茶尺蠖羧酸酯酶EoCarE592的重組表達及其對農藥的降解能力測定

稅良勇, 趙忠祎, 馮 印, 謝曉倩, 袁曉琴, 毛新芳, 劉忠淵

(四川輕化工大學化學工程學院, 自貢 643000)

羧酸酯酶(carboxlesterase, CarE,EC3.1.1.1)屬于具有α /β水解酶活性的絲氨酸水解酶(Lietal., 2022)家族成員,是一種廣泛存在于生物體內的多功能水解酶,可以水解大量內源性或外源性含有酯鍵、硫酯鍵和酰胺鍵化合物(Johanetal., 2021)。其一級結構在進化上具有高度的保守性,其活性中心(Ser/Cys-Asp/Glu-His)殘基形成高度保守的催化三聯體;催化三聯體在肽鏈的一級結構式不連續,在肽鏈三級結構中互相關聯成為活性中心;其次,親核活性中心的Ser/Cys位于高度保守的五肽氨基酸序列(G-X-S/C-X-G)中(陸巧穎, 2021)。羧酸酯酶的功能具有多樣性,在哺乳動物體內參與酯質的穩態平衡、含酯類藥物和環境毒物的代謝(Márciaetal., 2016),同時參與生長代謝的調節和神經遞質的傳遞(Wangetal., 2018);在微生物體內參與細胞內酯的合成(Johanetal., 2021);在昆蟲體內,羧酸酯酶不僅參與生長發育、營養代謝及環境適應(Fengetal., 2018),還與昆蟲對農藥產生抗性密切相關。根據功能和氨基酸序列的相似性,昆蟲羧酸酯酶分為生長發育、營養代謝以及環境適應性3類,包括α-酯酶、β-酯酶、幼年激素酯酶、外皮酯酶、乙酰膽堿酯酶、神經遞質、突觸受體、膠質肌動蛋白和谷氨酸肌動蛋白9個分支(Ransonetal., 2002)。在昆蟲羧酸酯酶的9個分支中,α-酯酶、β-酯酶和乙酰膽堿酯酶與對殺蟲劑抗性有關(Coppinetal., 2012)。近20年來,研究人員從昆蟲體內陸續分離了多種羧酸酯酶,其結構和功能上的相似性表明羧酸酯酶與農藥的抗性及解毒機制密切相關,例如白微微等(2018)在不同劑量的吡蟲啉刺激下,麥長管蚜Sitobionavenae羧酸酯酶基因SaEST3 mRNA的相對表達量均上調;尹菲等(2020)研究發現飛蝗Locustamigratoria羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2在馬拉硫磷的刺激下的表達量成倍地上調,比農藥處理前的抗性提高了1.5倍,羧酸酯酶基因LmCesA2可能參與飛蝗對馬拉硫磷的代謝解毒過程;Kai等(2022)通過RNA干擾降低CarE基因表達,顯著增加了褐飛虱Nilaparvatalugens對毒死蜱的抗性。此外,多種農藥的刺激下,昆蟲體內單一的羧酸酯酶基因表達并產生對多種殺蟲劑的抗藥性,例如小菜蛾Plutellaxylostella體內的羧酸酯酶基因PxaE14可對6種殺蟲劑(β-氯氰菊酯、聯苯菊酯、毒死蜱、氰戊菊酯、馬拉硫磷和辛硫磷)產生抗性,羧酸酯酶基因PxE8可對兩種殺蟲劑(α-氯氰氰菊酯和馬拉對硫磷)產生抗性(Lietal., 2021)。多種證據表明羧酸酯酶與昆蟲抗藥性產生和發展密切相關。

茶尺蠖Ectropisobliqua是主要的茶園害蟲之一,其繁殖能力及幼蟲活動能力較強,交配和傳代時間較短,短期內暴發會對茶葉生產造成危害(張帥琪等, 2020)。近20年來,農藥的過度使用及昆蟲抗性產生一度成為困擾農業生產和環境治理的問題(Hüesker and Lepenies, 2022)。一方面,昆蟲的抗藥性產生會加劇害蟲對農業生產造成的破壞;另一方面,加大對害蟲的防護可能會促使農藥的過度使用和濫用,進而加劇環境污染和農藥殘留問題。本實驗室前期研究發現茶尺蠖對農藥產生抗性(Pengetal., 2022)可能與羧酸酯酶CarE592、乙酰膽堿酯酶EoPPase672相關。通過克隆得到茶尺蠖羧酸酯酶基因EoCarE592(GenBank登錄號: ON110139),其核苷酸序列長度1 626 bp,編碼541個氨基酸。本研究構建了重組表達載體pET-32a-EoCarE592,并進行原核表達和包涵體蛋白變復性,通過氣相色譜檢測重組EoCarE592對農藥的降解研究,為進一步研究羧酸酯酶參與茶尺蠖體內農藥解毒過程奠定基礎,同時為解決農藥過度使用及農藥殘留問題提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

氯化鈉、氫氧化鈉、丙酮和冰乙酸均購買自重慶川東化工有限公司;胰蛋白胨、酵母膏、氨芐青霉素鈉、異丙基β-D-硫代半乳糖苷、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、Triton X-100、乙二胺四乙酸、尿素、丙三醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇400、GSH、BSA均購自上海生工生物工程有限公司;高效氯氟氰菊酯、異丙維和甲基對硫磷(色譜純)均購自上海泰坦科技股份有限公司,其他未標明試劑均為國產分析純。

7890A氣相色譜儀(配有FID檢測器)購買自安捷倫科技有限公司;智能型電熱恒溫培養箱(DHP-9160B)購自上海一恒科學儀器有限公司;超純水制造系統(UPH-Ⅱ-20T)購自四川優普超純科技有限公司;恒溫培養搖床(HZ150L)購自上海精勝科學儀器有限公司;電泳系統(Trans-blot SD Cell、SDS-PAGE)購自Bio-Rad;超聲波實驗設備(JY92-IIDN)購自寧波新芝生物科技股份有限公司;醫用冷凍離心機(TGL-16)購自四川蜀科儀器有限公司;臺式離心機(TGL-16M)購自上海盧湘儀; 全波長酶標儀(ReadMax1200)購自上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 生物信息學分析

基于實驗室茶尺蠖轉錄組數據庫獲得EoCarE592基因的cDNA序列和氨基酸序列,登錄NCBI數據庫下載其他昆蟲的羧酸酯酶氨基酸序列,利用在線軟件Espript (https:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)進行多序列比對。利用MEGA 6軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建茶尺蠖EoCarE592與其他鱗翅目昆蟲的羧酸酯酶系統發育樹。利用在線軟件Swiss-model (https:∥swissmodel.expasy.org/)進行二級、三級結構預測與同源建模。

1.3 原核表達

將實驗室保存的重組表達載體pET-32a-EoCarE592載體轉化大腸桿菌EscherichiacoliBL21感受態細胞中,并接種到含有100 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養基中,37 ℃下過夜培養;挑選陽性克隆菌種在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB培養基上180 r/min 37 ℃培養4 h;加入IPTG至終濃度60 μmol/L誘導表達4 h,并以不添加IPTG的陽性菌作為空白對照組;8 000 r/min 4 ℃離心15 min,收集上清液和細菌沉淀;細菌沉淀用pH 8.0 Tris-HCl 重懸洗滌兩次,8 000 r/min 4 ℃離心15 min,超聲破碎(功率200 W、超5 s停10 s),收集上清液和破碎后沉淀,SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

1.4 包涵體蛋白純化與變復性

將超聲破碎后的細菌沉淀用包涵體洗滌液(50 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0)洗滌2次,再用含8 mol/L尿素的Tris-HCl緩沖溶液溶解包涵體;BCA法測定蛋白濃度,并將包涵體蛋白加入到鎳柱中,4 ℃震蕩2 h,用含有8 mol/L尿素不同濃度的咪唑緩沖溶液(20, 50, 100, 250和500 mmol/L)進行洗脫,并收集洗脫液,將洗脫后的蛋白稀釋到100 mg/L;用含有6, 5, 4, 3, 2, 1和0 mol/L尿素的蛋白復性緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽, 1 mmol/L還原性谷胱甘肽, 5%甘油, 10 mmol/L甘氨酸和1%精氨酸)進行梯度透析復性(每個濃度透析4 h);透析后的重組蛋白用超濾膜濃縮。

1.5 Western-blot檢測目的蛋白EoCarE592

SDS-PAGE檢測1.4節復性后的蛋白。用含1%脫脂奶粉的TBST按1∶5 000(v/v)稀釋一抗(Anti 6×His-Tag 小鼠多克隆抗體), 4 ℃過夜孵育,洗膜5次;1∶50 000 (v/v)稀釋二抗(HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG),37 ℃孵育2 h,洗膜5次;ECL(Ultrasensitive ECL Chemiluminscence Kit)染色液避光染色1 min, 曝光15 s觀察顯色情況。

1.6 EoCarE592酶活性測定

固藍B鹽比色法測定EoCarE592的酶活性(周帥, 2013)。1 mol/L 1-萘酚(無水乙醇溶)稀釋為0, 60, 120, 240, 360, 480和600 mmol/L的梯度溶液;取25 μL 1-萘酚梯度溶液至2.925 mL的pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中,再加入50 μL氯化四氮鄰二甲氧基苯胺(固藍B鹽),30 ℃避光水浴10 min測定OD600值, 每個濃度梯度重復3次。以OD600值和1-萘酚濃度分別作橫縱坐標,作1-萘酚濃度與吸光度標準曲線;酶活性單位定義:單位時間內催化產生1 μmol 1-萘酚所需酶量定義為1個酶活性單位:1 U=1 μmol/(mL·min)(周帥, 2013)。

參照1-萘酚濃度與吸光度標準曲線制作方法,添加100 μL復性后的重組EoCarE592,以100 μL 100 mg/L牛血清白蛋白(BSA)為空白對照,底物為25 μL 30 mmol/L 1-乙酸萘酯,30 ℃ 避光水浴10 min,測定OD600值,根據1-萘酚濃度與吸光度的標準曲線計算1-萘酚的產量,平行重復3次。

1.7 溫度、pH對EoCarE592酶活性的影響測定

參照1.6節酶活測定方法,設置15, 20, 25, 30, 35, 40和50 ℃溫度梯度;每個溫度梯度在pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中避光水浴10 min。以添加100 μL 100 mg/L牛血清白蛋白為空白對照,紫外分光光度計測定梯度溫度下OD600值,每個梯度平行重復3次。根據1-萘酚標準曲線計算1-萘酚的產量,以確定EoCarE592酶活性的最適溫度。

參照1.6節酶活測定方法,設置不同梯度的pH值(3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0和10.0)的緩沖溶液,每組pH梯度在30 ℃避光水浴10 min,紫外分光光度計測定不同pH梯度下OD600值,每個梯度平行重復3次根據1-萘酚標準曲線計算1-萘酚的產量,以確定EoCarE592酶活性的最適pH。

1.8 金屬離子對EoCarE592酶活性影響的測定

以不含任何金屬離子的Tris-HCL溶液中(pH 8.0)作為緩沖體系,參照1.6節酶活性測定方法,向EoCarE592酶促反應中添加Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Al3+和Fe3+。每種金屬離子的終濃度均5 mmol/L,在30 ℃下孵育 10 min,再加入底物1-乙酸萘酯反應10 min,測定產物的量來計算其酶活性,空白對照組不添加任何金屬金屬離子,相同條件下測定1-萘酚的產量。每組實驗重復3次,以空白對照組為參考,評定不同金屬離子對酶促反應的影響。

1.9 EoCarE592對高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的降解率測定

以丙酮為溶劑分別配制2 g/L的高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威標準品溶液,依次用丙酮稀釋母液為25, 50, 100, 200和400 mg/L的工作液,測定每個工作液中高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的氣相色譜峰面積,以峰面積對應的濃度制作高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的濃度與峰面積標準曲線。

處理組在5.3 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液分別添加100 μL復性后的EoCarE592、 600 μL 2 g/L高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的標準品溶液(終濃度200 mg/L);空白對照組添加100 μL 100 mg/L BSA,混勻后于30 ℃避光分別孵育0, 4, 8, 12, 16, 20和24 h;處理組反應中加入12 mL 二氯甲烷震蕩萃取15 min;6 000 r/min離心15 min,吸取上層水相于另一離心管中加入12 mL 二氯甲烷二次震蕩萃取15 min;合并兩次萃取液旋轉蒸發去除有機溶劑。加入6 mL 丙酮超聲溶解產物;氣相色譜檢測檢測處理組和對照組中高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的殘留量,依據高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的標準曲線計算高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的殘留濃量,每組反應重復3次。降解率(%)=(C0-C1)÷C0×100,C0為BSA對照組中農藥濃度,C1為重組蛋白EoCarE592孵育后農藥濃度。

在Matlab/Simulink中建立基于模糊控制器的機械臂拾取系統的仿真模型如圖3，圖4為機械臂拾取系統模型。

高效氯氟氰菊酯氣相色譜條件參考國標《GB/T 20695-2021》,色譜柱: 30 m×0.250 mm×0.25 μm(型號Agilent 1909I1-433,HP-5)進樣量1 μL,無分流比,載氣(N2)2.0 mL/min,氫氣60 mL/min,空氣300 mL/min,氣化室溫度280 ℃,柱溫:230 ℃恒溫保持14 min,FID檢測器溫度280 ℃。

甲基對硫磷氣相色譜條件:進樣量1 μL,無分流比,載氣(N2) 1.0 mL/min,氫氣30 mL/min,空氣300 mL/min,氣化室溫度280 ℃,柱溫:70 ℃保持1 min,以20 ℃/min升溫到180 ℃,再以50 ℃/min升溫至280 ℃保持3 min,FID檢測器溫度250 ℃。

異丙威氣相色譜條件:進樣量1 μL,無分流比,載氣(N2) 1.0 mL/min,氫氣30 mL/min,空氣300 mL/min,氣化室溫度280 ℃,柱溫:初始70 ℃保持1 min, 然后20 ℃/min升高至180 ℃,再以30 ℃/min到230 ℃保持1 min,FID檢測室溫度250 ℃。

1.10 數據分析

利用IBM SPASS Statistic 27分析金屬離子對酶活性的影響,采用單因素方差分析和LSD多重分析比較差異性和顯著性, Origin 2018軟件用于作圖。

2 結果

2.1 多序列比對和系統發育樹

茶尺蠖EoCarE592的多序列對比如圖1所示,EoCarE592與蘋果卷葉蛾Ectropispostvittana的EpCarE(GenBank登錄號: 7MP4_H)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua的SeCarE(GenBank登錄號: CAH0692026.1)、家蠶Bombyxmori的BmCarE(GenBank登錄號: NP_001182393.1)、大豆尺夜蛾Chrysodeixisincludens的CiCarE(GenBank登錄號: CAH0585492.1)具有高度的保守性, 羧酸酯酶家族的催化三聯體活性中心如圖中黑色方框所示, 為Ser(183)-Glu(313)-His(436),親核活性中心的Ser所在的五肽氨基酸序列(G-C-S-A-G)如圖藍色方框所示。茶尺蠖羧酸酯酶EoCarE592與鱗翅目昆蟲羧酸酯酶在進化上高度保守,具有α/β水解酶超家族成員的催化三聯體活性中心和保守的五肽序列。

登錄NCBI數據庫對茶尺蠖EoCarE592的氨基酸序列進行保守結構域分析,該蛋白屬于羧酸酯酶家族(GenBank登錄號: PFAM00135),其功能結構域位于第102-189位氨基酸, 為α/β水解酶超家族成員(GenBank登錄號: PFAM07859);具有絲氨酸、谷氨酸天冬氨酸或組氨酸的催化三聯體特征。

系統發育樹顯示,茶尺蠖EoCarE592與粉紋夜蛾、大豆尺夜蛾CarE親緣關系最近,與鱗翅目昆蟲CarE歸為一個分支(圖2)。

圖2 鄰接法構建的基于氨基酸序列的茶尺蠖EoCarE592 和其他物種CarE的系統發育樹

2.2 重組EoCarE592的表達

如圖3(A)所示,得到表達、融合蛋白EoCarE592共有644個氨基酸,相對分子質量78 kD、經IPTG誘導表達后的蛋白在78 kD左右出現表達量較高的條帶(圖3: A, 泳道3),與EoCarE592理論分子量大小相符,重組EoCarE592在細胞內以包涵體蛋白形式存在(圖3: A, 泳道4);Ni柱親和層析結果如圖3(B)所示,最適洗脫咪唑濃度為250 mmol/L(圖3: B,泳道10),Western blot檢測結果(圖3: C)表明重組EoCarE592正確表達。復性后的重組EoCarE592采用BCA法進行定量,根據蛋白標準曲線計算出復性后的蛋白濃度為0.0917 mg/mL,超濾濃縮后的重組EoCarE592蛋白含量0.212 mg/mL。

圖3 重組EoCarE592表達(A)和純化(B) SDS-PAGE及Western blot檢測(C)

2.3 重組EoCarE592的酶活性

圖4 溫度(A)、pH(B)及金屬離子(C)對重組EoCarE592酶比活力的影響

與空白對照組(無任何金屬離子孵育后的重組EoCarE592酶活性)相比,Mg2+和K+對重組EoCarE592的酶活性具有促進作用,其中添加了Mg2+的相對活性提高了33%左右,Ca2+, Li+, Na+, Ni2+, Cd2+, Zn2+, Fe3+, Fe2+, Al3+和Cu2+對重組EoCarE592的酶活性具有明顯的抑制作用(圖4: C)。

2.4 重組EoCarE592對3種農藥的降解率

如圖5所示,與BSA處理的空白對照相比,3種農藥與重組EoCarE592孵育24 h后的殘留量分別為35.28, 27.16和38.00 mg/L,重組EoCarE592對高效氯氟氰菊酯、 甲基對硫磷和異丙威具有降解作用, 且24 h內對3種農藥的降解率分別為81.30%, 83.94%和79.83%。

圖5 重組EoCarE592對高效氯氟氰菊酯(A)、甲基對硫磷(B)和異丙威(C)的24 h內降解曲線

3 討論

羧酸酯酶是生物體內重要的多功能水解酶之一,不僅與昆蟲生長發育、營養代謝和環境適應密切相關,還與農業害蟲對農藥產生抗藥性密切相關(Wangetal., 2020)。由于羧酸酯酶在昆蟲體內參與化學農藥試劑的代謝和和隔離作用,其被認為是一種昆蟲農藥解毒劑,能夠良好地消除農藥對昆蟲產生的氧化應激和殺傷作用(Zhang, 2013)與細胞色素P450(Lu, 2021)和谷胱甘肽-S-轉移酶(Vandenholeetal., 2021)并稱昆蟲的三大解毒基因(Amezianetal., 2021)。因此,羧酸酯酶在農業害蟲防治和昆蟲抗藥性機理方面越來越受到重視和關注。

本研究前期從菊酯類殺蟲劑刺激茶尺蠖的轉錄組數據庫中篩選到羧酸酯酶基因片段(尹恒等, 2022),該基因片段全長1 626 bp,共編碼644個氨基酸片段。通過生物信息學分析表明,茶尺蠖EoCarE592與其他20中鱗翅目昆蟲羧酸酯酶有較高的同源性,其中與斜翅科昆蟲粉紋夜蛾、大豆尺夜蛾羧酸酯酶親緣關系最近(圖2);多序列比對結果表明,茶尺蠖羧酸酯酶EoCarE592與蘋果卷葉蛾、大豆尺夜蛾、家蠶和甜菜夜蛾的氨基酸序列具有高度的保守性(圖1),其α/β水解超基因家族的催化三聯體結構和保守的五肽序列完全一致,分別為Ser(183)-Glu(313)-His(436)和G-C-S-A-G,二級結構分析表明(圖1),茶尺蠖羧酸酯酶EoCarE592有17個α螺旋、16個β折疊,其余為無規則卷曲,保守的氨基酸殘基貫穿整個蛋白序列。

大腸桿菌異源表達羧酸酯酶EoCarE592為無活性的包涵體蛋白,通常情況下原核表達蛋白速率過快,蛋白質二硫鍵不能正確的的折疊。異源表達的EoCarE592可以通過8～0 mol/L的尿素變復性,復性后的蛋白酶活性為29.8 U。其在15～50 ℃內都具有一定的活性,最適溫度為30 ℃左右(圖4: A),在pH小于6.0或大于9.0時活性降低。最適pH在7.0～8.0左右(圖4: B)。Mg2+能夠顯著提升EoCarE592酶活性,推測其為酶的活性中心或者啟動劑,而Li+, Ni2+, Cd2+, Zn2+, Fe3+, Fe2+, Al3+, Cu2+對重組EoCarE592的酶活具有明顯的抑制作用(圖5: B)。

已有文獻報道,羧酸酯酶作用于氨基甲酸酯類,擬除蟲菊酯和其他含酯類農藥的酯鍵,使其發生水解反應進而分裂為相應的羧酸和醇(Yan, 2014)。EoCarE592在30 ℃、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中能降解大部分始濃度為200 mg/L高效氯氟氰菊酯,降解率達到81.30%(圖5: A)。Ding等(2022)的研究表明,羧酸酯酶CarCB2使得高效氯氟氰菊酯的酯鍵斷裂,生成產物主要為3-苯氧基苯甲醛,且3-苯氧基苯甲醛的色譜峰出現在未降解的高效氯氟氰菊酯色譜峰之后,與本研究的結果一致。Li等(2020)異源表達棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的羧酸酶基因CarE001A和CarE001H均能夠水解β-氯氰菊酯(β-cypermethrin),高效氯氟氰菊酯和毒死蜱(chlorpyrifos),但是對甲基對硫磷沒有降解作用。這種底物特異性可能與羧酸酯酶的催化三聯體活性中心的“?；Y合袋”相關(Oakeshottetal., 1999),也有可能與農藥和羧酸酯酶催化三聯體的結合程度相關(Lietal., 2021)。另外,農藥化學結構不同或者空間位阻不同也可能導致酶的底物轉一性不同(Baietal., 2019)。

羧酸酯酶是昆蟲抵御各種殺蟲劑等外源物質的重要物質之一(Wheelocketal., 2005),昆蟲通過大量表達羧酸酯酶參與有機磷類農藥的解毒,羧酸酯酶與有機磷農藥的結合,從而屏蔽有機磷農藥的毒害作用(Farnsworthetal., 2010);或者通過水解作用分解有機磷類農藥進而參與農藥的解毒(Cuietal., 2011)。EoCarE592表現出對有機磷類農藥甲基對硫磷(圖5: B),在24 h內降解率達到了83.94%,表明EoCarE592對甲基對硫磷存在降解作用而非屏蔽作用(Chevillonetal., 1999)。這與Sanchez-Hernandez等(2019)研究中甲基對硫磷抑制蚯蚓羧酸酯酶的活性作用不同。周帥(2014)異源表達小鼠羧酸酯酶,研究發現該酶對甲基對硫磷和聯苯菊酯都具有顯著的降解作用。推測EoCarE592可能作用于甲基對硫磷的磷酯鍵。研究結果為茶尺蠖解毒機理的研究提供新的思路與依據。