胰島素對昆蟲病原線蟲卡森斯氏線蟲0657L生長發育及其共生細菌伯氏致病桿菌0657L的影響

李茜童, 陳 紅, 王興鐸, 錢秀娟

(甘肅農業大學植物保護學院, 甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室, 蘭州 730070)

近年來,全球氣候變暖、產業結構調整、耕作制度變革、外來生物入侵等因素導致我國農業害蟲發生危害依然嚴重,害蟲綠色防控仍然是現代農業發展中的重要環節(蕭玉濤等, 2019; 陸宴輝等, 2023)。生物防治的應用和推廣是踐行綠色環保理念,維持生態平衡,促進可持續發展的重要手段,其中昆蟲病原線蟲(etomopathogenic nematodes, EPNs)是備受重視的一種生防因子,在農林牧草隱蔽性害蟲的生防領域占據關鍵地位(楊麗元, 2020)。昆蟲病原線蟲是一種寄生性線蟲,能夠感染并殺死多種寄主昆蟲,據統計對350種以上的害蟲具有控制效能,以斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis為主(王杰等, 2021;Zhangetal., 2021)。昆蟲病原線蟲能夠自主搜尋并進入合適的宿主昆蟲體內,破壞寄主的免疫反應,并有效地繁殖子代,子代繼續感染新的寄主昆蟲(Heryantoetal., 2022)。且由于昆蟲病原線蟲生命周期短,易于低成本大量人工培養繁殖,已經被廣泛用于害蟲生物防治,可與低毒農藥結合使用控制破壞性的農業害蟲,主要用于難以防治的鉆蛀性害蟲和地下害蟲幼蟲的防治(謝欽銘和張選輝, 2002; 曹翠玲等, 2009; 朱小芳等, 2021)。

昆蟲病原線蟲共生細菌隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)革蘭氏陰性菌(錢秀娟, 2014),與昆蟲病原線蟲互惠互利,二者共同起到致死寄主昆蟲的效果,斯氏屬和異小桿屬線蟲分別與致病桿菌屬Xenorhabdus和發光桿菌屬Photorhabdus細菌共生(王杰等, 2021)。昆蟲病原線蟲致死寄主昆蟲時,侵染期幼蟲(infective juveniles, IJs)經口、肛門及體壁進入寄主昆蟲體內,向寄主昆蟲血腔釋放腸道內攜帶的共生細菌,共生細菌大量繁殖并與昆蟲病原線蟲形成一個復合體打破寄主的生理平衡,在24～48 h內致死寄主(叢斌等, 2000; 方香玲等, 2008; 王立婷等, 2013; 詹發強等, 2015; 顏珣和韓日疇, 2016)。在整個侵染過程中,線蟲為共生細菌提供生長繁殖的環境,共生細菌為昆蟲病原線蟲提供營養成分并產生毒素抑菌物,且為昆蟲病原線蟲的繁殖提供良好的環境條件。但線蟲與細菌的共生關系也有選擇性,每種昆蟲病原線蟲只能以與它共生的細菌培養,而特定的共生細菌也只能培養產生它的線蟲(顏珣和韓日疇, 2016; 張潘杰等, 2021)。近期研究表明,嗜菌異小桿線蟲Heterorhabditisbacteriophora對共生細菌的專一性較斯氏線蟲更嚴格,不同種斯氏線蟲可以被同種共生細菌培養,而嗜菌異小桿線蟲則不可以(李茜童等, 2022)。

昆蟲病原線蟲作為生物防治因子,存貯和運輸是其商品制劑開發中最大的障礙,在生產實際應用時其防效主要局限于線蟲制劑的貨架期(Georgisetal., 2006)。因此,為使昆蟲病原線蟲適應環境中復雜的生物和非生物因素影響并延長其制劑貨架期,利用內源或外源化合物的補充延長壽命、提高存活率及增強致病力尤為重要(錢秀娟等, 2019)。胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖和精氨酸等的誘發而分泌的蛋白質類激素(彭竹清和郝友進, 2019),研究表明,控制胰島素信號通路對昆蟲及昆蟲病原線蟲同科生物秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans的抵抗衰老,增強線蟲的抗應激能力,延長線蟲壽命,改善健康水平等方面具有重要的調控作用(李慧萍和韓日疇, 2007; 謝鵬飛等, 2018; 況琪斐等, 2021)。線蟲與共生細菌在致死寄主昆蟲的過程中均起到重要作用,胰島素對共生細菌生長發育及線蟲-共生細菌復合體的作用如何,目前報道尚少,因此研究胰島素對昆蟲病原線蟲及其共生細菌的影響具有理論意義,同時對延長昆蟲病原線蟲制劑貨架期及昆蟲病原線蟲在農業生產中充分發揮更廣泛的應用潛力具有實踐意義(Luetal., 2016)。

本研究以從甘肅地區篩選的抗旱性品系卡森斯氏線蟲Steinernemakraussei0657L為材料,將不同濃度胰島素滴加到共生細菌伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovenii0657L的單菌落,觀測菌落生長情況,測定其培養線蟲壽命及運動和吞咽能力的方法,明確胰島素的補充對昆蟲病原線蟲及其共生細菌生長發育的影響,以闡明胰島素與昆蟲病原線蟲及其共生細菌的關系,為昆蟲病原線蟲的壽命延長研究、制劑化生產及防效的提高提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與線蟲

大蠟螟Galleriamellonella由甘肅農業大學植物保護學院甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室提供,實驗用大蠟螟3齡幼蟲經滯育處理,以防止吐絲、化蛹。采用對蠐螬、韭蛆及模式昆蟲大蠟螟致病力及生物學特性較好的昆蟲病原線蟲卡森斯氏線蟲0657L,均由大蠟螟老熟幼蟲培養、繁殖,懸浮液貯存于4 ℃備用。

1.2 試劑與器材

胰島素母液(1 mL pH 2鹽酸溶液加入1 mg胰島素干粉,胰島素干粉購于生工生物工程上海股份有限公司,純度>95%);蒸餾水;75%酒精;林格氏液(蒸餾水1 000 mL,氯化鈉8.6 g,氯化0.3 g,氯化鈣0.28 g)。NBTB培養基:無菌水1 000 mL,瓊脂15 g,LB瓊脂預混干粉40 g,溴百里酚藍0.01 g,搖勻,121 ℃,1 240 Pa滅菌20 min。LB培養基:營養肉湯8 g,瓊脂15 g,酵母粉5 g,六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O) 2 g,蒸餾水900 mL,搖勻,121 ℃,1 240 Pa滅菌20 min。玉米糖漿7 mL,玉米胚芽油4 mL,蒸餾水89 mL,混合均勻,加入無菌的培養液中。TSY液體培養基:胰蛋白胨大豆肉湯40 g/L,酵母提取物5 g/L。

體視顯微鏡(Stemi 305,德國Zeiss公司),高壓滅菌鍋(GI54DWS,致微儀器有限公司),超凈工作臺(HCB-1300V,青島海爾生物醫療股份有限公司),二氧化碳光照培養箱(SPX-250-GB-CO2,上海躍進器械醫療有限公司),冰箱(BCD-656 WDPT,青島海爾股份有限公司),超純水儀(GWB-2,北京普析通用儀器有限責任公司),電子天平(ER-180,AND),玻璃棒,酒精燈,9 cm培養皿,3.5 cm培養皿,移液槍,圓形濾紙,剪刀,接種環,封口膜,脫脂棉等。

1.3 卡森斯氏線蟲0657L侵染大蠟螟后共生細菌的分離、純化和鑒定

將經過75%酒精體表消毒的大蠟螟3齡幼蟲(生理活性基本一致)各5頭置于墊有兩層無菌濾紙的培養皿中,吸取1.5 mL 3 000頭/mL的卡森斯氏線蟲0657L懸浮液侵染大蠟螟,25 ℃培養24 h后將大蠟螟第1對胸足末端剪破,從蟲體尾部向前按壓至被共生細菌侵染的大蠟螟的血液從傷口處滴落在NBTB培養基上。用接菌環蘸取大蠟螟體液劃Z字型后密封培養基,置于25 ℃培養箱中,待菌體長出,吸收培養基中溴百里酚藍染料且菌體呈綠色的則確定為昆蟲病原線蟲共生細菌(楊亞賢等, 2023)。將單菌落轉移至新的NBTB平板培養基上,繼續劃線進行共生細菌的二次純化,以此重復,直到培養純化出均勻的單菌落。挑取其中的初生型單菌落轉移至LB平板培養基,在25 ℃培養箱中培養72 h后將共生細菌單菌落挑取至TSY培養基中,在28 ℃ 180 r/min搖床中培養48 h,得到共生細菌發酵液,4 ℃保存備用。經課題組鑒定,卡森斯氏線蟲0657L的共生細菌為伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovenii0657L(張文德等, 2023)。在LB培養基上接種上述純化的共生細菌伯氏致病桿菌0657L作為卡森斯氏線蟲0657L的食物, 25 ℃恒溫培養。

1.4 胰島素對卡森斯氏線蟲0657L壽命、運動能力和吞咽能力的影響的測定

在光學顯微鏡下將卡森斯氏線蟲0657L懷卵大母蟲挑至新的用劃線法培養有伯氏致病桿菌0657L的LB培養基中,子代產出后將大母蟲挑走,子代繼續置于25 ℃中培養。為了抑制卡森斯氏線蟲0657L產卵,子代幼蟲期的第0-5天LB中含5 μmol/L五氟尿嘧啶,待卡森斯氏線蟲0657L生長至第6天時轉至普通的LB上,此時的線蟲生長至同一生長時期J3。挑取NBTB培養基上菌落大小一致(挑取的菌量也基本一致)的伯氏致病桿菌0657L單菌落至直徑3.5 cm的LB培養基上,隨機分為8組,隨后每個單菌落立即分別滴加10 μL胰島素母液與林格氏液體積比為1∶500和1∶5 000及林格氏液(現配現用),另設1組不加胰島素和林格氏液的空白對照,處理后每24 h在體視顯微鏡下用十字交叉法測量菌落直徑1次并記錄,計算1～6 d時伯氏致病桿菌0657L的生長速率,生長速率(%)=(Dt-Dt-1)/t×100(D為共生細菌單菌落直徑;t為時間,單位d)。將同期化J3卡森斯氏線蟲0657L轉移到上述胰島素處理48 h時的伯氏致病桿菌0657L的LB上培養,此時記為實驗第0天。為保證食物充足和藥物濃度,每3 d將卡森斯氏線蟲0657L轉移至新的接有胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L的LB上,每天監測卡森斯氏線蟲0657L的存活情況,直至所有卡森斯氏線蟲0657L死亡(卡森斯氏線蟲0657L對鉑絲的輕微機械觸碰無反應即視為死亡),記錄存活時間,計算壽命和存活率。每組至少3個重復,每個重復30條線蟲。

隨機選取胰島素處理3 d(3齡幼蟲), 7 d(4齡幼蟲)和11 d(成蟲)時的卡森斯氏線蟲0657L挑取至未培養伯氏致病桿菌0657L的空白LB培養基上,使其在自由運動過程中除掉蟲身黏附的共生細菌后,記錄30 s內卡森斯氏線蟲0657L頭部來回擺動的次數(即為衡量卡森斯氏線蟲0657L運動能力的標準),從一側擺動到另一側再擺回來視為1次。每組至少5條線蟲,每條線蟲統計至少統計3次,取其平均值作為最終結果。隨機選取胰島素處理3 d(3齡幼蟲), 7 d(4齡幼蟲)和11 d(成蟲)時的卡森斯氏線蟲0657L,直接在卡森斯氏線蟲0657L生長培養基上對其30 s內吞咽次數進行統計,用鉑絲輕輕觸碰卡森斯氏線蟲0657L,觀察并記錄卡森斯氏線蟲0657L咽部中食道球前后抽動次數。每組至少5條卡森斯氏線蟲0657L。每條卡森斯氏線蟲0657L至少統計3次,取其平均值作為最終結果。

1.5 數據分析

卡森斯氏線蟲0657L壽命數據采用long rank test統計方法,伯氏致病桿菌0657L菌落直徑和生長速率以及卡森斯氏線蟲0657L運動和吞咽數據采用LSD多重比較法進行差異顯著性分析,所用分析及作圖軟件包括Excle 2016, SPSS 19.0和Origin 2021等。

2 結果

2.1 胰島素對病原線蟲卡森斯氏線蟲0657L共生細菌伯氏致病桿菌0657L菌落直徑的影響

1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理0～1 d時伯氏致病桿菌0657L生長較慢,所有單菌落均未長出; 2～6 d時,與空白對照組(CK)相比,1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理組伯氏致病桿菌0657L菌落直徑顯著增大(P<0.05),且低濃度(1∶5 000)胰島素處理組菌落直徑與高濃度(1∶500)濃度胰島素處理組相比促進作用更明顯,但二者之間沒有顯著差異(P>0.05)。在整個觀察時間段內,除1 d時各處理組未生長外, 2～6 d時, 1∶5 000濃度胰島素下, 菌落直徑分別為2.89, 3.68, 4.06, 4.52和4.85 mm, 較空白對照組分別增大77.2%, 27.6%, 19.8%, 19.5%和17.6%; 與空白對照組相比, 1∶500濃度胰島素處理組菌落直徑分別增大54.0%, 20.1%, 14.2%, 15.1%和14.9%(圖1, 2)。

圖1 1∶500和1∶5 000濃度胰島素下伯氏致病桿菌0657L培養3 d時的單菌落形態

圖2 1∶500和1∶5 000濃度胰島素下伯氏致病桿菌 0657L菌落直徑

2.2 胰島素對伯氏致病桿菌0657L生長速率的影響

根據伯氏致病桿菌0657L的生長速率繪制曲線圖(圖3),伯氏致病桿菌0657L的生長速率在整個實驗周期內呈現由快至慢的趨勢,符合邏輯斯蒂生長曲線。1～2 d時,由于菌落生長緩慢,顯微鏡下觀察不到明顯菌落,即為延緩期;2～3 d時,菌落快速生長,即為對數生長期,共生細菌生長速度最快;1∶500和1∶5 000胰島素處理組共生細菌生長速率較空白對照組(CK)和林格氏液組顯著(P<0.05)加快,分別由空白對照組的68.0 μm/d提高至104.7和120.4 μm/d。1∶500胰島素處理組較空白對照組和林格氏液組分別加快36.7和30.6 μm/d,1∶5 000濃度下,較空白對照組和林格氏液組分別加快52.5和46.4 μm/d,但高濃度(1∶500)處理組與低濃度(1∶5 000)處理組之間無顯著差異(P>0.05)。3～7 d時,菌落的生長速率明顯變慢, 后逐漸趨于平穩, 即為穩定期。

圖3 1∶500和1∶5 000濃度胰島素下伯氏致病桿菌 0657L生長速率

2.3 胰島素對卡森斯氏線蟲 0657L壽命的影響

結果表明(圖4),取食不同濃度胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L可以延長自然狀態下卡森斯氏線蟲0657L壽命。與空白對照組(CK)相比,取食1∶5 000 胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲 0657L的平均壽命由11.0 d延長至14.0 d, 延長了27.3%, 1∶500濃度胰島素處理組較1∶5 000處理組的效果更好,卡森斯氏線蟲0657L平均壽命為16.0 d,延長了45.5%。綜上所述,不同濃度胰島素均可以延長卡森斯氏線蟲0657L壽命,但兩處理濃度胰島素處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖4 取食1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理 48 h時的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L的壽命

2.4 胰島素對卡森斯氏線蟲0657L運動能力的影響

結果如圖5所示,與空白對照組(CK)相比,卡森斯氏線蟲0657L在3齡幼蟲期(胰島素處理3 d時),胰島素的補充可顯著加快卡森斯氏線蟲0657L的每30 s頭部擺動次數,取食1∶5 000和1∶500胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L頭部擺動頻率由28.4次/30 s分別加快到44.4次/30 s和49.6次/30 s,分別顯著提高了56.3%和74.7%(P<0.05)?？ㄉ故暇€蟲0657L在4齡幼蟲期(胰島素處理7 d時),與空白對照組相比,取食高濃度(1∶500)胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L頭部擺動頻率為57.2次/30 s,顯著提高了47.4%(P<0.05);而取食低濃度(1∶5 000)胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲0657L頭部擺動頻率無顯著差異(P>0.05)。而在卡森斯氏線蟲0657L生命的后期成蟲期(胰島素處理11 d時),運動能力較3齡幼蟲略強,較4齡幼蟲期略弱,但與空白對照組相比,不同濃度的胰島素加入對線蟲的運動能力均有所提高,但并無顯著差異(P>0.05)。綜上所述,胰島素的補充有助于卡森斯氏線蟲0657L抵御運動能力的衰退,且不同濃度處理組的效果也不同,高濃度對線蟲運動能力衰退的延緩作用更強。

圖5 取食1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理48 h時的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲 0657L的每30 s頭部擺動次數

2.5 胰島素對卡森斯氏線蟲0657L吞咽能力的影響

結果顯示(圖6),胰島素的補充在卡森斯氏線蟲0657L 3齡幼蟲期(胰島素處理3 d時)、4齡幼蟲期(胰島素處理7 d時)和成蟲期(胰島素處理11 d時)均可顯著提高卡森斯氏線蟲0657L的吞咽能力。與空白對照組(CK)相比,3齡幼蟲期時,取食1∶5 000和1∶500胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L后,卡森斯氏線蟲0657L吞咽頻率由11.0次/30 s分別提高到16.6次/30 s和18.2次/30 s,分別顯著提高了50.9%和65.5%(P<0.05);4齡幼蟲期時吞咽頻率由14.2 次/30 s分別提高到18.0 次/30 s和19.2次/30 s,分別顯著提高了26.8%和35.2%(P<0.05);11 d時吞咽頻率由11.8次/30 s分別提高到14.6次/30 s和15.0次/30 s,分別顯著提高了23.7%和21.1%(P<0.05)。而且同運動能力一樣,成蟲期較3齡幼蟲期略強,較4齡幼蟲期略弱。綜上所述, 胰島素能夠提高卡森斯氏線蟲0657L吞咽頻率, 且不同濃度處理組促進作用略有差異, 高濃度較低濃度對吞咽能力的促進作用更明顯。

圖6 取食1∶500和1∶5 000濃度胰島素處理48 h時的伯氏致病桿菌0657L后卡森斯氏線蟲 0657L的每30 s吞咽次數

3 討論與結論

昆蟲病原線蟲進入昆蟲體內后,將其攜帶的共生細菌釋放于寄主昆蟲的血淋巴中,共生細菌迅速繁殖產生殺蟲毒素,昆蟲病原線蟲自身分泌的毒素結合共生細菌產生的活性物質分解寄主昆蟲組織,使寄主昆蟲在短時間內患敗血癥死亡(王大業, 2020)。目前已經有對昆蟲病原線蟲共生細菌的殺蟲蛋白和共生菌代謝產物開發的研究,結果表明,共生細菌具有殺蟲活性主要是其代謝產物中的血腔活性物質起作用(彭劉亮, 2017),包括抑菌活性物質(黃武仁等, 2005; Fangetal., 2011; Binda-Rossettietal., 2016)、殺蟲毒素(Bowenetal., 1998; Sheetsetal., 2011; Yangetal., 2012)、抗癌活性物質(Paiketal., 2001)等,在目前的相關研究中,昆蟲病原線蟲共生細菌常被用作生物制劑應用于害蟲生物防治及生態環保領域。本研究結果表明,共生細菌作為昆蟲病原線蟲在寄主昆蟲體內生長繁殖的重要介體,其生長發育可以受胰島素的調控,共生細菌可以直接吸收利用胰島素。本研究結果將在利用昆蟲病原線蟲共生細菌及其代謝產物提高對害蟲的致病力方面提供新思路(吳文丹等, 2014; 王杰等, 2021),而對于共生細菌的具體殺蟲機制以及能否利用胰島素提高共生細菌代謝產物活性,尤其是血腔活性物質的活性,進而改善昆蟲病原線蟲共生細菌的殺蟲效果等問題還尚不明確,這也將成為未來新的研究方向。

本研究結果表明,一定濃度胰島素處理會促進共生細菌伯氏致病桿菌0657L菌落的生長(圖1, 2),不同濃度的胰島素對伯氏致病桿菌0657L生長速率的提高程度不同,低濃度胰島素(1∶5 000)較高濃度胰島素處理(1∶500)生長快(圖3)。而有趣的是,高濃度胰島素(1∶500)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L運動和吞咽能力均強于低濃度胰島素(1∶5 000)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L(圖5, 6)。在實驗數據上表現為促進共生細菌生長速率加快的最佳濃度為1∶5 000,而促進線蟲行為學能力增強的最佳濃度是1∶500。這表明,胰島素對卡森斯氏線蟲0657L生長發育及其體內分離出的共生細菌伯氏致病桿菌0657L的生長都有影響,但可能因為細菌和線蟲的生長繁殖方式不同,對胰島素的吸收和利用的方式也不同,因此共生細菌在形態學上表現出低濃度胰島素處理下直徑更大,而被取食后,仍然為高濃度更有利于線蟲抵抗運動和吞咽能力衰退,這就與營養成分利用有關,具體機理還有待進一步考究。

胰島素作為一種內分泌激素,與細胞生長、壽命、營養、生殖有關,還可促進蛋白質合成及脂肪儲存,防止脂肪分解等。胰島素在機體中的功能表現在多個方面,涉及受體結合,信號傳導系統和缺陷的糾正等,進食和禁食期間能量的儲存和釋放,基本由胰島素調控,是生物體生存的重要方面(Mayeretal., 2007; 顧世紅和陳建國, 2009; Thevisetal., 2010)。胰島素、胰島素樣生長因子(insulin growth factor, IGF)和胰島素樣肽(insulin-like peptide, ILP)通常與維持葡萄糖穩態有關,當機體內胰島素分泌不足時,來自食物的糖分就只流動在血液中,無法進入細胞為機體所用,此時胰島素的補充能夠幫助食物中的糖分順利進入機體內各組織細胞以提供能量(顧世紅和陳建國, 2009),這種功能在昆蟲(果蠅)和秀麗隱桿線蟲中是保守的(Thevisetal., 2010; Graham and Pick, 2017),此外,胰島素在代謝、生長、繁殖、成蟲健康和衰老方面也發揮著重要作用(Hafen, 2004)。胰島素信號通路是高度保守的衰老調控通路,包括Ins R/IRS-1通路和RAS/MAPK通路(Beale, 2013)。其中IRS-1可通過PI3K/Akt通路起到促進胰島素影響葡萄糖代謝與脂質代謝的作用,該通路中胰島素受體同源蛋白daf-16受基因daf-2負調控(張思雨等, 2022)。本研究發現,胰島素處理在明顯促進卡森斯氏線蟲0657L共生細菌的生長的同時,有延長昆蟲病原線蟲壽命、抵御運動和吞咽能力衰退作用。這可以說明昆蟲病原線蟲作為共生細菌的攜帶者,能夠通過胰島素處理的特異性共生細菌間接地影響昆蟲病原線蟲體內新陳代謝信號的傳導(共生細菌吸收胰島素后長勢更佳,為昆蟲病原線蟲提供穩定的生活環境和豐富的營養物質,其中蛋白質、脂類及少量糖類參與其體內細胞膜的組成,細胞膜完整保證了細胞的正常能量和物質交流),從而起到抗衰老的作用,初步揭示了胰島素在昆蟲病原線蟲及其共生細菌生長發育中的作用。

研究表明,壽命的延長通常是與飲食限制(dietary restriction, DR)和熱量限制(caloric restriction, CR)有關的,且飲食限制誘導的壽命延長的其中一個關鍵通路是IIS(胰島素/胰島素樣生長因子1)信號傳導(N?ssel and Vanden, 2016)。在本研究中,吞咽試驗為直接在線蟲生長培養基上統計中食道球抽動次數,即線蟲正常取食,說明并未造成飲食限制(即饑餓),而已有報道線蟲(秀麗隱桿線蟲)可在多種不同飲食限制方案下主要通過激活LET-363/mTOR和IIS兩個營養物傳感途徑延長壽命(Greer and Brunet, 2009),結合上述證據,可推斷胰島素能夠延長昆蟲病原線蟲的壽命,且排除胰島素對卡森斯氏線蟲0657L壽命的延長作用是由飲食限制引起的可能性,這與人類醫學模式生物秀麗隱桿線蟲C.elegans的壽命研究結果并不完全吻合。鑒于本研究中線蟲攝食正常但最終得到壽命延長的結論,初步猜想是某些酶通過IIS通路中的靶標基因(如UTX-1)調控壽命(Greer and Brunet, 2009),共生細菌吸收胰島素后為卡森斯氏線蟲0657L提供豐富的營養成分,線蟲充分利用營養物質至體內蛋白(酶)合成達到平衡時,相應靶標基因所在的信號通路關閉,基因表達量降低,衰老相關細胞功能維持穩態,壽命得以延長。這也恰好說明,壽命不僅在遺傳水平上被調控,而且與新陳代謝調節和營養物質也密切相關。

研究使用胰島素處理的共生細菌培養卡森斯氏線蟲0657L,發現線蟲生長早期,頭部擺動次數和吞咽次數均較慢,生命中期,其頭部擺動頻率和咽泵吞咽頻率均提高,直到生命后期又有一定程度的下降,說明線蟲的衰老隨著生命過程而發生,主要體現在運動和吞咽能力上。運動和吞咽與肌肉功能息息相關(Dall and F?rgeman, 2019; 劉嘉榆, 2022),3個不同生長階段中的胰島素處理組運動和吞咽能力均較對照組強,表明胰島素可以提高線蟲的肌肉功能,起到有效抵抗衰老的作用。

綜上所述,胰島素的補充可以促進昆蟲病原線蟲共生細菌的生長,能夠延長昆蟲病原線蟲的平均壽命并提高運動和吞咽能力。本研究僅證實了胰島素在線蟲生物學特征方面的作用,為昆蟲病原線蟲的制劑化提供了新的思路,也為昆蟲病原線蟲在生物防治領域的進一步高效開發利用提供了理論基礎。為明確其作為調控機體代謝的重要物質在表觀遺傳學上是否也具有類似的作用,具體的作用機制如何,還需通過分子生物學技術手段的進一步探究。