄蕊6 枚。子房1 室，側膜胎座，倒生胚珠，雙層珠被；花藥4 室，未成熟花藥的花藥壁4～5 層。成熟花粉粒為2 或3 核花粉粒。青皮竹的雌蕊和雄蕊在發育過程中均出現了多種敗育情況，并且青皮竹花為雌雄異熟，導致青皮竹無法自花授粉，大大降低了其開花授粉的成功率，且野外條件下竹子本身很少開花，可受粉的成熟子房較少，嚴重影響其結實率。本研究探討了青皮竹的花器官形態特征，其雌、雄配子體的發育及結實率低的原因，為該屬系統分類及生殖生物學提供基礎資料。