西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、時空表達譜及抗體制備

葉亞萍, 劉治灘, 李琪明, 臧 賀,2,3, 馮佩林, 王 寧,王 杰, 黃枳腱, 陳大福,2,3,*, 郭 睿,2,3,*

(1. 福建農林大學蜂學與生物醫藥學院, 福州 350002; 2. 天然生物毒素國家地方聯合工程實驗室, 福州 350002;3. 福建省蜂療研究所, 福州 350002; 4. 四川省農業農村廳畜牧總站, 成都 610041)

Argonaute (AGO)家族在模式植物擬南芥Arabidopsisthaliana中被首次發現(Bohmertetal., 1998),是一類在進化上高度保守的蛋白家族,雖然不同物種含有的AGO蛋白數量存在較大差異,但不同的AGO蛋白都包含N末端、PAZ結構域、MID結構域和PIWI結構域(Vaucheret, 2009; Poterala and Rzeszowska-wolny, 2016; Xuetal., 2016)。Wang等(2013)在家蠶Bombyxmori中鑒定到4個AGO蛋白(BmAgo1, BmAgo2, BmAgo3和BmPiwi)及其編碼基因,進一步分析發現BmAgo1,BmAgo2和BmAgo3在家蠶的不同組織與發育階段均有表達,而BmPiwi主要在精原細胞中表達,當受到家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染后上述4個基因在家蠶體內均被激活表達。AGO蛋白在小RNA誘導的基因沉默過程中發揮關鍵功能,如miRNA通過結合AGO被整合進miRNA誘導沉默復合體(miRNA-induced silencing complex, miRISC),進而識別靶mRNA的3′UTR上的同源靶位點切割靶mRNA或抑制其翻譯(Bartel, 2004)。miRISC通常能夠保護miRNA免受核酸酶的降解,但當miRISC配對到一些特殊的靶RNA時可觸發靶標降解(Shietal., 2020)。

相比于智人Homosapiens(Sheu-Gruttadauria and Macrae, 2018)和擬南芥(Oliver and Martinez and Martinez, 2022)等模式生物,昆蟲AGO蛋白的研究較為滯后。有研究表明AGO在昆蟲的蛋白翻譯、生長發育及免疫應答(van Rjjetal., 2006; Iwasaki and Tomari, 2009)等生物學過程中發揮重要功能。例如, van Rjj等(2006)曾通過RNAi沉默黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RSCI)中的催化組分ago-2的編碼基因,發現沉默ago-2基因后宿主對果蠅C病毒(DrosophilaC virus, DCV)感染的敏感程度遠高于正常果蠅,說明RISC活性在果蠅的抗病毒免疫防御中起到核心作用;王艷麗等(2016)通過注射dsRNA沉默飛蝗LocustamoratoriaAGO1基因的表達,發現飛蝗的生長發育和存活率均受到顯著影響;Karamipour等(2019)發現銀紋夜蛾多核多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)感染草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaSf9細胞后,Ago1的表達量顯著升高,然而當相應dsRNA轉染Sf9細胞沉默Ago1后,病毒DNA的復制能力增強,說明Ago1潛在參與宿主的侵染應答。

此前,在西方蜜蜂Apismellifera中已鑒定到3種AGO基因,其中AmAGO1(GenBank登錄號: LOC552062)和AmAGO2(GenBank登錄號: LOC411577)編碼的蛋白屬于AGO蛋白亞家族,而AmAGO3(GenBank登錄號: LOC725111)編碼的蛋白屬于PIWI蛋白亞家族。目前,關于蜜蜂AGO蛋白的研究還十分有限。廖珍(2009)克隆到意大利蜜蜂A.melliferaligusticapiwi-like-1蛋白基因Am-ago3的全長序列,并通過測定表達譜發現Am-ago3在雄蜂中的表達量顯著高于工蜂中的表達量;Zhao等(2019)曾對意大利蜜蜂和狄斯瓦螨Varroadestructor之間的相互作用進行研究,發現AGO2的表達量在狄斯瓦螨寄生2 d后顯著上升達到峰值,且與抗菌肽基因AMP及轉錄因子Dorsal的表達趨勢相同,表明AGO2可能發揮了類似于抗菌肽或轉錄因子的作用。目前,GenBank數據庫收錄了西方蜜蜂的AGO1基因(AmAGO1)的預測序列,但AmAGO1的分子克隆和功能研究仍然缺失。因此,通過預測AmAGO1的理化性質和分子特性,測定AmAGO1在西方蜜蜂中的時空表達譜及制備AmAGO1的多克隆抗體,可為深入開展AmAGO1的功能與機制研究提供參考和基礎。本研究對AmAGO1的編碼序列(coding sequence, CDS)進行分子克隆,利用生物信息學解析AmAGO1蛋白的理化性質和分子特性,構建原核表達質粒并誘導表達AmAGO1融合蛋白,進而制備AmAGO1的多克隆抗體,并通過ELISA, Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)分別檢測抗體效價、靈敏度和特異性,旨在豐富AmAGO1的基本信息,為進一步開展AmAGO1的功能和機制研究提供了參考和基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

西方蜜蜂工蜂卵、3日齡幼蟲、7日齡預蛹、8日齡預蛹、12日齡蛹以及1, 2, 6, 12, 15和18日齡成蟲均取自福建農林大學蜂學與生物醫藥學院教學蜂場的飼養蜂群。

1.2 AmAGO1基因CDS區的PCR擴增、TA克隆及Sanger測序

利用RNA提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術有限公司,北京)提取西方蜜蜂工蜂6日齡幼蟲(n=3)腸道總RNA,再利用Hifair?AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (上海翌圣生物科技有限公司,上海)進行反轉錄得到cDNA模板。根據NCBI數據庫中收錄的西方蜜蜂AmAGO1(GenBank登錄號: LOC552062) CDS區核苷酸序列,利用Primer Premier 5軟件(Singhetal., 1998)設計特異性擴增引物(TA-AGO1-F: 5′-TGCTCGACTATTTTA CATA-3′; TA-AGO1-R: 5′-TTTGTATCAATTGCATG TG-3′)。使用高保真酶PCR Mix (擎科生物技術有限公司,北京)進行PCR擴增,反應在梯度PCR儀(Bio-Rad公司,美國)上進行,反應體系(20 μL): PCR mix 10 μL, 無菌水 7 μL, 上下游引物(2.5 pmol/μL)各1 μL, cDNA模板1 μL。反應程序: 95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 共34個循環。產物經1.8%的瓊脂糖凝膠電泳后再紫外凝膠成像儀(上海培清科技有限公司,上海)下觀察。參照郭意龍等(2022)的方法,利用FastPure?Gel DNA Extraction Mini Kit (諾唯贊生物科技股份有限公司,南京)回收目的片段,連接產物轉化大腸桿菌Escherichiacoli感受態細胞DH5α (上海唯地生物技術有限公司,上海),涂板后培養過夜,次日挑取單菌落于LB液體培養基(氨芐抗性)振蕩培養12 h,取少量菌液進行PCR鑒定,結果陽性的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行Sanger測序。

1.3 AmAGO1蛋白的生物信息學分析

利用Expasy網站(https:∥www.expasy.org/)上的Protparam, ProtScale, SignalP 4.1 Server, NetPhos 3.1 Server和SMART等軟件(Letunicetal., 2012; Duvaudetal., 2021)預測和分析AmAGO1編碼蛋白的磷酸化位點、親水性、信號肽、二級結構、三級結構和結構域。在NCBI (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中下載智人、黑腹果蠅、家蠶、西方蜜蜂、東方蜜蜂A.ceranacerana、歐洲熊蜂Bombusterrestris和斑馬魚Daniorerio的AGO1蛋白氨基酸序列,使用MEGA7.0軟件(Kumaretal., 2016)進行多重序列比對,進而采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建系統進化樹,進行3次重復,其余參數為軟件默認。

1.4 AmAGO1的時空表達譜檢測

利用Primer Premier 5軟件設計AmAGO1的qPCR引物(AmAGO1-F: 5′-CAAGTTCTTCTGTTGG AGCA-3′, AmAGO1-R: 5′-AGGTTGAGGAGGAGTGT GTG-3′)。參照吳鷹等(2023)的方法,收集剛出房的西方蜜蜂工蜂成蟲置于冰上麻醉,利用干凈的眼科鑷和眼科剪在超凈工作臺上小心剖取觸角、咽下腺、腦、表皮、中腸、脂肪體和毒腺等組織,3次生物學重復,每次生物學重復含3頭工蜂成蟲。分別提取上述7種組織,工蜂卵、3日齡幼蟲、7日齡預蛹、8日齡預蛹和12日齡蛹,以及1, 2, 6, 12, 15和18日齡工蜂成蟲的總RNA,作為模板進行反轉錄,得到的cDNA作為模板進行qPCR以檢測AmAGO1的時空表達譜。反應體系和程序均按照吳鷹等(2023)的報道設置。每個反應進行3次技術重復和3次平行重復。

1.5 原核表達載體構建

鑒于AmAGO1的核苷酸序列較長,因此選擇AmAGO1的部分片段進行原核表達載體構建。利用DNASTAR軟件(Burland, 1999)中的protean工具對AmAGO1的氨基酸序列進行分析,選取抗原指數較高、親水性較強及表面可及性較強的區域進行擴增。利用Primer Premier 5軟件設計上述區域的上下游引物并在上下游引物的5′端分別添加NcoⅠ和XhoⅠ的酶切位點及保護堿基,引物分別命名為AGO1-F(5′-CATGCCATGGGCTTAGACATTCGAGAT ATAG-3′)和AGO1-R(5′-CCGCTCGAGTTGAACGTA TGAATCATTA-3′)。按照1.2節的方法設置反應體系并進行PCR擴增,反應程序: 94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸10 min, 共30個循環。同樣按照1.2節的方法進行擴增片段的回收、TA克隆及Sanger測序。

將測序正確的菌液轉接至新鮮LB培養基(氨芐抗性),繼續震蕩培養。利用FastPure Plasmid Mini Kit (諾唯贊生物科技股份有限公司,南京)提取質粒,再使用NcoⅠ和XhoⅠ(TaKaRa,日本)對提取的pESI-T-AmAGO1質粒和pET-28a載體(索萊寶生物科技有限公司,北京)進行雙酶切。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收,再將回收片段與酶切后的pET-28a載體混合后進行連接反應。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞后進行涂板、挑斑及測序。將測序結果正確的菌液進行擴增,提取質粒后轉化Transetta (DE3)感受態細胞(全式金生物技術有限公司,北京),同時轉化未插入片段的空載pET-28a質粒作為對照,轉化產物復蘇后涂板于LB固體培養基(卡那霉素抗性),挑斑后搖菌過夜。將菌液加入50%甘油后保存于-80 ℃超低溫冰箱(Sanyo公司,日本)備用。

1.6 AmAGO1融合蛋白的原核表達

1.6.1蛋白小量表達和驗證:取50 μL 1.5節保存的菌液加入到2 mL LB液體培養基(卡那霉素抗性),37 ℃,200 r/min搖菌。待菌液的OD值達到0.6左右后加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG) (索萊寶生物科技有限公司,北京),使其終濃度達到1 mmol/L。繼續搖菌8 h后12 000 r/min 4 ℃離心,加入20 μL 5×蛋白上樣緩沖液以及80 μL PBS緩沖液重懸沉淀,100 ℃孵育5 min,12 000 r/min 4 ℃離心5 min后取上清進行SDS-PAGE電泳檢測。由于構建的pET-28a-AmAGO1質粒蛋白C端帶有6×His標簽,因此通過Western blot對融合蛋白進行檢測,采用鼠Anti-His Mouse多克隆抗體(博奧森生物技術有限公司,北京)作為一抗,使用HRP標記的兔抗鼠單克隆抗體(博奧森生物技術有限公司,北京)作為二抗,ECL顯色后進行曝光觀察。

1.6.2IPTG最佳濃度篩選:分別取50 μL保存的菌液,加入到5管2 mL LB液體培養基(卡那霉素抗性),在菌液OD值達到0.6左右時加入IPTG進行誘導表達,使其終濃度分別達到0.1, 0.2, 0.6, 1.0和2.0 mmol/L。按照1.6.1節的方法分別對誘導表達出的融合蛋白進行SDS-PAGE檢測。

1.6.3蛋白表達形式鑒定:取1 mL保存的菌液加入到50 mL LB液體培養基(卡那霉素抗性),按照1.6.1節的方法選取蛋白表達最高時的IPTG濃度進行蛋白的誘導表達,24 h后8 000 r/min 4 ℃離心5 min,收集菌液沉淀,加入5 mL PBS緩沖液后使用超聲波細胞破碎儀(新芝生物科技有限公司,寧波)破碎菌體,程序設置為:超聲功率200 W,超聲2 s,間隔3 s,共20 min。破碎后的菌液轉移至離心管,8 000 r/min 4 ℃離心5 min以分離上清和沉淀,再通過SDS-PAGE鑒定融合蛋白的表達形式。

1.6.4蛋白大量表達與純化:按照1∶100的比例將保存的菌液加入到總共2 L的LB液體培養基(卡那霉素抗性),按照1.6.1節的方法進行誘導表達。搖菌完成后離心菌液,用裂解液(50 mmol/L Tris, 300 mmol/L NaCl, pH 8.0)重懸沉淀,加入苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)使其終濃度達到1 mmol/L,超聲波破碎菌體后離心收集包涵體。使用洗滌液(2 mol/L尿素, 50 mmol/L Tris, 300 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 8.0)進行洗滌包涵體1 h后離心收集沉淀,再用包涵體溶解液(8 mol/L 尿素, 50 mmol/L Tris, 300 mmol/L NaCl, pH 8.0)溶解包涵體2 h,離心收集上清,用0.45 μmol/L濾器進行過濾,參照楊付來等(2020)報道的方法進行蛋白純化。將純化過程中的上樣液、流穿液、洗雜液、不同咪唑濃度(50, 100, 200, 300和500 mmol/L)下的洗脫液進行SDS-PAGE以檢測蛋白純化效果。收集純化蛋白,使用透析膜進行梯度透析,然后使用PEG20000進一步濃縮。最后使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,上海)測定純化蛋白的濃度。

1.7 多克隆抗體制備

參照吳鷹等(2023)的方法,將1.6.4節純化后的AmAGO1蛋白作為抗原與等體積弗式完全佐劑(Sigma,美國)和不完全佐劑(Sigma,美國)混勻用于免疫2只新西蘭大白兔,第1, 21, 35和49天連續免疫5次;第42和56天進行耳靜脈采血后利用ELISA試劑盒(上海谷研實業有限公司,上海)檢測抗血清效價;待抗血清效價達到要求后,通過頸動脈采集全血離心后收集血清,隨后進行抗原親和純化,抗原包被量為2～5 μg/mL;再次利用ELISA試劑盒檢測抗體效價。

1.8 抗體檢測

1.8.1Western blot檢測靈敏度:收集重量約100 mg的西方蜜蜂工蜂6日齡幼蟲,液氮速凍后充分研磨,向粉末中加入1 mL蛋白提取液,冰上靜置30 min后14 000 r/min 4 ℃離心10 min,吸取上清(即幼蟲總蛋白);取40 μL上清,加入10 μL蛋白上樣緩沖液后100 ℃加熱5 min,12 000 r/min 4 ℃離心5 min,取20 μL進行SDS-PAGE,然后轉膜到0.45 μm的PVDF膜上,封閉液中封閉2 h后加入AmAGO1多克隆抗體(1∶1 000稀釋),孵育1 h,洗膜液洗膜3次,每次5 min;加入HRP標記的山羊抗兔2抗(1∶10 000稀釋),室溫孵育1 h,洗膜液洗膜3次,每次5 min;吸干PVDF膜表面多余液體,將事先混合好的ECL顯色液滴加到膜上,在利用GE AI600多功能成像儀(GE,美國)進行觀察和拍照,檢測抗體靈敏度。

1.8.2免疫沉淀檢測特異性:取50 μL Protein A/G磁珠(碧云天生物技術有限公司,上海),PBS緩沖液洗滌后在磁力架上放置1 min,吸取上清,重復2次;用20 μL PBS緩沖液重懸磁珠后加入到1 mL的1.8.1節西方蜜蜂工蜂幼蟲蛋白提取液中,室溫孵育1 h,在磁力架上放置5 min,收集上清;將上清分為2份,一份加入5 μg的AmAGO1多克隆抗體,另一份加入兔IgG抗體作為對照,4 ℃旋轉孵育過夜;次日向兩組中分別加入50 μL洗滌過的Protein A/G磁珠,室溫旋轉孵育2 h,離心后棄上清,加入1 mL PBS緩沖液重復洗滌5次;用100 μL PBS緩沖液重懸磁珠,加入蛋白上樣緩沖液后進行SDS-PAGE,轉膜后進行Western blot檢測,使用AmAGO1多克隆抗體作為一抗,HRP標記的山羊抗兔(生工生物工程(上海)股份有限公司,上海)作為二抗照,檢測抗體特異性。

1.9 數據分析

采用SPSS Statistics軟件對AmAGO1在不同組織和蟲態及工蜂不同日齡成蟲中的相對表達量進行單因素方差分析(ANOVA),以P<0.05為顯著性閾值,采用Tukey氏檢驗法和字母顯著標記法兩兩比較分析實驗數據。

2 結果

2.1 AmAGO1的CDS分子克隆和序列特征

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,通過PCR能夠擴增出單一且符合預期大小(2 884 bp)的片段,Sanger測序結果證實目的片段與GenBank數據庫收錄的AmAGO1(GenBank登錄號: LOC552062)序列完全一致,說明成功克隆到AmAGO1的CDS。生物信息學預測結果顯示,AmAGO1含928個氨基酸,分子式為C4624H7332N1316O1325S51,分子量約為104.2 kD,等電點為9.31;AmAGO1含35個絲氨酸磷酸化位點,10個酪氨酸磷酸化位點及41個蘇氨酸磷酸化位點;AmAGO1的平均親水系數為-0.2965,親水氨基酸數量多于疏水氨基酸;AmAGO1中不存在典型的信號肽;AmAGO1含302(32.54%)個α-螺旋,165條(17.78%)延長鏈, 54個(5.82%)β-轉角和407個(43.86%)無規則卷曲;AmAGO1含典型的PAZ結構域和PIWI結構域。

多重序列比對結果顯示(圖1),AmAGO1與東方蜜蜂、歐洲熊蜂、家蠶、腹黑果蠅、斑馬魚及智人的AGO1均具有較高的序列一致性。系統進化樹顯示(圖1),同為脊椎動物的智人和斑馬魚的AGO1聚為一支,同為無脊椎動物的西方蜜蜂、東方蜜蜂、家蠶和黑腹果蠅的AGO1聚為一支;西方蜜蜂與東方蜜蜂的AGO1蛋白同源性最高。

圖1 鄰接法構建的基于氨基酸序列的西方蜜蜂和其他6個物種的AGO1蛋白系統進化樹

2.2 AmAGO1的時空表達譜

RT-qPCR檢測結果顯示,AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼蟲、預蛹、蛹和成蟲等不同發育階段中均有表達,但表達量也存在差異;相較于AmAGO1在卵中的表達量,3日齡幼蟲和7日齡預蛹中AmAGO1的表達量顯著降低,而8日齡預蛹和12日齡蛹中AmAGO1的表達量顯著升高(P<0.05)(圖2: A);AmAGO1在西方蜜蜂1, 2, 6, 12, 15和18日齡工蜂成蟲體內也均有表達,但表達量也存在差異,相較于AmAGO1在1日齡成蟲體內的表達量, 2, 6, 12, 15和18日齡成蟲體內AmAGO1的表達量顯著降低(P<0.05)(圖2: B)。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂成蟲觸角等7種組織中均有表達但表達量存在差異,相較于AmAGO1在觸角中的表達量,AmAGO1在毒腺、腦、中腸、脂肪體和表皮中的表達量顯著降低(P<0.05),而AmAGO1在咽下腺中的表達量無顯著差異(P>0.05),表皮中AmAGO1的表達量最低(圖2: C)。

圖2 AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同發育階段(A, B)和成蟲不同組織(C)中的相對表達量

2.3 AmAGO1融合蛋白的誘導表達

SDS-PAGE結果顯示,加入IPTG后在Transetta細胞中成功誘導表達出大小符合預期(約20 kD)的目的蛋白(圖3: A),進一步利用6×His標簽的特異性抗體對誘導表達出的融合蛋白進行Western blot,可檢測到大小約20 kD的蛋白,說明成功誘導表達出AmAGO1融合蛋白(圖3: B)。

圖3 IPTG誘導重組質粒pET-28a-AmAGO1表達蛋白的 SDS-PAGE(A)和Western blot檢測(B)

分別使用不同IPTG濃度對重組質粒pET-28a-AmAGO1進行蛋白誘導表達,SDS-PAGE檢測結果顯示當IPTG濃度為0.1, 0.2, 0.6, 1和2 mmol/L時均能誘導蛋白表達,其中0.6 mmol/L時能誘導出更高的蛋白表達量(圖4)。

圖4 37 ℃條件下不同濃度IPTG誘導表達AmAGO1 的SDS-PAGE檢測

對菌液破碎離心后得到的上清液以及沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測,結果顯示在沉淀中檢測到明顯的目的條帶,而在上清中僅能檢測到微弱的目的條帶,說明誘導表達的蛋白為包涵體形式(圖5)。大量表達及純化得到純度較高的AmAGO1融合蛋白的濃度達到0.8 mg/mL(圖6)。

圖5 pET-28a-AmAGO1質粒誘導表達形式鑒定

圖6 純化的AmAGO1融合蛋白的SDS-PAGE檢測

2.4 AmAGO1多克隆抗體

ELISA檢測結果顯示AmAGO1多克隆抗體效價大于512 K,說明制備的抗體具有較高的效價和靈敏度。Western blot檢測結果顯示可以特異性檢測到AmAGO1蛋白(圖7: A),靈敏度高。免疫沉淀檢測結果顯示,AmAGO1多克隆抗體可以特異性富集AmAGO1蛋白,而兔IgG無法富集AmAGO1蛋白(圖7: B),表明制備的AmAGO1多克隆抗體具有較強的特異性。

圖7 免疫沉淀(IP)檢測AmAGO1多克隆抗體的特異性

3 討論

本研究首次克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS,為持續深入開展相關研究提供了序列基礎。生物信息學分析結果顯示AmAGO1含928個氨基酸,分子式為C4624H7332N1316O1325S51,分子量約為104.2 kD,等電點為9.31;親水性指數-0.2965,暗示其為親水性蛋白;AmAGO1含有典型的PAZ結構域和PIWI結構域,說明其屬于AGO蛋白家族;西方蜜蜂、東方蜜蜂、歐洲熊蜂、家蠶和黑腹果蠅的AGO1氨基酸序列相似度較高,且西方蜜蜂、東方蜜蜂、家蠶和黑腹果蠅的AGO1聚為一支(圖1),表明上述4種昆蟲的AGO1同源性較高;西方蜜蜂和東方蜜蜂的AGO1進化距離最近,符合二者互為姐妹種的客觀事實。以上結果為進一步探究AmAGO1的生物學功能提供了有價值的參考信息和理論依據。

AGO蛋白是昆蟲miRNA通路中的重要組成部分,AGO蛋白通過靶向泛素-蛋白酶體通路中的蛋白水解暴露miRNA進行降解,即能夠與miRNA形成靶向miRNA降解機制(target-directed miRNA degradation, TDMD),進而參與昆蟲體內的諸多生物學過程(Shietal., 2020)。本研究發現,AmAGO1在西方蜜蜂工蜂成蟲組織中均有表達(圖2: C),說明AmAGO1在西方蜜蜂體內廣泛分布和表達,暗示其功能的重要性。觸角是蜜蜂感知化學信號的主要器官,本研究發現AmAGO1在西方蜜蜂工蜂成蟲觸角中表達且表達量顯著高于毒腺、腦、中腸、脂肪體和表皮中的表達量,說明AmAGO1與西方蜜蜂工蜂的化學信號感知密切相關。蜜蜂咽下腺由兩條呈葡萄狀的腺泡組成,哺育蜂的咽下腺主要分泌蜂王漿哺育幼蟲,而采集蜂咽下腺行使加工碳水化合物代謝酶的功能(Corby-Harris and Snyder, 2018)。本研究中,剛出房的工蜂成蟲咽下腺中AmAGO1表達量顯著高于毒腺、腦、中腸、脂肪體和表皮中的表達量(圖2: C),推測AmAGO1參與蜂王漿的合成與分泌過程。蜜蜂中腸是消化食物、吸收營養和抵御病原入侵的重要器官(吳鷹等, 2023),本研究發現工蜂中腸中AmAGO1的表達量顯著高于毒腺、脂肪體和表皮中的表達量,暗示AmAGO1在西方蜜蜂工蜂的消化吸收和免疫防御中扮演重要角色。下一步擬通過對AmAGO1進行RNAi探究AmAGO1在西方蜜蜂工蜂化學信號感知、蜂王漿合成與分泌及消化吸收和免疫防御中的功能。

蜜蜂是一種完全變態昆蟲,其生活史歷經卵、幼蟲、預蛹、蛹和成蟲5個發育階段。本研究中,AmAGO1在工蜂卵、幼蟲、預蛹、蛹和成蟲中呈動態差異表達,說明AmAGO1在西方蜜蜂工蜂的變態發育過程中的各個階段持續發揮功能。此外,8日齡預蛹中AmAGO1的表達量顯著高于7日齡預蛹中的表達量(圖2: A),鑒于預蛹中組織器官發生劇烈的消解和重組,推測AmAGO1在此過程中發揮重要功能,值得進一步深入研究。王艷麗等(2016)研究發現,注射dsRNA干擾的飛蝗4齡若蟲AGO1后,待若蟲蛻皮至5齡期時發生大量死亡,說明AGO1與飛蝗的生長發育相關。本研究發現,AmAGO1在1, 2, 6, 12, 15和18日齡工蜂成蟲體內均有表達且總體表現為持續下降-上升-下降的表達趨勢(圖2: B),表明AmAGO1在西方蜜蜂成蟲發育過程中具有重要功能。在蜜蜂成蜂的發育過程中,6-16日齡的工蜂分泌腺十分發達,其中6-12日齡的工蜂上鄂腺十分發達,12日齡之后的工蜂蠟腺發達,負責制造大量巢脾(曾志將, 2003)。本研究中,AmAGO1在1日齡工蜂體內表達量最高,而在12日齡工蜂體內表達量最低(圖2: B),表明AmAGO1與西方蜜蜂工蜂出房、腺體變化、制造巢脾之間具有相關性。上述結果為西方蜜蜂工蜂變態發育過程中AmAGO1的功能研究的時間點選取提供了重要參考。

原核表達系統具有表達量高、成本較低和操作簡易等優點,是目前應用最為廣泛的蛋白表達系統之一(Fernández, 2004)。大腸桿菌細胞具有密碼子偏好性,因而含有較多稀有密碼子的基因在其中無法正常表達(Fernández, 2004)。由于Transetta (DE3)感受態細胞中含有大腸桿菌細胞缺乏的稀有密碼子對應的tRNA,理論上可用于外源基因的原核表達(Carmignotto and Azzoni, 2019)。本研究中,鑒于AmAGO1的核苷酸序列較長(約2 884 bp),我們首先對AmAGO1蛋白進行抗原表位分析,并結合親水性指數、抗原指數和表面可及性篩選出299～456個氨基酸區域用于構建原核表達載體。本研究成功構建含AmAGO1部分片段的pET-28a-AmAGO1重組質粒并轉化Transetta (DE3)感受態細胞,加入IPTG后可誘導表達出約20 kD的目的蛋白(圖3: A);進一利用6×His標簽的特異性抗體進行Western blot,可檢測到大小約20 kD的蛋白(圖3: B)。上述結果表明成功誘導表達出AmAGO1融合蛋白。這說明對于核苷酸序列較長的基因,篩選部分片段進行原核表達質粒構建是一種可行方法(Chenetal., 2005),本研究提供了又一例證。

利用原核表達系統表達外源蛋白,常由于蛋白合成速度過快而導致無法正確折疊,從而形成包涵體(Sánchezetal., 2022)。此外,由于大腸桿菌細胞無法像真核生物一樣對合成的蛋白進行糖基化和甲基化等修飾,進一步降低了蛋白的可溶性表達(Fernández, 2004)。有研究表明降低溫度可以提高原核表達過程中可溶性蛋白的含量(張磊等, 2021)。本研究嘗試在16 ℃進行融合蛋白的誘導表達,但發現目的蛋白仍然存在于包涵體?？紤]到本研究的主要目的是制備AmAGO1的多克隆抗體,故采用對包涵體蛋白進行復性的方法獲得目的蛋白。本研究在37 ℃條件下大量表達AmAGO1融合蛋白(圖4),進而使用高濃度尿素溶解包涵體蛋白(圖5),SDS-PAGE結果顯示純化蛋白較為清晰、濃度較高,可滿足抗體制備的需要(圖6)。ELISA試劑盒檢測結果顯示制備的AmAGO1多克隆抗體的效價大于512 K,說明該抗體具有較高的效價和靈敏度。Western blot檢測結果顯示上述抗體可以在西方蜜蜂工蜂幼蟲蛋白樣本中檢測到約100 kD的條帶(圖7: A),符合預期大小,說明制備的AmAGO1多克隆抗體特異性較好。IP技術的原理是通過抗原與抗體的結合形成復合物沉淀以富集抗原蛋白,具有特異性強和靈敏度高等優點,廣泛用于鑒定蛋白質及驗證蛋白互作登方面的研究(DeCaprio and Kohl, 2017)。本研究中,IP組可以特異性富集AmAGO1蛋白(圖7: B),而IgG組不能富集AmAGO1蛋白,進一步表明制備的AmAGO1多克隆抗體具有較強的特異性。

AGO1蛋白能結合miRNA形成miRISC,進而發揮基因沉默作用(Bartel, 2004)。目前,利用AGO抗體驗證miRNA和靶基因的結合及互作關系已見諸于家蠶(楊帆等, 2019)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Zhangetal., 2016)、褐飛虱Nilaparvatalugens(Yeetal., 2019)和朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus(馮楷陽, 2020)等節肢動物的研究報道。但到目前為止,蜜蜂中的相關研究仍然缺失。本研究制備出的高效價、高靈敏度和強特異性的AmAGO1多克隆抗體可用于后續的RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)等實驗,以及西方蜜蜂miRNA與靶基因的互作及miRNA的調控功能及機制研究。另外,鑒于西方蜜蜂和東方蜜蜂AGO1蛋白同源性高,本研究獲得的AmAGO1多克隆抗體有望用于東方蜜蜂的相關研究。