依賴于端粒延長替代機制的膠質瘤臨床前模型及應用現狀*

仝津愷 閆思翔 張艷多 侯凱龍 張科 張昊楠 常順 賈舒婷**

（1）昆明理工大學醫學院衰老與腫瘤分子遺傳學實驗室，昆明 650500；2）云南省第一人民醫院神經外科，昆明 650032）

膠質瘤主要起源于神經膠質細胞，有部分來源于神經干細胞，是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，發病率約占中樞神經系統惡性腫瘤的80%，惡性膠質瘤5年死亡率僅次于肺癌和胰腺癌［1］。2021年WHO中樞神經系統腫瘤分類中根據不同組織的表型及基因型將中樞神經系統分為1、2、3、4級，其中1、2級屬于低級別膠質瘤，3、4級屬于高級別膠質瘤，不同膠質瘤的正確分級和分類不僅取決于他們的組織學特征，還取決于分子特征，如一些基因（IDH1、ATRX、TP53、CDK2A、BRAF、FGFR1和PDGFRA）的改變和甲基化特征［2］。高級別膠質瘤生長較快、浸潤性強且預后較差，3級膠質瘤的中位總生存期（overall survival，OS）約為3年，而4級膠質瘤，尤其是膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM），僅為15個月，且只有0.05%~4.7%的患者在診斷后存活5年［3］。目前膠質瘤的治療手段還比較單一，仍然是手術切除后輔以放化療的綜合治療，盡管這些治療手段可以一定程度上改善膠質瘤患者的生存時間和生存質量，但其OS時間仍然很短。事實上，膠質瘤患者的低生存率部分歸咎于膠質瘤細胞侵襲性生長以及與周圍正常腦組織交錯，因而手術難以完全切除，同時由于其異常的生物學特性，對放療和化療的耐受，導致術后放化療失敗，而且經常以同級別或高級別復發。因此，新的治療方法和新的治療藥物的開發對于膠質瘤的治療十分必要。

端粒長度的維持對于腫瘤細胞的生存起著至關重要的作用，大多數腫瘤細胞會通過激活端粒酶活性延長端粒長度［4-5］。端粒酶是一種逆轉錄酶，以其自身RNA作為模板在DNA前導鏈的3'端添加端粒序列使端粒延長［6-8］。然而，大約10%~15%的人類腫瘤并不是通過激活端粒酶去維持或延長端粒長度，而是通過端粒延長替代機制（alternative lengthening of telomeres，ALT）去延長端粒［9-10］。目前對ALT機制的了解仍不明確，人們普遍認為ALT是依賴于端粒序列特異性的同源重組（homologous recombination，HR）機制延長端粒［11］。已有研究表明，ALT途徑的激活通常與幾種典型的表型有關，包括高度異質性的端粒長度，端粒姐妹染色單體交換（telomere sister chromatid exchange，T-SCE），豐富的染色體外端粒重復序列（extrachromosomal telomeric repeats，ECTRs）以及出現ALT途徑相關的早幼粒細胞白血病小體（ALT-associated PML bodies，APBs）［10］。在很多類型的腫瘤中，都可以觀察到ALT的存在，其中骨肉瘤和膠質瘤中ALT的發生率相比于其他癌癥類型更高。尤其在膠質瘤中，ALT的發生率約占30%，其中彌漫型星形膠質瘤ALT發生率為55%，少突星形細胞瘤ALT發生率為60%，間變性星形細胞瘤ALT的發生率更是高達65%［12］。越來越多的研究發現，ALT膠質瘤的發生和維持與某些基因的功能異常有關，如：IDH1突變、ATRX缺失、p53突變等，提示這些基因可以成為ALT膠質瘤治療的靶點［13-14］（圖1）。而最近的一些關于ALT膠質瘤靶向治療的研究通過體內或體外的實驗證明了這些靶點的有效性。因此本文通過綜述ALT膠質瘤的細胞及動物模型的研究進展，為靶向ALT膠質瘤的研究提供可以參考的資料。

Fig.1 ATRX mutation was highly correlated with IDH1 mutation and was more common in gliomas without telomerase reverse transcriptase（TERT） activation圖1 對不同膠質瘤患者的基因分析，ATRX突變和IDH1突變高度相關且常見于端粒酶逆轉錄酶沒有激活的膠質瘤患者

1 ALT膠質瘤細胞系模型研究進展

ALT膠質瘤的細胞系模型的建立對于移植瘤模型或者膠質瘤靶點以及藥物篩選都有著十分重要的作用。目前已經有多篇報道描述了ALT膠質瘤細胞系的建立過程以及通過這些細胞系模型進行后續的藥物篩選或者做一些移植瘤模型（表1）。

Table 1 ALT glioma cell line表1 ALT膠質瘤細胞系

由于ALT膠質瘤的發生率較低且體外培養較困難，直到2015年，Jeitany等［15］首次從ALT膠質瘤中分離出TG20細胞。他們證明了TG20具有膠質瘤干細胞的所有特征，包括神經干細胞標志物的表達，在NOD-SCID-IL2Rc（NSG）小鼠和裸鼠模型體內均可以產生腦內腫瘤，且ALT表型穩定。TG20細胞以及用其構建的小鼠模型是一種有效的ALT膠質母細胞瘤的臨床前模型，對開發針對ALT機制的抗癌策略起著十分積極的作用。作者進一步通過該模型證明了G4體穩定劑360B是治療ALT腫瘤的潛在藥物。此外Jeitany等［16］以TG20為模型開展了ALT相關機制的研究，發現P300/CBP相關因子（PCAF）的下調使ALT細胞的T-SCE的頻率降低，而與PCAF同源的賴氨酸乙酰轉移酶GCN5（general control non-derepressible 5）的下調則會使ALT細胞的T-SCE頻率升高，提示GCN5和PCAF在調控ALT細胞端粒重組中相反的作用。他們還進一步證明了組蛋白乙酰轉移酶抑制劑漆樹酸（anacardic acid，AA）會抑制ALT細胞中APBs和T-SCE的水平，促進ALT細胞死亡。而且與端粒酶陽性腫瘤細胞相比，AA特異性地使人ALT腫瘤細胞對輻射敏感，這可能是由于AA降低了ALT細胞的活性導致的，提示賴氨酸乙酰轉移酶可能是ALT膠質瘤治療的新靶點［17］。

隨著對ALT機制研究的不斷深入，目前已有研究揭示了ALT膠質瘤的產生與一些基因的突變有關，如：ATRX缺失、IDH1突變、p53突變等［14］。因此，許多實驗室通過在膠質瘤細胞系中敲除這些基因得到了具有ALT表型的膠質瘤細胞系，并通過這些細胞系進行了一些靶向藥物篩選的工作。

Brosnan-Cashman團隊［13］和Li團隊［18］分別于2018年和2019年通過在膠質瘤細胞系中對ATRX基因進行基因敲除，成功在膠質瘤細胞系中誘導出ALT表型。其中，Brosnan-Cashman等［13］分別在4個端粒酶陽性人膠質瘤細胞系Mogg-UVW、SF188、U-251和UW479中進行了ATRX基因敲除。其中U-251和UW479顯示出ALT陽性細胞的多種特征，包括超亮的端粒DNA信號、ALT相關的PML小體和C環。然而，Mogg-UVW和SF188細胞系在對ATRX基因進行基因敲除后沒有出現ALT表型，提示除了ATRX缺失外，其他基因組或表觀遺傳學事件對于腫瘤細胞中ALT機制的誘導也是必要的。同樣，Li等［18］通過CRISPR/Cas9在端粒酶陽性的人腦星形膠質母細胞瘤細胞U87中對ATRX基因進行基因敲除后也誘導出了ALT的表型。進一步的機制研究表明，ATRX和DAXX的基因敲除造成了端粒處的損傷及復制壓力，進一步促進了ALT表型的出現，表現為APBs和C環的水平上升，激活了ALT相關的DNA修復。但是，這種ATRX和DAXX的缺失引起的ALT相關的DNA修復并不會迅速出現，在作者的研究中提示，ATRX的缺失導致H3.3組蛋白無法正常沉積于端粒上，造成了端粒處的復制壓力，而U87細胞本身的端粒酶活性并不足以克服ATRX缺失相關的端粒功能障礙，表現出了生長活性降低的現象，迫使ATRX缺陷細胞在生長過程中不得不采用基于同源重組的ALT途徑作為替代的端粒維持機制。對這些新的ALT膠質瘤細胞系進行研究和實驗，將進一步加深對ALT分子機制的理解，有助于為ALT陽性腫瘤的治療開拓新的抗癌療法。

之后，有研究人員在ATRX基因敲除或突變的基礎上進一步將其他與ALT膠質瘤高度相關的基因，如IDH1和p53同時突變，成功在膠質瘤細胞系中誘導出ALT的表型，進一步鎖定了誘導ALT膠質瘤發生的必需基因。Mukherjee等［14］為了證明IDH1突變和ATRX丟失可能以某種方式協同作用，有效地解決端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）缺陷細胞的端粒功能障礙，并促進膠質瘤的形成。他們通過在TERT陰性的人星形膠質細胞中引入病毒蛋白E6和E7，使其p53和pRB功能喪失，然后通過CRISPR系統對ATRX進行基因敲除后過表達IDH1突變體，以此成功的誘導出了ALT表型。利用這個系統，作者發現IDH1突變會介導RAP1下調，RAP1作為端粒保護蛋白之一，已經被證明會抑制HR的發生［19］，其下調促進了功能失調的端粒處啟動DNA損傷反應。同時IDH1突變也下調了XRCC1的表達，XRCC1是aNHEJ途徑的關鍵組成部分［20］。因此，突變的IDH1介導的RAP1和XRCC1的下調會導致細胞不通過aNHEJ途徑修復功能失調的端粒，而是更依賴于HR等途徑，從而促進ALT的發生［14］。這些發現有利于對ALT膠質瘤的發生有進一步的認識，同時對ALT膠質瘤的治療也有很重要的指導意義。

綜上所述，以上實驗室通過腫瘤原代細胞培養或基因編輯的方法，成功建立了一些ALT膠質瘤細胞系臨床前模型，一定程度上反應了ALT膠質瘤的生理和病理情況。ALT膠質瘤細胞系臨床前模型的建立為臨床前針對ALT膠質瘤的藥物和新療法的開發具有十分重要的作用。

2 ALT膠質瘤小鼠臨床前模型研究進展

盡管體外的細胞模型研究提供了許多顯著的益處，但它們具有一個主要的缺點，即無法模擬藥物如何與復雜器官中存在的所有分子相互作用。而體內研究能夠解決體外研究的局限性，它能夠證明藥物對個體的影響，可以更好地體現出藥物在機體中和器官或者其他體內途徑的相互作用，從而改善藥物在臨床使用前安全性、毒性和功效的測試。這有助于研究者對于人類疾病靶向藥物的研發。在膠質瘤的臨床前抗腫瘤治療效果的研究中，使用的主要是動物異種移植瘤模型。

然而在近十年的研究過程中，才逐漸出現了ALT相關的膠質瘤小鼠模型，目前主要的方法是將臨床上獲得的病人來源的ALT膠質瘤細胞系或者將現有的膠質瘤細胞系誘導為ALT細胞后，通過原位或異位的方法注射到SCID小鼠或裸鼠體內，從而建立異種移植模型用于臨床前靶向藥物作用研究。Jeitany等［15］為了證明TG20細胞具有膠質瘤干細胞的所有特征，在NOD-SCID-IL2Rc（NSG）小鼠和裸鼠模型中用TG20細胞在腦內進行了原位移植，成功在動物模型中形成了可以連續移植的腦腫瘤。并且進一步在動物模型水平上驗證G4體穩定劑360B對ALT膠質瘤的抑制作用。2014年Wakimoto等［24］將20例來自臨床的IDH1突變的膠質瘤切除的腫瘤標本植入免疫力低下的小鼠腦內，成瘤后進行體外培養，獲得了一些細胞系，這些細胞系在組織學上都與親本腫瘤表型十分相似。其中MGG119在體外培養后成為了可以穩定傳代的細胞系。雖然Wakimoto等當時并沒有討論關于MGG119是否是ALT膠質瘤，但在后續其他研究中，對MGG119進行了關于ALT表型的檢測，確定了這株細胞具有ALT細胞系的特征［14］。除了ATRX、IDH1等基因和ALT的發生高度相關，其他一些基因，比如NF1和ALT的發生同樣關系密切。最近發現，在NF1相關腫瘤尤其是星形細胞腫瘤，ALT發生的機率比較大，且常常伴隨著ATRX突變和NF1突變［25-26］。Yuan等［22］在2022年，利用患者來源的NF1缺陷和ATRX突變的ALT神經膠質母細胞瘤細胞在裸鼠上的異種移植模型，證明了ATRi（ATR inhibitor）具有特異性抑制NF1缺陷細胞的能力ALT細胞系的能力。

雖然異種移植為顱內腫瘤的研究提供了許多優點：重復性好，生長速度標準化，死亡時間和腫瘤定位方便。然而，由于用于植入的人工、侵入性手術方法以及準確復制人類膠質瘤的組織學特征的能力有限，這些模型具有花費的時間較長，成本較高，移植成功率不確定，很難完整的復制患者數據等局限性［27］。而轉基因自發腦膠質瘤動物模型的出現在一定程度上解決了上述的問題。近幾年來，雖然還沒有成功構建自發ALT膠質瘤動物模型的報道，然而通過在動物水平上進行與ALT相關的基因的編輯，一些動物模型表現出較高水平的膠質瘤形成幾率，提示該模型具有自發形成ALT膠質瘤的潛能。

在2016年，Koschmann等［28］通過睡美人轉座酶系統（Sleeping Beauty（SB）Transposase System）建立了ATRX基因缺陷小鼠，這種小鼠會在出生一定時間后出現自發的膠質瘤，揭示了ATRX缺失對膠質瘤腫瘤增殖的影響。這種小鼠模型可以很大程度地模擬人體自發形成腫瘤的過程，這一成果也為深入了解ATRX突變在人腦膠質瘤中的作用提供了依據。有研究已經提示了NF1與ALT星形細胞腫瘤發生高度相關，而2021年，Pan等［29］使用的由神經纖維瘤病1腫瘤抑制基因(NF1)5突變驅動的視神經膠質瘤（optic pathway gliomas，OPG）的小鼠模型，證明了刺激視神經活動會促進視神經膠質瘤的生長，以及通過光剝奪減少視覺體驗可以防止腫瘤的形成和維持。這種NF1基因敲除的小鼠模型表現出膠質瘤高發的特性，雖然還沒有NF1小鼠確實是自發ALT腫瘤模型的報道，但他有望成為一種新型的自發ALT腫瘤小鼠模型。

3 總結與展望

由于ALT的發生機制目前還不明確，因此靶向ALT腫瘤藥物的研究較少。而在這些研究中，有相當一部分研究都是通過上述的ALT膠質瘤細胞模型或動物移植瘤模型完成的。如前文中提到的G4體穩定劑360B以及組蛋白乙酰轉移酶抑制劑AA都是基于TG20細胞模型發現的具有靶向ALT活性的藥物。而ATR抑制劑VE-822、AZD6738和VE-821以及PARP抑制劑Olaparib、Talazoparib、Niraparib等都被證明在ALT膠質瘤或者ALT膠質瘤小鼠模型體內具有較好的殺傷作用［22，30-31］。雖然目前ALT膠質瘤的臨床前模型較少，但是已經建立的這些ALT細胞模型和小鼠模型已經在藥物篩選等方面發揮了重要作用，尤其是原代培養的膠質瘤細胞系，能很好地反映膠質瘤在體內的生長狀態，獲得的數據也更加準確真實。ALT膠質瘤動物模型能更好地反映人類腫瘤的遺傳、形態和免疫學特征。本實驗室近幾年通過ALT相關機制的研究，也有望在自發ALT膠質瘤小鼠模型的建立上取得突破。這些膠質瘤小鼠模型的建立將為更詳細的研究膠質瘤的發生過程和更準確地評估治療的安全性及有效性提供了有利的條件。