淫羊藿苷對抑郁癥模型小膠質細胞表型轉化的調控作用

曹利華,高 松,王笑雨,王真真,賀紅娟,李 娜,白 明,苗明三*

1河南中醫藥大學中醫藥科學院,鄭州 450046;2仲景宛西制藥股份有限公司河南省中藥固體制劑技術創新中心,西峽 474550;3河南中醫藥大學 藥學院,鄭州 450046

抑郁癥是一種情感性精神障礙,其發病率高,易反復發作,嚴重者危及生命,已成為全球性公共健康問題[1]。抑郁癥患者臨床表現主要有抑郁情緒、快感減退、無價值感或內疚感以及自殺意念。由于抑郁癥的復雜生物學機制和涉及眾多系統,發病機制尚未完全了解,抗抑郁藥的研究是世界范圍內的焦點,但進展緩慢[2,3]。尋找治療抑郁癥的新途徑和新藥物靶點已成為一個緊迫的問題。

應激引起的神經炎癥反應在抑郁癥的發病機制中日益受到重視[4],小膠質細胞是中樞神經系統一類固有免疫細胞,與腦內神經炎癥反應有著密切的關系,有望成為新的治療靶點[5]。經典的M1型極化,釋放炎癥因子白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)等,引起神經炎癥反應;替代激活的M2型極化,分泌白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)、轉化生長因子(transforming growth factor beta,TGF-β)等,誘導組織修復,發揮神經保護作用[6]。調節小膠質細胞表型轉化是干預抑郁癥發生發展的重要途徑之一[7]。中醫藥一直以來在抑郁癥防治方面都有著明顯的優勢,中醫學中,腎陽虛是抑郁癥發病的重要機制之一,從腎論治為治療抑郁癥提供了思路[8]。臨床中,補腎陽中藥淫羊藿常與其他中藥配伍(仙茅、巴戟天、夜交藤等),用于治療腎陽虛型抑郁癥[9,10]。在前期研究中觀察到補腎陽中藥淫羊藿(小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.干燥葉)活性成分淫羊藿苷具有良好的抗抑郁作用[11],但其機理仍不清楚。本研究擬采用慢性不可預知溫和應激致抑郁癥模型,結合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的BV-2細胞極化模型,探索淫羊藿苷抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器

DW-86L728J超低溫保存箱(海爾股份有限公司);FilterMAX F5酶標儀(美國Molecular Devices);3111二氧化碳培養箱(賽默飛);Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀(美國GE);ABI 7500 FAST實時熒光定量PCR儀(美國ABI 7500 FAST);OFT-100D大小鼠開場活動實驗系統(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2 材料與試劑

材料:淫羊藿苷(批號20190801,成都瑞芬思生物科技有限公司,純度>98%);鹽酸氟西汀(批號T739411W,蘇州中化藥品工業有限公司)。

試劑:小鼠 IL-6、IL-10酶聯免疫吸附劑實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(批號3361-1A-6、3432-1A-6,Mabtech);小鼠五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、多巴胺(dopamine,DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)ELISA試劑盒(批號ADI-900-175、ENZ-KIT188-0001、ASB-OKEH02565,Enzo Biochem);蛋白免疫印跡(Western Blot)所需抗體:誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抗體(批號CY5993,Abways Technology);分化簇206(cluster of differentiation 206,CD206)抗體(批號YT5640,Immunoway);二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(批號AB0101,Abways Technology)。免疫熒光技術所需抗體:一抗:iNOS抗體(批號ab283655,Abcam);CD206抗體(批號AF2535-SP,R&D Systems);二抗Cy3 conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(批號GB21303,Servicebio);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸鹽(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(批號D3571,Thermo Fisher);實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

細胞:小鼠小膠質細胞(BV-2)(批號:CL-0493,武漢普賽諾生命科技有限公司)。

動物:SPF級,雄性,KM小鼠,體質量18～22 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物使用許可證:SYXK(浙)2019-0001)。操作符合動物實驗3R原則和動物實驗倫理要求(經河南中醫藥大學動物實驗中心審批,審批號為DELL202103164)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及分組給藥

模型制備:以連續56 d慢性不可預知性應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)建立抑郁癥小鼠模型。將7種刺激,隨機安排到56 d內,每天隨機安排1種刺激方法,每種刺激避免重復出現,以免發生適應性。7種刺激方法:剝奪飲食(禁水禁食12 h);熱刺激(將小鼠放入烘箱為45 ℃中刺激5 min后取出);冷刺激(將小鼠中放入水溫為4 ℃冷水中,冰水浴刺激5 min后取出,低溫烘干);疼痛刺激(在小鼠尾部1 cm處進行夾尾刺激5 min,以小鼠發出哀鳴聲為宜);潮濕刺激(小鼠處于墊料和水以1∶2的比例的潮濕環境中24 h);顛倒晝夜節律(晝/夜顛倒24 h:于當日8∶30關閉實驗室內光源,營造黑夜環境,至20∶30開啟光源,模仿白晝環境,使其白晝顛倒,直至次日8∶30恢復正常白晝環境);傾斜鼠籠(12 h傾斜鼠籠,約45°)。

分組給藥:將小鼠隨機分為5組,每組6只:空白組(control,Con)、模型組(model,Mod)、鹽酸氟西汀組(fluoxetine hydrochloride,Flx,10 mg/kg)、淫羊藿苷高(high-dose icariin,ICA-H,50 mg/kg)、低劑量組(low-dose icariin,ICA-L,25 mg/kg)。除空白組外,其余小鼠進行造模,于造模第1 d,在造模的同時,給藥組灌服相應的藥物,每天1次,連續56 d,灌胃體積0.1 mL/g,空白組及模型組灌服同體積生理鹽水。

1.3.2 行為學及生化指標檢測

于給藥后第53～56 d,分別對各組小鼠進行行為學測試(糖水消耗測試、強迫游泳測試、曠場活動測試)。

糖水消耗測試:在造模開始之前(作為基線)和造模結束后進行。經過48 h的適應期:給予小鼠兩個水瓶(1%蔗糖溶液),24 h后,將其中一瓶蔗糖溶液替換普通飲用水,持續24 h。24 h禁食禁水后,分別給予小鼠兩瓶裝有水和1%蔗糖溶液的水瓶(各100 mL),12 h后,記錄各組小鼠消耗的純凈水和蔗糖溶液,計算糖水偏好百分比(糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%)。

曠場活動測試:采用OFT-100D大小鼠開場活動實驗系統,觀察各組小鼠5 min內的水平活動距離,每只小鼠結束后,用75%酒精,對開場活動實驗箱進行清理和消毒。

強迫游泳測試:采用小鼠全自動強迫游泳實驗系統,記錄各組小鼠5 min內的游泳不動時間。

末次給藥后,脫頸椎處死,取小鼠腦組織。一部分腦組織制備腦組織勻漿(腦組織:生理鹽水=1∶10),離心,取上清。分離另一部分腦組織海馬區:采用Trizol法提取各組小鼠海馬區腦組織RNA,反轉錄;采用RIPA裂解液提取各組小鼠海馬區腦組織蛋白,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度;所有樣品,存于-20 ℃冰箱備用。

ELISA檢測腦勻漿IL-6、IL-10、5-HT、DA、NE水平。RT-PCR檢測腦組織IL-6、IL-10、iNOS、CD206 mRNA表達水平。RT-PCR采用SYBR Green法。根據前期實驗設定RT-PCR反應條件[12,13],實驗所需引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司(見表1)。采用Western blot檢測腦組織iNOS,CD206蛋白表達,并用Image J進行分析。

表1 引物序列

1.3.3 小鼠小膠質細胞(BV-2)培養

于37 ℃、5 % CO2孵箱內培養,采用DMEM培養基(含10%胎牛血清)。

1.3.4 淫羊藿苷適宜受試濃度篩選

96孔板接種BV-2細胞(2×104個/孔),培養24 h后,完全培養基換液并加入淫羊藿苷,其終濃度為100、80、60、30、15、0 μg/mL,孵箱內培養24 h后,采用細胞增殖與毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法檢測細胞活力。

1.3.5 藥物處理及指標檢測

根據“1.3.4”實驗結果選取淫羊藿苷適宜受試濃度。實驗分組如下:空白組(control,Con)、模型組(LPS 100 μg/mL,Mod)、淫羊藿苷高劑量組(30 μg/mL+LPS,ICA-30)、淫羊藿苷低劑量組(15 μg/mL+LPS,ICA-15)。

于6孔板內,放置細胞爬片,接種BV-2細胞,培養24 h后,完全培養基換液每組分別加入相應濃度的淫羊藿苷或LPS,孵箱內培養48 h后,收集各組細胞爬片,多聚甲醛固定30 min。用0.1%Triton X-100處理20 min,然后在室溫下用5%牛血清白蛋白封閉30 min。將細胞與iNOS抗體或CD206抗體孵育4 ℃過夜。用冰冷的PBS洗滌三次后,將細胞與二抗體在室溫下孵育1 h。三次洗滌后,細胞核用DAPI在37 ℃下復染10 min。熒光顯微鏡觀察不同的小膠質細胞狀態標記。

1.3.6 數據處理

2 結果與分析

2.1 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠抑郁樣行為的影響

與空白組相比較,模型組小鼠的運動距離顯著縮短(P<0.01),糖水消耗明顯減少(P<0.01),強迫游泳不動時間明顯增加(P<0.01)。與模型組比較,鹽酸氟西汀、淫羊藿苷高劑量可增加模型小鼠的運動距離(P<0.01)和糖水消耗量(P<0.01),降低模型小鼠游泳不動時間(P<0.05、P<0.01);淫羊藿苷低劑量可增加小鼠的運動距離(P<0.01),降低模型小鼠游泳不動時間(P<0.05),有增加模型小鼠糖水消耗的趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05),結果見圖1。

圖1 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠抑郁樣行為的影響

2.2 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠腦組織單胺類神經遞質的影響

與空白組相比較,模型組小鼠腦組織單胺類神經遞質5-HT、DA、NA水平顯著減少(P<0.01,P<0.05)。與模型組相比較,鹽酸氟西汀可增加模型小鼠的腦組織5-HT水平(P<0.01)和NE水平(P<0.05),有增加DA水平的趨勢;淫羊藿苷高劑量可增加小鼠單胺類神經遞質5-HT,DA,NA水平(P<0.05),淫羊藿苷低劑量有增加模型小鼠單胺類神經遞質水平的趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05),結果見圖2。

圖2 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠腦組織單胺類神經遞質的影響

2.3 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠腦組織IL-6、IL-10水平及海馬區IL-6、IL-10 mRNA的影響

與空白組相比較,模型組小鼠腦組織IL-6水平、IL-6 mRNA表達顯著升高(P<0.05),但IL-10水平、IL-10 mRNA表達僅有升高的趨勢,差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比較,鹽酸氟西汀可降低模型小鼠的腦組織IL-6水平和IL-6 mRNA表達(P<0.01、P<0.05),有增加IL-10水平、IL-10 mRNA表達的趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05);淫羊藿苷高、低劑量可降低IL-6水平、IL-6 mRNA表達(P<0.01、P<0.05),增加小鼠腦組織IL-10水平、IL-10 mRNA表達(P<0.01、P<0.05),結果見圖3。

圖3 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠腦組織IL-6、IL-10水平及海馬區IL-6、IL-10 mRNA的影響

2.4 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠海馬區小膠質細胞表型轉化的影響

與空白組相比較,模型組小鼠腦組織iNOS蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05),CD206蛋白相對表達量僅有升高的趨勢。與模型組相比較,鹽酸氟西汀可降低模型小鼠的腦組織iNOS蛋白相對表達量和iNOS mRNA表達(P<0.01);淫羊藿苷高劑量可降低iNOS蛋白相對表達量(P<0.01),并促進CD206 mRNA表達(P<0.01);淫羊藿苷低劑量可降低小鼠腦組織iNOS蛋白相對表達量和iNOS mRNA表達(P<0.01、P<0.05),升高小鼠腦組織CD206蛋白相對表達量和CD206 mRNA表達(P<0.05),結果見圖4。

圖4 淫羊藿苷對抑郁癥小鼠海馬區小膠質細胞表型轉化的影響

2.5 淫羊藿苷對小膠質細胞(BV-2)表型轉化的影響

根據細胞活力實驗,選取淫羊藿苷高、低劑量(30、15 μg/mL)為適宜的受試濃度;與空白組相比較,模型組細胞iNOS蛋白表達顯著升高(P<0.05),CD206蛋白表達僅有升高的趨勢。與模型組相比較,淫羊藿苷高、低劑量可降低iNOS蛋白表達(P<0.01),并促進CD206蛋白表達(P<0.01)結果見圖5。

圖5 淫羊藿苷對LPS刺激的小膠質細胞(BV-2)表型轉化的影響

3 討論與結論

抑郁癥是嚴重的精神疾患,因發病機制復雜,尚缺乏理想的治療方法。中醫藥在治療抑郁癥方面具有自身特色和優勢[14]。目前,抑郁癥發病機制尚不完全清楚,目前形成的假說主要有:炎性免疫假說,下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸功能紊亂假說,單胺類神經遞質假說,神經營養因子假說等[15,16]。隨著研究的深入,炎性免疫假說受到國內外廣泛關注[17]。研究表明,抑郁癥患者體內不僅存在外周炎性反應,還存在中樞神經系統的免疫激活[18]。小膠質細胞是中樞神經系統中重要的一種免疫細胞,與中樞神經系統炎癥反應密切相關,長期應激狀態下,其結構和功能異常,導致情緒和精神狀態等變化,是抑郁癥發生發展的重要因素[19,20]。

經典激活型(M1型)以及替代激活型(M2型)是小膠質細胞的兩種主要的極化表型[18,21,22]。M1型占活化細胞的絕大部分,可合成與分泌促炎介質TNF-α、IL-1、IL-6和一氧化氮合酶iNOS等,引發免疫炎癥級聯反應;M2型(三種亞型M2a型、M2b免疫表型、M2c失活性表型)可被白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)、白細胞介素13(interleukin-13,IL-13)等刺激產生,釋放抗炎因子IL-10和CD206等,發揮抑制炎癥反應及神經保護功能,在大腦神經修復和可塑性中起著重要作用[23]。動物實驗研究表明,暴露于CUMS的小鼠和大鼠前額葉皮層中的小膠質細胞高度激活并伴隨著相關炎癥介質的高表達,此類炎癥介質可導致與抑郁癥相關的炎癥相關神經元變性[24,25]。一項尸檢結果表明,重度抑郁癥患者前扣帶皮質區及腹側前額葉白質區小膠質細胞密度顯著增加呈現激活狀態,但M2型小膠質細胞典型標志物CD206顯著下調[26]。上述研究提示,小膠質細胞過度活化,M1型和M2型小膠質細胞極化狀態在抑郁癥的發生發展中起重要作用。

本研究發現,在CUMS致抑郁癥小鼠海馬區,促炎細胞因子IL-6水平升高,IL-6 mRNA、iNOS mRNA和iNOS蛋白過度表達并伴隨著抑郁樣行為的增加(強迫游泳不動時間增加,糖水消耗、運動距離減少),提示抑郁癥小鼠海馬區經典激活型M1型小膠質細胞顯著增加。淫羊藿苷一方面可抑制小膠質細胞M1型激活,減少促炎細胞因子IL-6水平,降低IL-6 mRNA、iNOS mRNA和iNOS蛋白過度表達,抑制模型小鼠大腦炎癥反應;另一方面,淫羊藿苷可促進小膠質細胞M2型激活,增加CUMS暴露小鼠海馬區IL-10水平,促進IL-10 mRNA、CD206 mRNA和CD206蛋白表達,從而抑制模型小鼠的抑郁樣行為。體外實驗也表明,在LPS刺激下,小膠質細胞M1型極化增加,淫羊藿苷可抑制小膠質細胞M1型極化,并促進M2型極化。這提示,淫羊藿苷通過調節小膠質細胞表型轉化來減輕過度的神經炎癥。

單胺類神經遞質5-HT、DA、NE代謝紊亂與抑郁癥等神經精神疾病的發生發展密切相關[27]。CUMS致抑郁癥模型大鼠大腦單胺類神經遞質5-HT、DA、NE水平顯著減少,地黃可降低模型大鼠海馬區5-HT、DA和NE水平,改善抑郁癥大鼠的抑郁樣行為[28]。丹參多酚酸能有效改善大鼠抑郁樣行為,可能通過抑制非受體型酪氨酸蛋白激酶2(Janus kinase 2)/信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)信號通路,減輕神經炎癥,調節單胺類神經遞質水平[29]。越來越多的證據開始表明,與壓力相關的情緒可能通過影響單胺氧化酶的活性,激活初級免疫細胞-小膠質細胞?；罨男∧z質細胞誘導許多炎癥因子白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、TNF-α、TGF-β等的釋放,這些炎癥因子可影響單胺類神經元的功能,通過氧化應激誘導單胺能神經傳遞減少,被認為是抑郁癥的重要因素。已證實,單胺能藥物可阻斷小膠質細胞的激活,并以某種方式逆轉抑郁癥[30]。研究發現,四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4)作為抑郁癥公認的標志物,是合成5-HT、DA和NE所需的關鍵酶促輔因子[31],BH4缺失可能會導致抑郁。M1型小膠質細胞可能會導致BH4分解代謝[32],抑制小膠質細胞M1極化可限制BH4的分解代謝,促進單胺類神經遞質的合成和分泌[33]。本研究結果顯示,CUMS致小鼠抑郁模型大腦海馬區單胺類神經遞質減少伴隨著小鼠抑郁樣行為的增加,淫羊藿苷可增加模型小鼠海馬區單胺類神經遞質的水平,可能是淫羊藿苷抗抑郁的作用機制之一,與之前的報道一致。但淫羊藿苷是否通過調控小膠質細胞表型轉化,促進抑郁模型小鼠海馬區單胺類神經遞質合成和分泌,仍有待深入研究。

綜上所述,本研究采用CUMS建立抑郁癥小鼠模型和LPS誘導的小膠質細胞極化模型,發現補腎陽中藥淫羊藿活性成分淫羊藿苷抑制小膠質細胞M1型極化、促進M2型極化,減輕抑郁小鼠海馬區炎癥反應,促進單胺類神經遞質的產生是其抗抑郁的作用機制之一。