基于低壓靜電場及高通量測序技術對中華管鞭蝦(Solenocera crassicornis)保鮮過程中微生物群落影響分析*

沐楠智 謝 超① 吳玉婷 周卓穎 張海玲

(1. 浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室 浙江海洋大學食品與藥學學院 浙江舟山 316022; 2. 舟山匯豐冷藏物流發展有限公司 浙江舟山 316002)

中華管鞭蝦(Solenoceracrassicornis)隸屬于甲殼綱(Crustacea), 真軟甲亞綱(Eumalacostraca), 十足目(Decapoda), 管鞭蝦科(Solenoceridae), 管鞭蝦屬(Solenocera), 是我國重要的水產養殖種類, 因通體呈紅色又稱紅蝦, 甲殼薄且光滑, 觸角鞭呈管狀, 主要分布于我國東南海。中華管鞭蝦含有多種人體必需氨基酸的高蛋白低脂肉類, 且富含鎂、碘、磷和鈣等礦物質, 具有較高營養價值(李志鵬, 2022)。新鮮蝦肉含水量較高且質地柔軟, 容易受微生物污染從而發生腐敗變質, 影響蝦肉感官品質(崔蓬勃等, 2022),研究其貯藏和運輸過程中的保鮮及維持其優良品質的加工工藝, 具有較好的理論意義和生產方面的重要實際應用價值。但傳統純培養技術獲取微生物量低,細菌總數無法準確地表達微生物對水產品腐敗變質的影響, 不足以深入探討樣本微生物多樣性及群落結構。因此需引用基于16S rRNA 的現代分子生物學技術的高通量測序技術準確測定水產品微生物群落組成成分變化。研究發現, 捕獲和貯運過程中水產品初始微生物種群的豐度較低、多樣性高, 在一定的貯藏環境中, 小部分優勢菌群表達出對水產品極高的致腐能力, 導致水產品質變。低溫貯藏水產品中常見的腐敗微生物有假單胞菌屬(Pseudomonas)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和沙雷氏菌(Serratia)等(王航, 2016), 原料來源、種類和貯藏條件等因素均能影響水產品中的菌屬組成(藍蔚青等, 2020)。

電場保鮮是一種電場對食品非熱加工的保鮮技術, 分為高壓靜電場技術(HVEF)和低壓靜電場技術(LVEF)。HVEF 電場場強高于2 500 V/m, LVEF 電場場強低于2 500 V/m。電場保鮮技術可以影響到細胞膜電位效用, 使細胞膜電位發生變化, 進而影響到生物體的生化反應(丹陽等, 2004)。根據不同輸出模式分為靜電場、交變電場、脈沖電場和感應電場, 該技術最早應用于果蔬保鮮, 能夠影響果蔬的冰溫點, 減緩其成熟過程中乙烯產生量, 延緩水產品和肉制品的腐敗變質速率。內源性酶對冷藏過程中水產品的品質有重要影響, 改變鮮度和促進微生物生長(章騫等,2021)。低壓靜電場可以與細胞內水分子產生共振, 改變水分子與酶的結合狀態, 進而影響到酶活性; 高壓靜電場能夠使空氣產生微量臭氧和負離子, 這些物質作用于果蔬可以抑制其呼吸。電場處理能夠降低微生物細胞表面的平整度, 使細胞生物膜喪失活性, 從而抑制微生物生長繁殖(段偉文, 2019)。低壓靜電場能減緩蛋白質的降解, 較好地維持蝦肉原本的口感,抑制蝦肉中腐敗微生物的生成, 延長對蝦的貨架期(張珊等, 2020)。

水產品貯藏后期的關鍵腐敗菌群僅有少數幾種(Nianetal, 2022), 而諸如Quantitative Real-time PCR等常規鑒定方法在檢測過程中受多重因素干擾, 在判定中極易出現偏差。如希瓦氏菌屬和嗜冷桿菌屬等少數優勢腐敗菌, 僅憑傳統方法難以對其群落結構加以全面分析(Zhuangetal, 2023)。高通量測序技術具有低成本、高通量和高準確度優勢, 可以對樣品中的微生物菌群分布加以準確反映, 并完成對微生物基因的序列測定, 能夠更加精準和全面鑒定樣品中微生物的單一或全面基因組, 因此已成為當前研究微生物多樣性及群落結構差異的重要技術手段, 在多學科領域均有所應用。本文基于高通量測序技術,通過檢測中華管鞭蝦在電場結合微凍貯藏過程中微生物菌落種群組成成分及豐度的變化情況, 旨在研究電場對微凍蝦肉微生物的影響, 深入探討影響其保鮮效果的微生物群落組成及發育基礎信息, 對中華管鞭蝦資源的合理開發和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以采購自浙江省舟山市沈家門漁港的新鮮中華管鞭蝦(Solenoceracrassicornis)作為原材料, 實驗蝦體長約10～12 cm, 體重約12～15 g。購買以后置于含冰袋的泡沫箱, 在30 min 內運送至實驗室。選取體況健康且規格相近的個體用于實驗, 蒸餾水沖洗后以無菌棉擦拭表面水分, 平均分為7 組: 分組為新鮮樣本(G0), 2 kV、3 kV 及對照組貯藏中期(G1、G2、G3), 2 kV、3 kV、對照組貯藏末期(G4、G5、G6)。

1.2 實驗試劑

實驗所需主要試劑包括DNA 提取試劑盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit) (上海賽百盛公司)、TransStart Fastpfu DNA Polymerase (TransGen AP221-02) (北京全式金生物公司)、AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)。

1.3 主要儀器設備

試驗所需主要儀器設備包括微量檢測儀Microplate Reader (美國MD 公司)、QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega 公司)、ICS-1600 型離子色譜儀 (美國戴安公司)、MiSeq PE300 測序平臺(美國Illumina 公司)、GeneAmp? 9700 型PCR 儀(美國ABI 公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品預處理 將各組樣品清水洗凈后, 在干凈無菌操作臺上瀝干水分, 將貯藏25 d 的3 組蝦肉和新鮮蝦肉剪碎, 各組稱取0.5 g 樣品進行破碎處理,37 °C 培養箱中放置48 h。取各組貯藏樣品及新鮮樣品進行基于細菌16S rRNA 高通量測序, 對中華管鞭蝦微生物群落進行提取分析。

1.4.2 DNA 提取 將采集的各組樣品(新鮮樣本及2 kV、3 kV、對照組貯藏中期和貯藏末期)進行0.22 μm 濾膜真空抽濾, 參照DNA 提取試劑盒說明書提取中華管鞭蝦蝦肉中微生物中總基因組DNA, 用1%體積分數瓊脂糖凝膠電泳檢測分析DNA 完整度,采用Microplate Reader 微量檢測儀來檢測提取所得DNA 的質量純度, 并將合格的基因組DNA 保存于-80 °C 儲存備用。采用細菌16S rRNA 基因V3-V4區進行PCR 擴增, 測試區域為338F_806R, 細菌引物為338F (5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和806R (5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)。

1.4.3 PCR 擴增 根據張欣等(2017)的方法進行PCR 擴增, 采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase,20 μL 反應體系進行PCR 試驗, 5×FastPfu buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, 正向與反向引物各0.8 μL,濃度均為5 μmol/L, TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.4 μL, DNA 模板2 μL, ddH2O 補充至20 μL, 27 個循環, 72 °C 10 min。每個樣本3 個重復, 2%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物混合物, 使用AxyDNA 凝膠回收試劑盒回收所得PCR 產物, 使用Tris-HCl 對其進行洗脫。

1.4.4 Miseq 文庫構建及測序 采用Illumina MiSeq PE300 測序平臺高通量并行對核酸片段進行深度測序。采用可逆性末端邊合成邊測序反應, 首先在DNA片段兩端加上序列已知的通用接頭構建文庫, 每條片段經過橋式PCR 擴增形成一簇, 在堿基延伸過程中每個循環反應只能延伸一個正確互補的堿基, 經過多個循環后完整讀取核酸序列。將PCR 產物用QuantiFluor?-ST 藍色熒光系統進行檢測定量, 根據每個樣本的測序量標準混合。由上海美吉生物醫藥科技有限公司協助完成后續檢測。

1.4.5 數據處理 本實驗的理化數據處理采用SPSS 22.0, 采用Origin 9.0 作圖, 實驗結果顯示為平均值±標準差, 采用Duncan 模型進行比較檢驗, 得出顯著性差異。高通量測序部分實驗使用fastp 軟件對原始序列加以質控, 采用FLASH 軟件進行拼接,根據97%相似度對序列進行OTU 聚類, 并對嵌合體加以剔除。逐條對序列進行物種分類注釋, 比對Silva 16S rRNA 數據庫, 將比對閾值設置為70%。

2 結果與討論

2.1 樣品測序信息分析

采用高通量測序技術對不同貯藏環境不同貯藏時期的7 個蝦肉樣本的16S rRNA 基因區進行微生物多樣性檢測分析, 獲得細菌總優化序列325 540, 堿基平均長度428 bp (表1)。OTU (operational taxonomic units)是在系統發生學或群體遺傳學研究中人為地給分類單元(品系、屬、種等)設置的標志(徐國棟等,2023)。通常在97%的相似水平下的OTU 進行生物信息統計分析, 相似度在95%以下則可以判定為不同菌屬(許小璐, 2021)。結合表2 的OTU 序列數統計表和表3 的OTU 分類學信息表來看, 在-5 °C 微凍貯藏條件下電場組與對照組蝦肉中微生物群落均為細菌。蝦肉的蛋白質和水分含量高, 細菌的快速生長繁殖是蝦肉腐敗變質的主要因素, 但細菌總數無法準確地表達微生物對水產品腐敗變質地影響, 需進一步測定水產品微生物群落組成成分變化。

表1 不同電場強度處理下中華管鞭蝦序列數據統計Tab.1 Statistics of S. crassicornis sequence data under different electric field intensities

表2 主要OTU 序列數統計表Tab.2 Statistics of main OTU sequences

表3 主要OTU 分類學信息表Tab.3 Taxonomic information of main OTU

從門水平來看, 優勢菌群為變形桿菌門(Proteobacteria)和厚壁菌(Firmicutes); 從綱水平來看,優勢菌群為芽孢桿菌綱(Bacill)和丙種球蛋白菌綱(Gammaproteobacteria); 從目水平來看可知交替單胞菌目(Alteromonadales)和乳桿菌目(Lactobacillales)為優勢菌群, 同時蝦肉中還有少部分假單胞菌目(Pseudomonadales)和芽孢桿菌目(Bacillales); 從科角度可以看出假單胞菌科(Pseudoalteromonad)和李斯特菌科(Listeriaceae)在菌群中具有一定優勢, 同時蝦肉中還存在莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)。該試驗中屬水平有假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和熱殺索絲菌屬(Brochothrix)等。

2.2 物種韋恩圖分析

物種韋恩圖中不同圓圈代表不同樣本, 圓圈重疊處標定數字表示樣本間共有的物種數。圖1 為2 kV組、3 kV 組和對照組貯藏15 d 和25 d 時屬水平下的物種韋恩圖, 由圖1 可得出, 與對照組相比, 電場組可有效的保持物種個數, 隨著貯藏時間的延長, 3 組物種個數均有不同程度的減少, 隨著優勢菌的生長繁殖, 在貯藏末期, 蝦肉微生物物種多樣性不斷下降;在貯藏中期G2 物種個數最多, G1 次之, 隨著蛋白質分解和水分流失G3 微生物群落中優勢菌大量生長,其他菌種生長空間減少, 導致物種多樣性快速下降;貯藏末期G4、G5 和G6 3 組物種個數相近, 此時優勢菌在三種貯藏環境中均顯示出明顯的優勢。綜上, 貯藏前中期電場能夠抑制優勢菌的生長, 維持蝦肉微生物物種間的平衡, 使腐敗微生物的生長受到阻礙,延緩了蝦肉的腐敗進程, 且3 kV 的抑菌效果較為明顯, 貯藏末期時由于蝦肉腐敗嚴重, 蝦肉微生物物種大量減少, 優勢菌更能適應腐敗環境, 電場對物種多樣性的影響不大。施加電場對蝦肉的前中期貯藏有積極的促進作用, 防止了腐敗微生物優勢的形成, 保護了蝦肉前中期的外觀狀態。

圖1 貯藏中期和貯藏末期微生物物種韋恩圖Fig.1 Venn diagram of microbial species in the middle and end storage

2.3 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性分析中Sobs 指數代表檢測到的物種數; Ace 和Chao 指數均表明物種豐度, 且數值越大表明物種種類越多; Shannon 和Simpson 指數表明物種的豐富度和均勻程度; Coverage 指數可表明低豐度OTU 的覆蓋情況, 其數值越接近于1 表明菌群測序覆蓋率越高, 越能較好地進行菌落多樣性分析(張溪,2021)。從表4 中7 個樣本的五類指數可以得出, 7 個樣本菌群測序覆蓋率均＞0.999, 測序深度適宜, 可滿足對蝦肉物種多樣性的分析。對于Sobs、Chao、Ace指數, 電場組均大于對照組, 且前中期 3 kV 組與2 kV 組相比較, 3 kV 組物種豐度和物種種類高于2 kV 組, 末期電場組物種豐度和物種種類也略高于末期對照組。對于Simson 指數, 除新鮮樣本外的6組數值相近, 蝦肉微生物各物種個體數目分布均勻度一致, 對于Shannon 指數。說明貯藏前中期微凍結合電場抑制了一些非嗜冷菌的生長, 同時延緩了優勢菌的大量生長繁殖, 維持蝦肉中的微生物種類多樣性穩定性, 在貯藏末期電場組與對照組相差不大,說明電場在貯藏末期對物種多樣性影響較小, 這與上述物種韋恩圖結果一致。微凍結合3 kV 電場在蝦肉貯藏過程中更能較好維持微生物物種多樣性, 減緩腐敗優勢菌的快速生長。

表4 多樣性指數分析表Tab.4 Analysis of diversity index

稀釋性曲線用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度, 同時說明樣本的測序數據量是否合理(程依夢, 2022)。由圖2 中稀釋曲線圖可以得出, 當樣本序列超過30 000 時, 各組的曲線趨向平坦, 這即說明該測序的數據量是在合理范圍內, 如果再添加更多數據則產生的新物種數量極少。對于G0 和G2樣品, 抽樣數＜10 000 時, 樣本所檢測出的OTU 數量隨抽樣數的增加而快速上升, 抽樣數＞10 000 后,OTU 數量的上升較為則緩慢且曲線逐漸趨于平坦,同時G0 和G2 變化趨勢相近, 說明前中期3 kV 的電場能夠維持微生物物種平衡, 蝦肉得到較好的貯藏。Rank-Abundance 曲線可以表明物種的豐富度和均勻度(樊英等, 2021), 物種多樣性越高曲線下降越平滑,優勢菌群所占比例較高時, 曲線會呈現陡然下降的趨勢。由圖2 中Rank 曲線可得, G0 和G2 橫軸上最長, 下降平緩, 物種組成較為均勻, 其他幾組下降曲線陡峭程度相近?？赡苁且驗橘A藏初期蝦肉腐敗變質較輕, 生化環境較為穩定, 蝦肉中有較多的菌種生長繁殖, 電場釋放電荷影響微生物表面生物膜穩定性從而抑制微生物正常生長代謝(沈俊等, 2022)。

圖2 Alpha 指數稀釋曲線和Rank-Abundance 曲線Fig.2 Alpha index dilution curve and Rank-Abundance curve

2.4 物種組成分析

由圖3 可以得出, 新鮮蝦肉中微生物群落結構豐度最高的為假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和熱殺索絲菌屬(Brochothrix),且三者占比相近, 在-5 °C 微凍貯藏環境中, 中華管鞭蝦蝦肉中的優勢微生物變為假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas), 而貯藏中后期6 個樣本假交替單胞菌占比微生物群落結構超過了85%, 可能是蝦肉在貯藏過程中蛋白質解構, 水分遷移, 鹽類物質大量析出, 假交替單胞菌屬更能適應此時的溫度和生化環境,分解蝦肉蛋白質和脂肪, 并產生大量揮發性物質, 從而造成感官評分的下降(Broekaertetal, 2017); Li 等(2022)在對太平洋白蝦貯藏過程腐敗菌生長的研究中也得出相似結論。如圖4 所示, 選擇所有樣本中豐度排名前10 物種。圖中左半圓表示分組, 右半圓表示物種。從物種到分組連線的寬度表示分組中物種的相對豐度。左半圓的外環, 顏色表示分組; 右半圓的外環,顏色表示物種, 環的長度表示物種的豐度(史恬恬等,2022), 共線性關系圖可以更直觀地觀察物種豐度和數值占比。本文研究表明, 在貯藏中期施加電場后能夠抑制假交替單胞菌成為絕對的優勢菌群, 而3 kV 的抑制效果優于2 kV 組, 然而在貯藏后期, 隨著蝦肉的進一步腐敗變質, 3 組菌群中熱殺索絲菌屬(Brochothrix)和肉食桿菌屬(Carnobacterium)占比有所增加, 3 kV 組與2 kV 組增加較少, 對照組增加最為劇烈, 可能是長期的貯藏過程中蝦肉腐敗環境發生變化, 有利于其生長, 貯藏后期電場強度對微生物種群多樣性影響不大,但可能抑制了熱殺索絲菌屬的生長。

圖3 微生物群落結構圖Fig.3 Structure of microbial community

圖4 共線性關系圖Fig.4 Collinearity diagram

2.5 Beta 多樣性分析

β 多樣性作為可反映各組樣本間群落物種組成差異的指數, 一般由PCA 和PCoA 分析圖來展示。PCA分析(principal component analysis), 即主成分分析對數據進行簡化分析后找出數據中最具優勢性的關健因素及其結構。樣本物種組成的相似度高低反映了其在PCA 圖中距離的近與遠, 點越接近, 其菌群組成就越相似(史恬恬等, 2022)。數據顯示貯藏中期G1 和G2 樣本間也具有較大差異, 不同電場強度導致物種組成也有較大影響, 由圖5 的PCA 圖可得, 而G3、G4、G5、G6 間差距小說明在貯藏中期電場對微生物菌群具有一定影響, 并且電場強度的大小對微生物菌群生長的抑制程度不同, 貯藏末期電場強度對樣本物種分布無明顯影響。PCoA 分析(principal coordinates analysis)研究樣本群落組成的差異性, 在這點與PCA 分析類似; 但它們的主要區別在于PCoA 基于所選距離矩陣進行作圖, 而PCA 是基于歐氏距離利用物種豐度表直接作圖。因此相較于PCA 圖, PCoA圖更能反映7 個樣本間的區別。由圖5 的PCoA 分析圖可得, 貯藏中期的G1、G2、G3 組有一定距離且較為接近, 貯藏末期的G4、G5、G6 組較為接近, 說明在同一貯藏期間的幾組微生物種群結構相近, 除此之外, 可以看出在坐標系中貯藏中期的3 組相較于貯藏末期的3 組更為分散, 說明在貯藏中期電場強度對微生物種群的影響較大, 而貯藏末期貯藏時間對種群影響度較大。

圖5 PCA 主成分分析和PCoA 主成分分析圖Fig.5 PCA principal component analysis and PCoA principal component analysis diagram

3 結論

本研究采用高通量測序技術對不同貯藏時期各組蝦肉微生物群落堿基進行基因測序, 產生的堿基序列通過OTU 聚類、多樣性分析、相關性分析等手段分析, 得到微生物發育信息和群落組成變化規律,研究不同電場環境(2 kV、3 kV、0 kV)對蝦肉微生物群落組成的影響, 結論如下:

(1) OTU 分析中屬類有假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和熱殺索絲菌屬(Brochothrix)等。根據菌屬相對豐度結果, 蝦肉在貯藏過程中蛋白質解構, 水分遷移, 鹽類物質大量析出, 假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)更能適應高鹽濃度環境, 分解蝦肉蛋白質和脂肪并產生大量揮發性物質造成感官評分的下降, 是中華管鞭蝦微生物腐敗主要致腐菌。隨著貯藏時間的延長, 3 組物種個數均有不同程度的減少, 隨著優勢菌的生長繁殖, 蝦肉微生物物種多樣性不斷下降; 在貯藏中期3 kV 組物種個數最多,2 kV 組次之, 對照組中優勢菌大量生長, 減少其他菌種生長資源與空間, 導致物種多樣性快速下降; 貯藏末期3 組物種個數相近, 此時優勢菌在三種貯藏環境中均顯示出明顯的優勢。綜上, 貯藏前中期電場能夠抑制優勢菌的生長, 使得蝦肉微生物物種多樣性較高, 且3 kV 更佳, 貯藏末期3 組物種結構相近, 電場對物種多樣性的影響不大。

(2) PCoA 主成分分析圖中發現, 在坐標系中貯藏中期的G1、G2、G3 組距離較為接近, 貯藏末期的G4、G5、G6 組距離較為接近, 說明在同一貯藏期間的各組微生物種群結構類似。綜上, 貯藏前中期電場能夠抑制優勢菌的生長, 使得蝦肉微生物物種多樣性較高, 且3 kV 更佳, 貯藏末期時電場對物種多樣性的影響不大。