基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS、網絡藥理學和實驗驗證探討裸花紫珠抗H1N1活性成分及其作用機制

楊 穎,邵駿菁,許金珂,陳 巖,田景振*,侯 林*

1山東中醫藥大學藥學院,濟南 250355;2山東中醫藥大學 青島中醫藥科學院,青島 266000;3濟寧醫學院基礎醫學院,濟寧 272067;4山東省疾病預防控制中心,濟南 250014

中藥裸花紫珠是馬鞭草科植物裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.& Arn.)的干燥葉。裸花紫珠主要分布于海南、廣西、廣東等地區,道地產區為海南省五指山區[1]。裸花紫珠是2020版《中華人民共和國藥典》唯一新增中藥材,其單方制劑裸花紫珠片和裸花紫珠膠囊被廣泛地用于治療血熱毒盛所致的呼吸道、消化道出血及細菌感染性炎癥。植物化學家已經從裸花紫珠中鑒定出300余種化合物,包括苯丙素類、黃酮類、三萜類、二萜類、環烯醚萜類、揮發油類等[1-4]?，F代藥理學研究證實裸花紫珠具有抗炎、抗血栓、抗腫瘤、抗菌和保肝等活性[5-9]。在篩選具有抗病毒活性的中藥的過程中,發現裸花紫珠提取物具有良好的抗病毒(如甲型流感病毒H1N1型(H1N1)、腸道病毒71型等)活性[10,11]。甲型流感病毒感染是肺炎相關死亡病例的常見病因。嚴重的甲型流感病毒感染會引起雙側肺部浸潤和低氧血癥,即急性呼吸窘迫綜合征,是甲型流感病毒導致死亡的主要原因之一[12,13]。本實驗圍繞裸花紫珠的抗H1N1活性展開,利用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱聯用(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)對裸花紫珠有效部位的化學成分進行鑒定,利用網絡藥理學對裸花紫珠抗H1N1的作用機制進行預測,并進行實驗驗證,初步探討裸花紫珠抗H1N1的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

中藥裸花紫珠由江西普正藥業股份有限公司提供,經吳永忠研究員鑒定為馬鞭草科植物裸花紫珠Callicarpanudiflora的干燥葉,標本存放于青島中醫藥科學院藥庫,標本號為QKY221104。

磷酸奧司他韋顆粒(批號0582201015,廣東東陽光藥業股份有限公司);DMEM細胞培養液、胎牛血清、細胞消化液(EDTA-0.25%胰酶)、PBS、雙抗、Opti-MEM培養基均為Gibco品牌(批號分別為812207、10270-106、2323363、BYHC1713、HYT11280 746、31985070);TPCK胰蛋白酶(Sigma,批號T8802)。

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(分析純,科隆化學試劑有限公司);異氟烷(易弗寧,批號20220202);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、血清免疫球蛋白G(IgG)、白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,批號均為11/2021);標準品毛蕊花糖苷、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、金圣草(黃)素和異槲皮苷采購自上海源葉(批號分別為Y21A9H59554、H25M6L1、Y25O8C46530、Y05D8H4 9919、Y10J11W118163、P25J9F65872,純度均為>98%);柚皮素、木犀草素、槲皮素、齊墩果酸購自大連美侖(批號分別為M0506AS、M0525AS、01023AS、D0701AS,純度均為>98%)。

TIANamp Virus DNA/RNA Kit(北京天根生化科技有限公司,W0229);BeyoFast-SYBR Green One-Step實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)Kit(上海碧云天生物技術有限公司,批號:110821220208);H1N1引物F:5′-GTATGGACCTGCCGTAGC-3′,R:5′-GCTTCCACCAGGGTTCTC-3′;GA PDH引物F:5′-GGATGCTGCCCTTACCC-3′,R:5′-GTTCACACCGACCTTCACC-3′(北京擎科生物科技股份有限公司)。

1.2 細胞與病毒

犬腎細胞(MDCK細胞,作為H1N1的宿主)、H1N1(病毒株為A/Puerto Rico/8/1934),均由山東省醫學科學院提供。

1.3 動物

6周齡BALB/c雌性小鼠50只,體重15～18 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物合格證號SCXK(京)2021-0006,實驗單位動物使用許可證號SYXK(魯)2017-0022。本研究在山東中醫藥大學動物護理使用專業委員會(山東濟南,倫理審批號:SDUTCM20220415022)的監管下進行。

1.4 主要儀器

超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱聯用儀(賽默飛世爾科技公司,Thermo Fisher Ultimate 3000型及Q Exactive型);質譜工作站(賽默飛世爾科技公司,Xcalibur 3.0型);小動物麻醉機(瑞沃德,R500IR);十萬分之一天平(賽多利斯,CPA225D);低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司,SC-3610);生物安全柜、CO2培養箱均采購自上海力申科學儀器公司(型號分別為HFsafe-1200TE、HF90);酶標儀(Bio Tek,EPOCH2T);倒置顯微鏡(OLYMPUS CKX41);Real-time PCR儀(瑞士ROCHE公司,Light Cycler 480 Ⅱ型)。

1.5 實驗方法

1.5.1 裸花紫珠不同萃取物的制備

取適量裸花紫珠藥材,粉碎,過40目篩,浸泡30 min,依次用8倍量的95%乙醇、75%乙醇和水進行提取,每種溶劑提取2 h,合并三種溶劑的提取液,濃縮至1 g/mL。依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,每種試劑萃取三次。合并萃取液,旋轉蒸發至稠浸膏狀,烘干,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和萃余水四種萃取物。

1.5.2 體外抗病毒活性研究

將不同濃度的上述四種萃取物和磷酸奧司他韋接種至MDCK細胞,培養48 h。利用MTT試劑盒檢測四種萃取物和磷酸奧司他韋對MDCK細胞的50%細胞毒濃度(CC50)。選擇細胞存活率大于90%的最大藥物濃度作為藥物的非細胞毒濃度。H1N1感染MDCK細胞的過程是在含有1 000 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和2 μg/mL TPCK-胰酶的Opti-MEM培養基中進行。取96孔板,每孔接種濃度為1×105細胞/mL的細胞懸液100 μL,培養24 h(37 ℃,5% CO2)。將細胞板棄去細胞培養液且用PBS清洗兩次,每孔分別加入100 μL不同濃度的各個萃取物或磷酸奧司他韋溶液和100 μL H1N1病毒稀釋液(由TCID50為1×106的病毒原液稀釋100倍得到)。培養48 h后用MTT試劑盒檢測細胞存活率,并按照Reed-Muench法計算四種萃取物和磷酸奧司他韋對H1N1的半數抑制濃度(IC50)[14,15]。同時計算選擇指數(SI,CC50/IC50)用來判斷藥物效果的安全范圍,SI越大安全范圍越大。

1.5.3 化學成分分析

1.5.3.1 混合對照品溶液和樣品溶液的制備

用甲醇溶解適量的對照品包括毛蕊花糖苷、阿魏酸、咖啡酸、木犀草苷、金圣草(黃)素、異槲皮苷、柚皮素,木犀草素、槲皮素和齊墩果酸,然后轉移至10 mL容量瓶中,加甲醇至刻線,搖勻。在12 000 r/min的條件下離心5 min,用0.22 μm的微孔濾膜過濾,得到混合對照品溶液。

精密稱取裸花紫珠乙酸乙酯萃取物(the ethyl acetate extraction part ofCallicarpanudiflora,EACN)0.1 g,加甲醇溶解后轉移至容量瓶,繼續加甲醇定容至10 mL,搖勻。在12 000 r/min的條件下離心5min,用0.22 μm的微孔濾膜過濾,得到樣品溶液。

1.5.3.2 色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%乙酸水(B),梯度洗脫:0～35 min,5%→21% A;35～40 min,21%→26% A;40～45 min,26%→35% A;45～50 min,35%→55% A;50～55 min,55%→75% A;55～60 min,75%→85% A。流速:0.3 mL/min;柱溫箱溫度:35 °C;進樣體積:5 μL。

1.5.3.3 質譜條件

正離子模式的噴霧電壓設置為3 500 V,負離子模式為3 000 V;毛細管溫度350 ℃,輔助氣體加熱器溫度350 ℃;掃描方式:全MS(分辨率70 000)和MS/MS(分辨率17 500)。掃描范圍:M/z 80-1 200;階躍歸一化碰撞能量為20、40和60 eV。UPLC-Q-Orbitrap-MS的儀器控制、數據采集和分析使用Xcalbur軟件3.0(Thermo Fisher,CA,USA)進行。對于不能用對照品標出的化合物,根據數據庫MassBank(https://massbank.eu/)、FooDB數據庫(https://foodb.ca)和文獻數據[2,16]中的高精度準分子離子、同位素分布和碎片模式進行了初步鑒定。

1.5.4 EACN中化學成分相關靶點和H1N1相關靶點的獲取

為了獲取EACN中化學成分的靶點,我們利用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)[17,18],逐個檢索表1中的化學成分。在PubChem數據庫中將“activity”設置為“active”,“taxids”設置為“9606”,在Swiss Target Prediction數據庫中設置篩選條件為“homo spines”,Probability*>0.05。合并兩個數據庫篩選的結果并通過UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)將靶標轉換為基因符號。H1N1的相關靶點來自于GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/)和OMIM數據庫(https://omim.org/)三個數據庫[19,20]。利用Venny 2.1版平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲取“H1N1”相關靶點與EACN相關靶點交集。

表1 EACN中鑒定出的化學成分

1.5.5 GO、KEGG富集分析和網絡的構建

將活性成分與H1N1的重疊靶點導入至Metascape平臺(http://www.metascape.org/)進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析,探討藥物作用的生物學過程,描述基因靶點的功能,包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC);同樣對上述基因進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,探討藥物作用的生物通路,得到潛在靶點所富集的信號通路。GO和KEGG富集分析條件均為P<0.05,最小count為3。富集結果通過在線可視化平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化。利用Cytoscape 3.6.0對藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡進行可視化,字體的大小按照度值進行展示,度值越高的節點,字體越大。

1.5.6 EACN體內抗H1N1研究

將小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為空白對照組(control,Con)、模型對照組(model,Mod),磷酸奧司他韋組(oseltamivir phosphate,OP,1.25 mg/mL),EACN高劑量組(EACN-H,7.8 mg/mL)、EACN低劑量組(EACN-L,3.12 mg/mL)。適應性飼養3 d后,利用小動物麻醉機對小鼠進行麻醉,每只小鼠滴鼻給予20 μL H1N1病毒稀釋液,空白對照組滴鼻給予等體積PBS,2 h后灌胃給藥(0.2 mL/只),每天稱定小鼠體重。在給藥6 d后,利用小動物麻醉機對小鼠進行麻醉,并使得小鼠在規定時間內安樂死,采集外周血并摘取肺組織,稱定質量,計算肺指數(肺指數=肺質量/小鼠體質量×100%)。將肺組織分為兩份,一份用4%甲醛固定,經脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片、烘干后進行HE染色以觀察肺部病變。另一份肺組織經組織勻漿并離心后,上清液用TIANamp Virus DNA/RNA Kit提取病毒RNA,并利用BeyoFastTMSYBR Green One-Step Real-time PCR Kit對提取到的RNA進行反轉錄和擴增。將小鼠外周血置于EP管中,4 ℃下過夜后在4 ℃、3 000 r/min條件下離心20 min,取上清,ELISA法檢測血清TNF-α、IFN-γ、IgG、IL-1β水平。

2 實驗結果

2.1 裸花紫珠抗H1N1有效萃取部位的篩選

體外實驗結果顯示,作為陽性對照,磷酸奧司他韋對MDCK細胞的CC50為565.8 μg/mL,對H1N1的IC50為45.01 μg/mL,選擇指數(SI)為12.57(見圖1)。正丁醇、乙酸乙酯和石油醚三個萃取部位對MDCK細胞的CC50分別為1 280.0、859.4、71.5 μg/mL。正丁醇、乙酸乙酯和石油醚三個萃取部位對H1N1的IC50分別為270、51、7.23 μg/mL,SI分別為4.74、16.85、9.9(見圖2～4),萃余水部位沒有明顯的抗H1N1的活性,因此未對萃余水部位抗H1N1活性進行可視化。由實驗結果可知,乙酸乙酯萃取部位有良好的抗H1N1活性且對MDCK細胞的毒性較低,因此將此部位認為是中藥裸花紫珠的最佳活性部位。進一步對EACN的化學成分進行定性分析。

圖1 磷酸奧司他韋體外抗H1N1活性

圖2 正丁醇萃取物體外抗H1N1活性

圖3 乙酸乙酯萃取物體外抗H1N1活性

圖4 石油醚萃取物體外抗H1N1活性

2.2 化學成分分析

采用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術對EACN化學成分進行表征。EACN在正負離子模式下的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)見圖5～8。共鑒定出34個化合物(見表1和圖9),包括14個苯丙酸及其苷類,15個黃酮及其苷類,2個香豆素,2個三萜,1個苯乙醇苷類。通過與混合標準品的保留時間和裂解規律對比確定了表1中的化合物4、8、10、14、24、25、27、30、31、33分別是咖啡酸、異槲皮苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、柚皮素、金圣草(黃)素、異鼠李素和齊墩果酸。其余化合物是根據分子離子峰和其他碎片離子的特性以及裂解規律等,參考MassBank(https://massbank.eu/)、FooDB數據庫(https://foodb.ca)和文獻數據[2,16]進行初步的定性。

圖5 EACN在負離子模式下的總離子流圖

圖6 EACN在正離子模式下的總離子流圖

圖7 混合對照品在負離子模式下的總離子流圖

圖8 混合對照品在正離子模式下的總離子流圖

圖9 EACN中化學成分的結構式

2.3 網絡藥理學分析

2.3.1 活性成分靶點預測

口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18經常被作為篩選藥物活性成分的條件[21]。我們在篩選過程中發現如咖啡酸(OB=54.97%,DL=0.05)、阿魏酸(OB=39.56%,DL=0.06)和毛蕊花糖苷(OB=2.94%,DL=0.62)等化合物不符合上述篩選條件,但已有文獻證明這些化合物能通過抑制病毒復制、抑制神經氨酸酶的活性、降低甲型流感引起的炎癥反應等途徑發揮抗甲型流感的作用[22-24]。因此本實驗不將OB值和DL值作為篩選條件。共檢索得到466個藥物靶點和1 225個H1N1相關靶點。使用Venny2.1版平臺將藥物相關目標與疾病相關目標交叉得到67個共同靶點(見圖10),這些交叉靶點對應除1-O-咖啡酰-(6-O-L-吡喃鼠李糖基)-吡喃葡萄糖苷、金圣草(黃)素-7-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮蕓香苷、parvifloroside B以外的29個成分。

圖10 成分靶點與疾病靶點韋恩圖

2.3.2 GO和KEGG富集分析

采用Metascape數據庫對得到的67個靶點進行GO和KEGG富集分析,得到491個GO條目,包括生物學過程BP條目360個,細胞組分CC條目56個,分子功能MF條目75個,按照P值進行從小到大排序,各選取前十個條目進行可視化(見圖11)。得到17個注釋聚類的147個KEGG通路,刪除明顯與H1N1無關的抗癌通路、糖尿病通路等,按照P值從小到大排序,選前25個條目作為核心通路進行可視化(見圖12)。結果表明GO條目中與治療H1N1有關的生物學過程包括蛋白質磷酸化的正調控(GO:0001934),氧化應激反應(GO:0006979)等;有關的細胞組分包括囊泡腔(GO:0031983),分泌顆粒腔(GO:0034774);有關的分子功能包括激酶結合(GO:0019900),生長因子受體結合(GO:0070851)。

圖11 GO富集分析

圖12 KEGG富集分析

與H1N1相關的KEGG通路主要可以分為炎癥、免疫調節,病毒三個模塊,核心通路中,與炎癥相關的通路包括IL-17信號通路(hsa04657),NF-κB信號通路(hsa04064)等;與免疫調節有關的通路包括T細胞受體信號通路(hsa04660),Th1和Th2細胞分化(hsa04658)等,與病毒相關的通路包括甲型流感病毒通路(hsa05164)等。提示EACN抗病毒是一個多途徑的作用。

2.3.3 藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡分析

為了闡明EACN治療H1N1感染的潛在機制,我們利用Cytoscape v3.6.0軟件構建了藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡(見圖13),三角形代表裸花紫珠,箭頭代表基因符號,六邊形代表成分,正方形代表通路,菱形代表H1N1。通過網絡分析發現度值最高的靶點RELA(degree=32),NF-κB1(degree=31)都屬于NF-κB家族,在炎癥反應、免疫應答等過程都發揮了重要作用。有22個活性成分都與MMP2(degree=24)相連,但是在展示出的25個通路中,MMP2只存在于白細胞跨內皮遷移中,提示EACN抗H1N1的一個重要潛在機制可能是調節白細胞的跨膜遷移。有19個化合物通過11個靶點作用于甲型流感病毒通路。藥物通過作用于PLG(對應Plasmin)和PRSS1(對應Trypsin)影響H1N1的M2通道影響病毒的脫殼過程,還可以通過PLG作用于神經氨酸酶途徑影響病毒的釋放過程。提示PLG和PRSS1可能是EACN直接作用于H1N1的關鍵靶點。

圖13 藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡

2.4 動物實驗驗證

KEGG富集分析結果顯示,EACN能通過抑制病毒增殖作用、抗炎作用和免疫調節等多個途徑發揮抗H1N1感染的作用。我們用H1N1感染BALB/c小鼠實驗對預測結果進行了實驗驗證。

在感染H1N1后的第四天,Mod組小鼠體重急劇降低,并至第六天持續降低,而與Mod組相比,EACN-H、EACN-L和OP均能抑制小鼠體重的下降趨勢(見圖14)。我們檢測了H1N1病毒感染小鼠肺組織中H1N1的相對表達水平,RT-PCR檢測顯示,Mod組小鼠肺病毒載量顯著高于Con組(P<0.001)。OP、EACN-H和EACN-L能不同程度地降低H1N1在小鼠肺組織中的表達水平(見圖15)。這些結果說明,EACN抑制了H1N1在小鼠肺組織的增殖。機體在清除病毒的過程中會對肺組織造成炎癥損傷,肺部炎癥浸潤會引起小鼠肺指數增加(見圖16),與Mod組相比,OP、EACN-H和EACN-L能顯著降低小鼠的肺指數。病理切片結果顯示(見圖17),與Mod組相比,OP、EACN-H和EACN-L能減輕小鼠肺組織的炎癥損傷。促炎細胞因子的過度表達增加了流感病毒的致病性,ELISA實驗結果顯示(見圖18),Mod組小鼠血清中的炎癥因子包括IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量均顯著高于Con組小鼠。與Mod組比較,EACN和OP治療后小鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量均顯著降低。我們認為EACN組炎癥因子含量的減少有助于減輕感染H1N1小鼠的炎性損傷。

圖14 小鼠體重變化

圖15 H1N1感染小鼠肺組織病毒載量

圖16 肺指數

圖17 肺組織病理切片

圖18 小鼠外周血血清中IFN-γ、IL-1β、TNF-α和IgG的水平

IgG主要存在于人體血清中,占血清中免疫蛋白總量的75%,機體在流感病毒刺激下產生的抗體主要以IgG為主[25]。因此我們還檢測了小鼠血清中IgG的水平(見圖18)。Mod組小鼠的血清水平低于Con組小鼠但是不具有顯著性,而EACN-H組小鼠的血清IgG水平顯著高于Mod組(P<0.1)。由此提示EACN對H1N1感染小鼠有一定的免疫調節作用。綜上所述,我們初步證明了EACN能通過抑制病毒增殖作用、抗炎作用和免疫調節等多個途徑發揮抗H1N1感染的作用。

3 討論與結論

甲型流感病毒對現在常用的M2通道抑制劑和NA抑制劑都產生了不同程度的耐藥性。因此,尋找新的抗甲型流感的藥物或者治療方法已經成為亟待解決的問題。中醫藥在甲型流感病毒的臨床治療中發揮了重要作用[26,27]。中醫理論中的整體觀念將病人作為一個有機整體進行系統地調控,而網絡藥理學通過構建藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡,探索網絡各節點生物功能與疾病的互作關系與中醫的整體觀具有一致性[28]。本實驗首先篩選了中藥裸花紫珠的主要抗H1N1的活性部位,并對該部位進行分析,鑒定得到34種化學成分。結合文獻和數據庫,得到藥物與疾病的67個重疊靶點。通過交叉靶點的富集分析,我們推測EACN抗H1N1的重要生物過程可能是正向調節蛋白質磷酸化,對氧化應激的反應。KEGG富集分析結果發現,EACN中有19個化合物通過11個靶點作用于甲型流感病毒通路。藥物通過作用于PLG和PRSS1影響H1N1的M2通道影響病毒的脫殼過程,還可以通過PLG作用于神經氨酸酶(NA)途徑影響病毒的釋放過程。提示PLG和PRSS1可能是EACN直接作用于H1N1的關鍵靶點,EACN能通過影響H1N1的脫殼過程和釋放過程,抑制H1N1的增殖。在藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡中,RELA和NF-κB1是度值最高的兩個靶點,它們所在的NF-κB信號通路能促進IL-1β、TNF-α、IL-6等因子的表達而促進炎癥反應,提示EACN可能能夠作用于RELA和NF-κB1等關鍵靶點調節NF-κB信號通路等減輕炎癥對機體的損傷。根據網絡藥理學預測的結果,EACN能調節T細胞信號通路,影響Th1和Th2分化等發揮免疫調節作用。因此本研究對EACN抑制H1N1增殖作用、抗炎作用和免疫調節作用進行動物實驗驗證。實驗結果發現EACN能改善H1N1感染引起的體重的降低和肺指數的增加,降低小鼠肺組織的病毒載量,減輕小鼠肺組織的病理損傷,降低外周血血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平,增加血清抗體IgG的水平。本研究首先利用體外實驗篩選出裸花紫珠抗H1N1的活性萃取部位,并利用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS和網絡藥理學對EACN抗H1N1的活性成分進行了預測,并對預測結果進行了動物實驗驗證,篩選出了EACN抗H1N1的潛在活性成分包括槲皮素、楊梅素、木犀草素、山柰酚、金圣草(黃)素、芹菜素和金合歡素等,初步證明了裸花紫珠能從直接抑制病毒、抗炎作用和免疫調節作用等多個途徑發揮抗H1N1的作用。在后續的實驗中,需要對篩選出的單體化合物進行體內外實驗驗證,在mRNA和蛋白水平上進一步研究EACN抗H1N1的作用機制。