EPS及消毒劑對細菌表面附著和初期生物膜形成的影響

鐘疏影,余 超,陳國煒,蔡寅諾,劉 麗

(合肥工業大學土木與水利工程學院,安徽合肥 230009)

目前的氯消毒機制能夠控制飲用水配水系統(drinking water distribution system,DWDS)中出現的絕大多數病原體,但是生物膜在DWDS中可以通過容納病原體、提供營養物質和保護病原體免受消毒劑脅迫的方式,促進病原體在系統內的生存和傳播[1]。同時,主體水和生物膜中存在大量的有機物,降低了系統內消毒劑的功效和游離氯的殘留[2]。而消毒劑及其副產品在DWDS的濫用也可能會誘導細菌發生突變,致使致病菌和抗性細菌在系統內的廣泛傳播[3]。

胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)在微生物生存中起到了極大的作用。生物膜能夠通過捕獲和濃縮環境營養物質形成EPS的方式,進而增加生物膜對抗消毒劑和水動力的能力[1,4]。而EPS中存在的酶(如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶)與氧化劑類和醛類的消毒劑會發生酶促反應,導致消毒劑活性的降低[5]。一旦EPS的黏附強度被外部剪切力、氯化和機械應力等環境壓力破壞,會使得細菌從生物膜釋放到水中,進一步導致系統內水質的污染[6]。

EPS的生成(包括其組成和含量)往往會受水動力、消毒劑種類與濃度等條件的影響。當生物膜在系統內接觸消毒劑后,水動力會強化生物膜對消毒劑的傳質效應,加速消毒劑與生物膜的反應[7]。此外,DWDS中游離氯的殘留質量濃度應保持在0.5～1 mg/L,然而這種殘留濃度不足以阻止系統內生物膜的生長和發育[8]。研究[9]表明,次氯酸鈉對DWDS中生物膜實現了極高的生物膜殺滅率,然而極高的次氯酸鈉濃度反而會降低對生物膜的去除效率,從而使得生物膜重新接種。此外,一氯胺更善于穿透生物膜結構,因為它不受消毒劑擴散限制的影響[10]。但是,一氯胺也被證實能夠促進硝化反應的發生,體系內存在的亞硝酸鹽可與氯胺發生反應,促進生物膜的發展,影響管網的水質。

盡管如此,目前有關EPS及消毒劑對細菌表面附著及其初期生物膜形成的影響機制尚不清晰。因此,本文以銅綠假單胞菌和藻酸鹽分泌過量的突變體為研究對象,通過靜態嘗試解析短期的消毒劑條件如何調節生物膜EPS的分泌和生物膜特征的變化,進而干預細菌的表面附著行為,為進一步研究DWDS中消毒劑影響下生物膜相關病原體的風險評估和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗準備

1.1.1 菌株準備

本文采用兩種菌株:野生型銅綠假單胞菌(wild-type PAO1)和突變型銅綠假單胞菌(PAO1,ΔmucA),敲除mucA基因的突變型銅綠假單胞菌菌種由中國科學院微生物研究所提供。兩種菌株使用菌液、甘油和生理鹽水(體積比為2∶1∶1)混合后于-4 ℃下冷凍保存。在試驗前,需要將其進行活化處理。首先,使用移液槍吸出融化成液態的菌種,并將其加入到經過滅菌處理后的50 mL的LB培養基中。將培養基置于37 ℃的恒溫培養箱(DNP-9162-1A,名宸,合肥)中,在搖床(轉速為150 r/min)上培養16～18 h,保證細菌的充分活化。然后取10 mL活化好的菌液(37 ℃,培養16～18 h)加入到滅菌處理過的50 mL離心管中,在離心機(5810R,Eppendorf,德國)中進行離心重懸浮處理后,將10 mL的生理鹽水加入裝有菌種的離心管內,制成試驗使用的菌液。利用分光光度計(UV-2600,尤尼柯,上海)測定菌液的吸光度,利用生理鹽水調節菌液吸光值(OD600)為0.5±0.02,對應細菌菌落形成單位(colony forming units,CFU)約為2×108CFU/mL[11]。

1.1.2 消毒劑制備

取1 mL高質量濃度次氯酸鈉母液(100 g/L)溶于99 mL的去離子水中,制得1 g/L低質量濃度次氯酸鈉溶液。其需要裝入棕色藥瓶密封保存,2～5 ℃下可保持一個月的有效期,每次使用前應使用余氯儀測定濃度,保證準確。

1.1.3 試驗裝置準備

試驗反應器使用12孔板作為生物膜培養裝置,在使用前對試驗用品進行消毒處理。將12孔板和聚氯乙烯(PVC)與不銹鋼(STS)載片(2 cm×2 cm)在紫外燈光下照射至少30 min;培養基和磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)使用高溫高壓滅菌(121 ℃、0.01 MPa)20 min、紫外消毒30 min后,置于超凈臺冷卻備用。

1.2 試驗設置

為了探究消毒劑脅迫對微生物EPS影響和生物膜形成的機制,本試驗選用了兩種細菌——野生株和突變株,設置了4種消毒劑條件(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L),并控制其他環境變量保持不變,包括環境溫度為23 ℃、營養條件為1∶50 LB培養基。具體試驗過程如下:首先,準備8個12孔板(編號1～8),在編號1～4的孔板中添加PVC載片,在編號5～8的孔板中添加STS載片。隨后,在孔板每個孔中加入2 mL的1∶50 LB培養基,同時將事先制備好的兩種細菌的菌種懸浮液向孔板每個孔中對應各加入20 μL。最后將每個孔板放置在37 ℃的恒溫箱中進行培養,每天重復投加營養保持濃度為1∶50,生物膜培養時間共7 d。

當生物膜培養結束后,在12孔板中分別投加0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L的次氯酸鈉溶液,對附著在載片表面的生物膜進行處理。2 h之后將12孔板中的PVC和STS載片取出。

1.3 分析方法

1.3.1 生物膜提取

當消毒劑處理結束后,在無菌操作臺對PVC與STS載片進行處理,用無菌PBS溶液(pH值=8)沖洗,以去除表面上存在的未附著細菌。然后用無菌棉簽在PVC管內壁上反復刮取生物膜,并反復擦拭10～30次,放入含有3 mL生理鹽水的離心管中。使用超聲機(KQ5200DE,舒美,昆山)對離心管進行超聲處理10 min后取出,以確保拭子內的生物膜被震落到溶液中,從而獲得生物膜懸浮液。

1.3.2 生物量的測定

使用分子探針LIVE/DEAD細菌活性試劑盒(賽默飛世爾科技,美國)來區分生物膜樣品中的活細胞和死細胞[12]。染色液的配置過程如下。首先在3.0 mL生理鹽水中加入3 μL 碘化丙啶(PI,2 mmol)和3 μL 綠色熒光核酸染料(SYTO 9,0.33 mmol)制備染色液。然后將100 μL的染色液滴加到3 mL的生物膜懸浮液中,并進行避光染色30 min。將染色后的生物膜懸浮液通過直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm的黑色聚碳酸酯膜[13],將夾帶細菌的濾膜置于熒光顯微鏡(LX73,奧林巴斯,日本)下觀察,隨機選擇10個視野進行200倍的細菌計數。根據至少20個視場的計數,估計每張膜上有活力和無活力的細菌數量。

1.3.3 EPS的測定

EPS提取采用水浴加熱法,將樣品置于80 ℃下水浴加熱30 min,再通過0.22 μm濾膜過濾,濾液即為待測溶液。多糖采用蒽酮法,在625 nm波長下用紫外分光光度計(UV-2600,尤尼柯,上海)測定各待測液分光光度值,用葡萄糖作標準曲線;蛋白采用 Folin-Lowry法,在750 nm波長下用紫外分光光度計測定各待測液分光光度值,用牛蛋白血清作標準曲線[14]。

1.3.4 原子力顯微鏡(AFM)

使用無菌PBS溶液(pH值=8)沖洗表面的懸浮細菌后,將2 mL 0.5%戊二醛溶液放在載體表面2 h,然后用PBS溶液沖洗去除表面未反應的戊二醛[15]。試驗過程使用了彈簧常數為0.02～0.14 N/m的清潔硅探針AFM懸臂梁(BL-AC40TS-C2,奧林巴斯,日本),而懸臂梁的彈性常數是通過熱噪聲法確定的,彈性常數為0.772 8 N/m。生物膜表面力的回歸曲線被用來評估生物膜的黏附力,通過使用接觸模式從載體表面的不同位置收集力與距離的曲線,并通過舍棄每組數據的異常值來分析生物膜黏附力,最終獲得20個點位的生物膜黏附力信息。

1.3.5 生物膜粗糙度的測定

從反應器中取出樣品,使用無菌PBS溶液(pH值=8)沖洗表面的懸浮細菌。在使用AFM(Multimode 8,布魯克,德國)數據分析載體表面的生物膜形貌之前,應使用Flatten方法去除成像中產生的噪聲。使用Flatten方法處理的圖像顯示了更多的表面信息,也可以區分更多的表面形貌變化和孔隙結構。生物膜的表面粗糙度通過平均粗糙度進行評估[16]。

2 結果和討論

2.1 EPS和消毒劑對銅綠假單胞菌附著行為的影響

圖1顯示了兩種菌株在PVC與STS表面附著和受不同消毒劑濃度脅迫后的生物量變化結果。試驗結果顯示,適度的消毒劑濃度促進了突變株在載體表面的附著。具體而言,在1.0 mg/L和2.0 mg/L質量濃度的消毒劑條件下,突變株在PVC表面附著的生物量分別為2.36×106cells/cm2和2.25×106cells/cm2,與初始階段相比生物量分別增大至1.26倍和1.20倍。繼續增大消毒劑質量濃度(3.0 mg/L),PVC表面附著的生物量減小了0.72×106cells/cm2,相較于初始階段減小了1/5。而野生型在兩種基質表面受到消毒劑影響下生物量均呈現出了減小的趨勢。具體而言,在3.0 mg/L的消毒劑影響下,野生型在STS表面附著的生物量由初始階段的4.1×105cells/cm2降低到了1.8×105cells/cm2。這說明高濃度的消毒劑對生物膜在基質表面的形成極為不利。而不同管材也影響了兩種菌株生物膜在表面的附著。以突變株為例,在兩種基質表面附著的初始生物量分別為1.88×106cells/cm2和1.0×106cells/cm2,突變株在PVC表面的生物量是在STS表面的1.88倍,這說明兩種銅綠假單胞菌在PVC上相較于在STS上存在更大的附著優勢。究其原因,可能是PVC在水環境中產生的有機物能夠與消毒劑產生反應,從而對表面附著的生物膜產生了保護效應[17]。

注:*表示初始附著生物量。

2.2 消毒劑對細菌EPS生成的影響

圖2顯示了在初始條件和不同消毒劑濃度條件下兩種銅綠假單胞菌在載片表面的EPS含量。結果顯示,隨著消毒劑濃度的增大,兩種菌株在各基質表面的EPS含量均呈現出先增大后減小的趨勢。以PVC表面附著的突變體為例,在低質量濃度消毒劑(0.5、1.0 mg/L)影響下,基質表面的EPS含量分別為29.31 μg/lg(cells)和35.12 μg/lg(cells)。繼續增大消毒劑質量濃度(3.0 mg/L),基質表面的EPS含量為27.26 μg/lg(cells),相較于初始階段減小了1/7。而突變體在1.0、2.0 mg/L的消毒劑質量濃度影響下,PVC表面的EPS含量分別為35.12 μg/lg(cells)和33.49 μg/lg(cells),這一結果與圖1的生物量變化趨勢相一致。這說明消毒劑在一定程度上促進了細菌分泌更多的EPS以抵抗環境的影響[18]。

注:*表示初始階段生物膜EPS含量。

同時,基質特性也影響了兩種菌株所形成生物膜EPS的生成,特別是胞外多糖的形成。以野生型為例,初始階段STS和PVC表面的胞外多糖分別為1.77 μg/lg(cells)和7.54 μg/lg(cells),胞外多糖增大了近3.26 倍。這一結果說明兩種菌株在PVC表面會分泌更多的胞外多糖,目前研究[19]表明,PVC等塑料管道能夠釋放大量的有機碳化合物,為細菌提供了充足的營養物質,進而促進細菌在PVC表面的附著。

2.3 消毒劑濃度對生物膜表面粗糙度和力學特征的影響

圖3為兩種銅綠假單胞菌在初始階段和不同消毒劑濃度影響下的生物膜黏附強度。試驗結果顯示,適度增大的消毒劑濃度強化了生物膜的黏附強度。具體而言,初始階段在PVC表面的突變株生物膜黏附力為21.52 nN。當處在消毒劑質量濃度為1.0 mg/L的環境后,生物膜的黏附力增大至1.51 倍。繼續增大消毒劑質量濃度(3.0 mg/L),生物膜黏附力降低到了24.52 nN,但相較于初始階段仍存在一定程度的提升。同時,由圖3結果顯示,1.0 mg/L的消毒劑質量濃度對STS表面生物膜的黏附強度提升最為顯著。以STS表面的生物膜黏附力為例,野生型與突變株的初始階段黏附力分別為2.01 nN和10.11 nN。當投加1.0 mg/L質量濃度消毒劑后,STS表面兩種菌株的黏附力分別增大為4.34 nN和17.12 nN。究其原因,可能是由于生物膜的EPS與外界高濃度的消毒劑發生反應,進而降低了生物膜的黏附強度[20]。

注:*表示初始附著生物膜粗糙度和黏附力。

生物膜粗糙度能夠通過強化生物膜對水環境內微生物的攔截效應來促進細菌的表面聚集和生物膜的形成。因此,為了解析消毒劑對生物膜表面特征的影響,試驗基于AFM分析了不同消毒劑濃度處理下的生物膜粗糙度變化。圖4顯示了在初始條件和3種消毒劑濃度條件下兩種銅綠假單胞菌在載片上的生物膜表面特征。同時,圖3為基于AFM圖對生物膜粗糙度進行評估所得的平均粗糙度。由初始結果顯示,突變體形成的生物膜相較于野生型更為光滑。由圖3的粗糙度評估結果顯示,初始階段野生型與突變株銅綠假單胞菌的生物膜表面粗糙度分別為1 087 nm和842 nm。不斷增大消毒劑濃度也降低了兩種菌株表面的粗糙度,以1.0 mg/L的消毒劑質量濃度影響下的試驗結果為例,PVC上兩種菌株生物膜粗糙度分別為614 nm和634 nm。繼續增大消毒劑質量濃度(3.0 mg/L)后,PVC上野生型與突變株的生物膜粗糙度分別減小到了427 nm和527 nm,相較于初始階段分別下降了約3/5和2/5。這說明藻酸鹽過量分泌的突變體相較于野生株具備更強的抵抗能力,而在消毒劑脅迫下EPS的分泌也起到了維持生物膜表面特征和形態結構的作用[21]。

圖4 不同消毒劑濃度下野生型銅綠假單胞菌和突變株在PVC表面附著生物膜的AFM圖(2 h)

3 結論

(1)結果表明,相較于野生型,突變型的生物膜形成優勢顯著。特別是當氯質量濃度大于1 mg/L時,強化了其形成優勢;EPS也顯著提高了生物膜的黏附強度以及降低了其表面粗糙程度。

(2)低濃度氯促進細菌EPS的生成以及初期生物膜的形成,表面的EPS含量分別為29.31 μg/lg(cells)(0.5 mg/L)和35.12 μg/lg(cells)(1.0 mg/L)。高質量濃度氯(3.0 mg/L)則抑制了生物膜的形成,同時,也降低了兩種菌株生物膜的黏附力與表面粗糙度。

(3)對于兩種菌株而言,PVC管材上生物膜的形成優勢顯著高于STS管材,PVC表面的生物量是STS表面的1.88倍。