優化T-SPOT.TB在區分脊柱結核與其他脊柱感染中的診斷效能

周 瑩,胡小江,江仲景,陳俊寶,張 廣,張宏其,李艷冰,高琪樂

(1. 廣西醫學科學院廣西壯族自治區人民醫院精準聯合檢驗中心,廣西 南寧 530021; 2. 中南大學湘雅醫院骨科脊柱外科,湖南 長沙 410008; 3. 中南大學湘雅醫院檢驗科,湖南 長沙 410008; 4. 中南大學湘雅醫院國家老年疾病臨床醫學研究中心,湖南 長沙 410008)

結核病(tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病。根據世界衛生組織(WHO)報道,2018年全球大多數新發TB患者來自東南亞地區(44%),中國TB發病率位居世界第三(9%)[1]。在所有TB中,肺外結核病(EPTB)約占10%,其中半數累及肌肉骨骼系統,脊柱是最常見的受累部位(占1%～2%)[2]。早期抗結核治療可降低脊柱結核(STB)肢體殘疾和損傷發生率,但目前缺乏早期診斷STB的手段。確診TB需要通過有創性檢查取得病灶標本,但受病灶部位取材不易、取材不充分及標本中菌量有限等因素影響,TB病原學和病理學檢測陽性率低[3],診斷難度大。結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是利用結核分枝桿菌特異的早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)刺激外周血中的免疫細胞,通過酶聯免疫斑點技術(ELIS POT)檢測產生干擾素-γ(IFN-γ)的單個T淋巴細胞數量。T-SPOT.TB是一項全世界廣泛認可的TB快速診斷技術,在TB診斷中具有較高的靈敏度和特異度[4],但應用于STB診斷的研究報道甚少。

脊柱感染的致病因素可以是化膿性細菌(如葡萄球菌屬或布魯氏菌)感染、寄生蟲感染或結核分枝桿菌感染[5]。STB與非結核脊柱感染的影像學表現及臨床特征相似,缺乏特異性的鑒別診斷方法,使得臨床醫生制定診療策略時流程復雜。目前針對TB診斷方法的研究多數是比較TB患者和健康個體之間的結果,而比較TB和其他感染個體之間的研究仍較少,可提供臨床鑒別診斷的經驗不足。臨床中,脊柱感染的原因多種多樣,有效區分STB和非結核脊柱感染尤為重要。目前,針對T-SPOT.TB在鑒別STB和非結核脊柱感染能力方面的數據極其有限,鮮有報道分析T-SPOT.TB在非結核脊柱感染中的陽性情況。因此,本研究統計T-SPOT.TB在STB與非結核脊柱感染中的靈敏度和特異度,分析T-SPOT.TB在STB與非結核脊柱感染鑒別診斷中的診斷效率,評價優化后的T-SPOT.TB指標的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2010年1月—2019年5月某院收治住院的脊柱感染患者臨床特征、臨床癥狀和血清學檢測結果等數據。本研究取得該院倫理委員會批準,所有入選研究對象及其家屬均被告知,且簽署書面知情同意書。

1.2 納入標準 (1)術中脊柱受累病灶區可獲得組織標本用于病理學和病原學檢查,后者進行細菌培養或病原菌聚合酶鏈反應(PCR)檢測;(2)病理學檢查提示脊柱感染;(3)無嚴重的基礎疾病或人類免疫缺陷病毒感染;(4)至少維持3個月隨訪。

1.2.1 STB組納入標準 根據2021年WHO TB指南,本研究中診斷STB的標準為:(1)結核分枝桿菌培養陽性;(2)Xpert陽性;(3)TB高發地區的患者符合相應的組織學檢查特征(至少包含干酪性壞死、肉芽腫性炎、抗酸染色陽性三個特點之一)且抗結核治療有效;(4)第二代基因檢測技術在患者病灶標本中檢出結核分枝桿菌基因。

1.2.2 非STB組納入標準 (1)組織標本病原菌培養或PCR檢測結果提示除結核分枝桿菌外的其他病原菌感染;(2)病理學檢查提示化膿性炎癥;(3)肺部CT未見結核征象,痰結核分枝桿菌培養陰性。

1.3 T-SPOT.TB檢測 試劑盒購自英國Oxford Immunotec公司,嚴格按照試劑盒的標準操作程序進行操作。采集肝素抗凝外周血5 mL,分離外周血單個核細胞(PBMCs),洗滌后對細胞計數,制備成濃度為2.5×105/mL的PBMCs細胞懸液;將ESAT-6、CFP-10及100 μL的2.5×105/mL的PBMCs置入培養板抗體反應孔內,37℃、5%CO2溫箱培養18 h。次日洗滌培養板后置入二抗,孵育1 h,洗滌培養板,底物置入后采用顯色液孵育5 min,蒸餾水終止反應,記錄斑點形成細胞數。每個斑點表示1個效應T淋巴細胞,從而計算出抗原特異度細胞的頻率。(1)T-SPOT.TB 結果應包含陽性對照情況,陰性對照情況,A孔(ESAT-6)結果(A孔斑點數-陰性對照孔斑點數),B孔(CFP-10)結果(B孔斑點數-陰性對照孔斑點數)。(2)陽性:若陰性對照孔斑點數為0～5個,測試孔(ESAT-6或CFP-10)斑點數減去陰性對照孔斑點數≥6個;或者當陰性對照孔斑點數≥6個,測試孔斑點數≥2倍陰性對照孔斑點數。(3)陰性:如果上述標準不符合且陽性對照孔正常。(4)結果不確定:如果陰性對照孔斑點數>10個或陽性對照孔斑點數<20個。當結果不確定時,抽取血標本重新檢測。

1.4 統計分析 所有統計分析和作圖均應用R4.3.0軟件,分類變量采用計數(百分比)進行統計描述,組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法;連續變量采用QQ圖和直方圖判斷正態性后,均為非正態分布變量,使用中位數(25百分位,75百分位)[M(P25,P75)]進行描述,組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。單因素logistic回歸通過“rms”包實現,并提取每個變量單因素logistic回歸的OR值、P值和95%置信區間(CI)?；煜仃囃ㄟ^“caret”包繪制并計算靈敏度、特異度、陰性預測值、陽性預測值、陰性似然比、陽性似然比和準確度及95%CI。相關性熱圖通過“corrmorant”包和“ggplot2”包進行可視化。受試者工作特征(ROC)曲線通過“pROC”包計算并通過“ggplot2”包進行繪制。

2 結果

2.1 患者特征 共納入132例脊柱感染患者,其中78例確診為STB(STB組),54例診斷為非結核脊柱感染(非STB組)。STB組與非STB組患者年齡、性別、病變節段、白細胞計數(WBC)、C反應蛋白(CRP)及結核抗體兩組間比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。非STB組患者降鈣素原(PCT)陽性率(31.48% VS 10.26%,P=0.005)、紅細胞沉降率(ESR)值均高于STB組[88.5(57, 115.5)mm/h VS 60.5(38.25, 90.25)mm/h,P=0.010]。STB組與非STB組患者ESAT6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6的特異性斑點數量兩組間比較,差異均具有統計學意義(均P<0.01)。見表1。

2.2 研究指標診斷STB的logistic回歸分析 單因素二分類logistic回歸分析結果顯示,T-SPOT.TB檢測在STB與非結核脊柱感染的鑒別診斷中具有較高的預測價值(OR=4.188,95%CI:1.847～9.974,P<0.001),PCT、CRP、ESR可能是鑒別診斷STB的指標(均P<0.05);性別、年齡、WBC、結核抗體及病變節段在兩者鑒別診斷中預測價值均不明顯(均P>0.05)。見表2。此外,ESAT-6、CFP-10以及CFP-10+ESAT-6的特異性點數在單因素logistic回歸中均具有統計學差異(均P<0.001),這三個指標對于鑒別診斷STB具有潛在應用前景。

表2 研究指標診斷STB的單因素二元logistic回歸分析

2.3 T-SPOT.TB在STB和非STB鑒別診斷的性能優化 ESAT-6、CFP-10及ESAT-6+CFP-10在STB和非STB組的表達量分布見圖1(a、b、c),圖1d展示了T-SPOT.TB 用于診斷STB與非STB的混淆矩陣。相關性統計結果顯示,ESAT-6與CFP-10具有較好的相關性(r=0.74,見圖1e)。通過繪制ROC曲線,確定ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6在STB和非STB鑒別診斷中的最佳截斷值,分別為12.5、19.5、36見圖2(a、b、c),各自的混淆矩陣見圖2(d、e、f),在STB中的AUC分別是0.765 6、0.741 5、0.778 6,均具有較好的診斷性能,其中以CFP-10+ESAT-6的AUC最高。

注:a為ESAT-6在STB和非STB的特異性斑點數量分布;b為CFP-10在STB和非STB的特異性斑點數量分布;c為ESAT-6+CFP-10在STB和非STB的特異性斑點數量分布;d為T-SPOT.TB用于診斷STB與非STB的混淆矩陣;e為納入研究STB患者各研究指標之間的相關性熱圖。

注:a為ESAT-6在STB診斷中的ROC曲線;b為CFP-10在STB診斷中的ROC曲線;c為ESAT-6+CFP-10在STB診斷中的ROC曲線;d為最佳截斷值下ESAT-6用于診斷STB與非STB的混淆矩陣;e為最佳截斷值下CFP-10用于診斷STB與非STB的混淆矩陣;f為ESAT-6+CFP-10的最佳截斷值用于診斷STB與非STB的混淆矩陣。

2.4 T-SPOT.TB檢測及最佳截斷值的診斷效能 T-SPOT.TB檢測在鑒別STB與非STB中的靈敏度為67.68%(95%CI:57.43%～76.53%),特異度為66.67%(95%CI:48.10%～81.45%),T-SPOT.TB陽性預測值為85.90%(95%CI:75.74%～92.41%),陰性預測值為40.74%(95%CI:27.86%～54.94%),陽性似然比為2.030(95%CI:1.230～3.352),陰性似然比為0.485(95%CI:0.354～0.664),準確度為67.42%。T-SPOT.TB檢測ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6最佳截斷值的診斷效能見表3。

表3 T-SPOT.TB最佳截斷值的ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6的診斷效能

3 討論

既往關于肺結核的發病機制、診斷和治療的研究很多,而EPTB至今仍處于相對被忽視的狀態[6]。很少有研究集中于脊柱感染的診斷,包括但不限于TB、布魯氏菌病、常見細菌感染(如葡萄球菌屬)的化膿性脊柱炎等。骨和關節結核如治療不當,將導致肢體畸形、活動受限,甚至截癱[7]。正確的藥物選擇(抗結核或抗菌藥物)對患者的治療效果至關重要。本研究根據細菌培養或病原菌基因檢測結果,將132例脊柱感染分為STB組和非STB組。在脊柱感染診斷中,比較T-SPOT.TB檢測與傳統的血清學試驗(如WBC、ESR、CRP、PCT和TB抗體等)結果,在脊柱感染的鑒別診斷中,ESR、CRP、PCT和TB抗體的特異度不佳;而T-SPOT.TB檢測在脊柱感染的鑒別診斷中,其診斷效果具有統計學意義(P<0.01)。

本研究中,T-SPOT.TB檢測的靈敏度為67.68%(95%CI:57.43%～76.53%),特異度為66.67%(95%CI:48.10%～81.45%)。靈敏度低于以往的報道,但特異度一致[8-13],可能是本研究執行了嚴格的納入和排除標準,同時一些診斷不明確的STB被排除,使得靈敏度相對降低。

研究[14]報道,重新評估T-SPOT.TB檢測的截斷值可能有助于其在肺結核或EPTB鑒別診斷中的作用。本研究分析T-SPOT.TB檢測的斑點數量分類,STB組與非STB組患者的ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6的特異性斑點數量比較,差異均具有統計意義(均P<0.001);在單因素logistic回歸分析中,ESAT-6、CFP-10、CFP-10+ESAT-6均具有較高的預測價值(均OR>1,P<0.001),且當CFP-10+ESAT-6的斑點數超過36這個截斷值時,在鑒別STB與非結核脊柱感染中具有較強的診斷效能。

作為在致病性結核分枝桿菌中廣泛存在的蛋白,ESAT-6廣泛應用于TB的診斷;CFP-10常被IFN-γ識別,具有較強的特異性。本研究中,優化后的ESAT-6、CFP-10分別用于STB及非STB的診斷,其靈敏度及準確度均高于T-SPOT.TB,診斷效能有所提升。同時,在研究中對CFP-10聯合ESAT-6進行了優化診斷效能分析,靈敏度(67.68%～83.82%)和準確度(67.42%～75.56%)明顯提高,但特異度的提高卻不明顯(62.32%～67.19%)。特異度水平較低可能是由于脊柱感染中存在少數非結核分枝桿菌,如堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、轉黃分枝桿菌和胃分枝桿菌,T-SPOT.TB不能區分以上幾種非結核分枝桿菌感染所致。

臨床實踐中,T-SPOT.TB作為一種常用的TB診斷方法,在STB診斷中的應用價值仍有待提高。本研究中,優化后的T-SPOT.TB診斷性能明顯提高,對STB與非STB的診斷有重要意義,具有一定的臨床應用價值。

T-SPOT.TB和Xpert MTB/RIF檢測具有較高的靈敏度和特異度。T-SPOT.TB檢測診斷活動性結核的靈敏度為75.3%～93.6%,特異度為63.4%～85.2%[8-14]。Tang等[7]對Xpert MTB/RIF的研究表明,Xpert MTB/RIF試驗在診斷STB方面的靈敏度為70.9%,特異度為100%。Xpert MTB/RIF檢測和T-SPOT.TB檢測是WHO認可的可用于肺部和肺外TB的診斷方法[1, 15]。在國內,T-SPOT.TB檢測比Xpert MTB/RIF檢測成本更低、更普及[16],因此T-SPOT.TB檢測更具良好的臨床運用前景,且T-SPOT.TB作為TB早期診斷的工具,僅需外周血即可完成檢驗,成本較低,能夠廣泛篩選疾病發生情況。

本研究探討了T-SPOT.TB檢測在STB鑒別診斷中的應用。盡管研究結果顯示T-SPOT.TB在區分STB與非STB方面表現出相對較高的診斷效能,但也存在一些局限性,這些局限性需要在進一步研究中予以克服和深入探討。(1)本研究的樣本規模相對較小,僅包括132例患者?？赡軐е陆Y果的偏差和不穩定性,因此需要更大規模的研究來驗證本研究的發現。(2)本研究采用回顧性研究設計,存在無法控制患者的選擇及信息完整性的問題,可能存在信息偏差的風險。(3)本研究僅關注了T-SPOT.TB在STB鑒別診斷中的性能,沒有涵蓋其他可能影響結果的因素,如臨床癥狀、影像學表現等。未來的研究可考慮將T-SPOT.TB與其他診斷方法進行比較,以更全面地評估其在STB診斷中的價值。(4)本研究僅考慮了特定地理區域的患者,可能存在地域性差異及結果外推受限。(5)雖然本研究發現,CFP-10+ESAT-6特異性斑點數對于STB的診斷性能更佳,但仍需要更多的研究來確認其作為診斷STB的可靠性。因此,需要進一步的前瞻性研究來驗證本研究結論,以便更全面地了解T-SPOT.TB在STB鑒別診斷中的潛在局限性和優勢。

本研究表明,T-SPOT.TB檢測在區分STB和非STB中具有較高的診斷效能。在脊柱感染患者中T-SPOT.TB陽性,特別是當CFP-10+ESAT-6的斑點數超過36時,診斷為STB的可能性大。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。