基于網絡藥理學和實驗驗證研究檸檬精油緩解焦慮癥的作用機制

張依萍,徐 旭,呂億婷,黃金琴,王盛東,奚林芝,王丹丹,劉 暢

1浙江萬里學院生物與環境學院,寧波 315100;2寧波大央科技有限公司,寧波 315020

焦慮癥是一種以暫時性或持續性情緒緊張為主要臨床癥狀,并伴有自主神經紊亂、運動障礙等癥狀的神經癥,也是一種心情不愉快并且伴隨身體不適的精神類疾病[1]。近些年,人們的生活、學習和工作壓力不斷增加,使得抑郁癥和焦慮癥患病率大幅度提升。據統計,全世界患有抑郁癥的人數占3.01%～5.00%、患有焦慮癥的人數占4.00%～6.50%[2]。目前,治療抑郁和焦慮的藥物主要是艾司西酞普蘭、文拉法辛、苯二氮卓類等西藥,但其副作用大、依賴性強、用藥周期長,給患者身體帶來了一定的傷害。

焦慮癥治療除了藥物治療和心理治療外,芳香療法被認為是一種有效的輔助治療手段[3]。植物精油有一系列的藥理特性,包括抗焦慮、抗抑郁、鎮靜安神、神經保護作用等藥理活性,許多動物和人類研究都支持使用香氣及其成分來減少焦慮相關癥狀行為[4]。佛手、甜橙、香紫蘇、檸檬草和薰衣草等植物精油,通過嗅吸或按摩方法對焦慮癥狀改善有積極的效果且未出現任何不良反應[5]。薰衣草精油中富含的芳樟醇、玫瑰精油中富含的香葉醇均在舒緩焦慮方面有作用[6]。研究發現,從檸檬果皮中提取的檸檬精油可以改善情緒、認知、緩解疲勞,可防止考試焦慮期間的認知能力下降[7];嗅吸檸檬精油(lemon essential oil,LEO)可顯著升高人體腦電波的β波[8]。Martial等[9]采用行為試驗研究了檸檬精油蒸汽對小鼠的抗應激作用,發現吸入檸檬精油后的小鼠在高架迷宮和開放場地測試中都有抗焦慮作用。?zer等[10]研究了大鼠持續暴露于擴散的檸檬精油氛圍的行為、激素和神經元反應,發現大鼠在抬高加迷宮張開臂中花費的時間減少、熱傷害閾值提高、福爾馬林誘導的疼痛行為降低,下丘腦和中腦導水管周圍灰質中的皮質酮濃度降低,表明LEO會導致與焦慮和疼痛有關的神經元回路發生顯著變化。但是LEO是多種成分的混合物,具有“多成分、多靶點”的特點,對其抗焦慮癥的作用機制尚未得到很好的闡明。

網絡藥理學是將藥物作用網絡與生物網絡相結合,基于“藥物-靶點-通路-疾病”模型,分析藥物與生物體之間的相互作用,系統地探討藥物與疾病之間的關系[11,12]。本研究基于網絡藥理學方法,對檸檬精油抗焦慮的關鍵成分、靶點和信號通路進行預測分析,并結合系列實驗(抗氧化活性、細胞炎癥和小鼠焦慮模型)對網絡藥理學篩選出的檸檬精油中的關鍵成分、作用靶標進行驗證,為檸檬精油抗焦慮的臨床應用提供理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

材料:新鮮檸檬購于寧波果品批發市場,經由浙江萬里學院劉利萍教授鑒定確認;乙酸橙花酯(批號PPE8F-RN,東京化成工業株式會社,純度≥98%)。

試劑:CCK-8試劑盒(批號23131244,Biosharp);活性氧熒光法測試盒(批號UX030F603865,Elabscience);TNF-αELISA試劑盒(批號GY01X64 D0991,Elabscience);IL-6ELISA試劑盒(批號GY012R225072,Elabscience);NO含量檢測試劑盒(批號20220718,索萊寶);DPPH(批號GTBXB-QP,上?；晒I發展有限公司);ABTS(批號C14003395,麥克林);DMEM細胞培養液(批號2204025,Viva Cell);胎牛血清(批號2011B,BOVOGEN);小鼠多巴胺受體D1 ELISA試劑盒(批號CV04TR4B0207,武漢伊萊瑞特);小鼠AMPA離子能谷氨酸受體2酶聯免疫試劑盒(批號E220ER059,武漢菲越生物);小鼠白細胞介-素6高敏ELISA試劑盒(批號70-EK206HS-96,聯科生物);蘇木精(批號SLBN3249V,SIGMA);伊紅(批號62R80915X,SIGMA)。

細胞:HaCaT人永生化表皮細胞(批號339817,北納創聯生物技術有限公司)。

動物:25只ICR小鼠(SPF級),雌性,體質量18～22 g,購自上海斯萊克實驗動物公司,動物合格證號SCXK(滬)2022-0004。飼養于杭州赫貝科技有限公司,實驗動物住所許可編號SYXK(浙)2020-0013,在溫度20～25 ℃、濕度40%～70%,12 h光暗周期,自由進食(江蘇協合藥業生物工程有限公司提供飼料)飲水。操作符合動物實驗3R原則和動物實驗倫理要求(經杭州赫貝科技有限公司動物實驗中心審批,審批號為HB2301006)。

儀器:氣相色譜-質譜聯用儀(8890-5977B,安捷倫);紫外可見分光光度計(TU-1810,北京普析通用儀器公司);高速離心機(5417R,艾本德);霧化機(405E,魚躍);病理組織漂烘儀(TEC 2500 型,常州市郝思琳儀器設備有限公司);輪轉式切片機(RM2235 型,LEICA 公司);顯微鏡(BX43型,OLYMPUS);全波長酶標儀(SpectraMax Plus 384型,美國MD);恒溫培養箱(PYX-DHS500BS-Ⅱ型,上海躍進醫療器械公司)。

1.2 檸檬精油活性成分及對應靶點篩選

采用水蒸氣蒸餾法提取檸檬果皮精油,氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)測定檸檬精油的組成,以血腦屏障(blood brain barrier,BBB)>0.3為篩選條件,獲得檸檬精油中的主要活性成分。利用中醫藥系統藥理學平臺(TCSMP)預測活性成分的作用靶點,并用Uniprot數據庫對靶點蛋白進行規范化。利用Cytoscape構建“檸檬精油-成分-靶點”網絡圖。

1.3 焦慮癥靶點的收集

以“anxiety”和“anxiety disorder”為關鍵詞,檢索OMIM、GeneCards數據庫,從GeneCards數據庫取3次中位數,收集大于中位數的靶點為焦慮癥的潛在靶點。合并數據庫靶點,刪除重復值,得到焦慮癥靶點。

1.4 檸檬精油-焦慮癥的共同靶點獲取及蛋白質互作網絡構建

利用Venny軟件和微生信網站中的可視化工具獲取檸檬精油與焦慮癥的共同靶點。將二者的共同靶點輸入STRING數據庫構建蛋白互作網絡(PPI),其中物種設為“Homo sapiens”,置信度≥0.15,隱藏網絡中無聯系的節點,利用Cytoscape軟件可視化。以度值評估靶點的重要性,預測關鍵靶點。

1.5 靶點功能富集分析與網絡構建

利用David數據庫對共同靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析,GO選擇生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個模塊。KEGG分析選擇KEGG Pathway模塊。采用Cytoscape軟件,以排行前20條通路及其涉及的交集靶點,以及這些靶點映射的活性成分構建“檸檬精油-成分-靶點-通路-焦慮癥”網絡。

1.6 關鍵化合物及核心靶點的分子對接

在PubChem數據庫下載關鍵化合物分子結構的SDF格式,通過Open babel將SDF格式轉化為mol2格式;通過RCSB PDB數據庫得到核心靶點的最佳蛋白結構的PDB格式。利用1-Click Docking對活性成分與關鍵靶點進行分子對接,并用Pymol軟件對分子對接結果進行可視化。

1.7 清除自由基活性

在試管中加入4 mL DPPH或ABTS工作液與1 mL樣品混勻,暗置反應30 min,以95%乙醇調零,在518 nm或734 nm處測吸光值(A值)。以定容樣液溶劑代替樣液作為空白組,以VC作陽性對照組。重復平行3次,按公式(1)計算自由基清除率(RC)。

RC=[(A1-A2)/A1]×100%

(1)

式中,A1為以樣液溶劑代替樣液測得的吸光度,A2為測定的樣品的吸光度。

1.8 細胞活性

細胞活性:收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度至1×104個/孔,過夜,加入100 μL濃度為0(正常組,Nor)、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL的樣品液,培養24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續孵育4 h,在450 nm測定吸光值(A值)。按公式(2)計算細胞相對生長率(RG)。

RG=[(A1-A2)/A1]×100%

(2)

式中,A1為正常生長的細胞的吸光度,A2為加入測定的樣品的吸光度。

1.9 抗氧化及抗炎活性的測定

抗細胞氧化活性[13]:將對數生長期細胞按2×105個/孔接種到6孔培養板中。置培養箱中培養24 h。設置3個組:空白對照組(control,Con),只加2 mL培養基;模型組(model,Mod),加入2 mL含20 μg/mL LPS的培養基;樣品組,為3個劑量(0.25、0.5、1 μg/mL)且LPS的終濃度為20 μg/mL。繼續培養24 h后,收集上清液,離心去除殘留細胞。加入無血清培養基按1∶1 000稀釋DCFH-DA,37 °C孵育30 min。用無血清培養基洗滌細胞三次以去除DCFH-DA。用熒光酶標儀檢測(激發波長500 nm、發射波長525 nm)各組熒光值,并與空白對照組對比。

抗炎活性:按上述收集的細胞上清液,根據ELISA試劑盒說明書分別測定NO、TNF-α及IL-6細胞因子水平。

1.10 小鼠水迷宮實驗

小鼠分組與給藥:小鼠適應性飼養7 d后,隨機分組,每組5只,設立空白對照組(control,Con)、模型組(model,Mod)、奧沙西泮陽性組(Positive,Pos)(用生理鹽水配成100 μg/mL藥液,按照10 mL/kg灌胃給藥)、精油組(LEO)(用純凈水配成5%精油霧化液,每天同一時間段給予小鼠持續吸入霧化精油30 min,持續3周)、乙酸橙花酯單體組(neryl acetate,NA)(濃度5%,同精油組)。

小鼠焦慮模型建立:對照組小鼠正常飼養不采取任何刺激,其余四組均采用慢性不可預知應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)方法造模刺激[18]。隨機設置7種刺激,每天2種,每種刺激出現6次,分別是:冰水游泳(4 ℃,5 min)、熱應激(45 ℃,5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、夾尾(1 min)、斜坡飼養、潮濕墊料(24 h),共計21 d。

水迷宮測試:21 d刺激后進行,(1)定位航行:共5 d,每天同一時間開始,測試四次。將小鼠頭朝向池壁輕輕地放在水里,從進入水里到發現平臺為逃避潛伏期,時限為2 min,2 min后發現平臺,小鼠在平臺上逗留15 s;如果2 min后小鼠沒有發現該平臺,那么將小鼠引到該平臺上待30 s。(2)空間探索:第6 d,撤去隱藏在水面下的平臺,選擇與平臺相對的象限中點作為入水點,記錄小鼠在2 min內穿越平臺的次數及在平臺象限的總時間。

海馬HE染色(hematoxylin-eosin staining)觀測:小鼠麻醉后開顱取海馬,海馬用體積分數4%多聚甲醛固定24 h,經脫水、透明、石蠟包埋后切片,HE染色,光鏡(×400)觀察海馬區狀態。

紋狀體中相關蛋白的ELISA測定:小鼠麻醉后開顱取紋狀體(液氮凍存),稱取樣品適量,按照試劑盒說明書的步驟檢測小鼠腦紋狀體中DRD1、GRIA2及IL6含量。

1.11 數據處理

2 結果

2.1 檸檬精油化學成分

檸檬精油的成分歸屬及鑒定信息的總離子流圖(見圖1)。由GC-MS鑒定出檸檬精油有30種成分,相對百分含量>1%的化合物有26種,占總峰面積的94.94%,含量最高的組分是β-紅沒藥烯,占比最高的成分為萜烯類化合物。檸檬精油以嗅吸方式給藥,符合BBB篩選條件的成分有23種(見表1)。

表1 檸檬精油的有效成分

圖1 檸檬精油的總離子流圖

2.2 “檸檬精油-成分-靶點”網絡圖

22種成分均有對應的靶點共計76個(見圖2)。該網絡中總節點度值為249,平均節點度值為11.32,大于平均值的有11個,分別是香葉醇、檸檬烯、巴倫西亞橘烯、亞油酸、乙酸橙花酯、異松油烯、β-石竹烯、β-蒎烯、α-萜品醇、甲基丁香酚、4-萜品醇。這11個成分可能起到重要作用。

圖2 “檸檬精油-成分-潛在靶點”網絡圖

2.3 “檸檬精油-焦慮癥”的交集靶點及蛋白質互作網絡圖

從GeneCards和OMIM數據庫中篩選焦慮癥靶點,經除重和標準化,獲得焦慮癥靶點787個。將檸檬精油成分靶點和焦慮癥疾病靶點作韋恩圖,二者有23個共同靶點(見圖3)。

圖3 檸檬精油-焦慮癥交集靶點的韋恩圖

23個交集靶點的蛋白互作(見圖4)。String分析顯示平均節點度值為16.2,大于平均值的節點有12個,它們是:白蛋白(ALB)、多巴胺受體D1(DRD1)、5-羥色胺受體2A(HTR2A)、溶質載體家族6成員4(SLC6A4)、溶質載體家族6成員3(SLC6A3)、γ-氨基丁酸A型受體亞基alpha2(GABRA2)、白細胞介素6(IL6)、肌動蛋白β(ACTB)、單胺氧化酶A(MAOA)、5-羥色胺受體3A(HTR3A)、AMPA離子能谷氨酸受體2(GRIA2)、單胺氧化酶B(MAOB)。這12個蛋白可能為核心靶點。

圖4 交集靶點的PPI拓撲圖

2.4 GO富集分析

以P<0.05篩選得到BP 38項、CC 19項、MF 18項。選取-log10(P)值大小排序前12項得到GO條形圖(見圖5)。

圖5 檸檬精油干預焦慮癥的核心網絡靶點的GO分析條形圖

GO富集結果表明:生物過程(BP)中交集靶點主要涉及了給藥反應、離子跨膜運輸、多巴胺分解代謝過程、單胺運輸等過程;細胞組分(CC)中關鍵靶點主要分布于質體膜、突觸后膜、漿膜的整體組成部分、細胞交界處等部位;分子功能(MF)中關鍵靶點主要與細胞外配體門控離子通道活性、單胺跨膜轉運器活性、藥物結合、一氧化二氮合成酶結合等有關。

2.5 KEGG通路富集分析

以P<0.05為標準,共富集獲得31條KEGG通路,其中前20條KEGG通路(見圖6)。X軸為通路中關鍵基因數占比,Y軸為通路名稱;氣泡顏色即-log10(P)值,顏色越紅,P值越小,富集程度越好;氣泡大小表示參與通路的基因數的多少。

圖6 檸檬精油干預焦慮癥核心靶點的KEGG通路富集氣泡圖

20條通路中包括神經活性配體-受體相互作用、羥色胺能突觸、尼古丁成癮、多巴胺能突觸、可卡因成癮、安非他命成癮等,所含交集靶點的數目相對較多,可能是檸檬精油抗焦慮癥的關鍵通路。

2.6 “檸檬精油-成分-靶點-通路-焦慮癥”拓撲網絡

前20條KEGG通路中涉及交集靶點有18個,占交集靶點總數的78.26%。將這20條KEGG通路、18個交集靶點以及涉及的檸檬精油的19個活性成分進行聯合分析,得到的網絡(見圖7)。

圖7 “檸檬精油-活性成分-靶點-通路-疾病”網絡

該網絡中有57個節點,其中,檸檬烯、α-松油醇、甲基丁香酚、β-蒎烯、乙酸橙花酯、β-石竹烯、4-萜品醇的度值較大,表明是作用于焦慮癥的重要活性成分。γ-氨基丁酸A型受體亞基(GABRA1、GABRA2、GABRA5)、單胺氧化酶(MAOB、MAOA)、溶質載體家族6(SLC6A3、SLC6A2)、多巴胺受體D1(DRD1)、AMPA離子型谷氨酸受體亞基2(GRIA2)、白細胞介素6(IL-6)等靶點的度值較大,可能是檸檬精油參與調控焦慮癥的重要靶點。

2.7 分子對接

根據“2.6”項,選取檸檬烯、β-蒎稀、4-萜品醇、α-松油烯、乙酸橙花酯與DRD1、GRIA2、IL-6蛋白進行分子對接(見表2)。

表2 檸檬精油活性成分與關鍵靶點的最低結合能

一般認為分子對接結合能<-5.0 kcal/mol,表示配體與受體可以較好地自發結合。表2中的五個活性成分和DRD1的結合能均高于對照奧沙西泮,與GRIA2和IL6的結合能多數都低于-5 kcal/mol,但與對照奧沙西泮相比略差?？偟膩砜?五個成分都能有效的與DRD1、GRIA2、IL-6受體結合。

以乙酸橙花酯為例,與靶蛋白DRD1、GRIA2與IL-6之間結合(見圖8)。乙酸橙花酯與DRD1、IL6的結合模式以鹽橋為主、疏水作用為輔;乙酸橙花酯與GRIA2的結合模式以疏水作用為主、氫鍵為輔。

圖8 乙酸橙花酯與靶點對接可視化圖

2.8 體外抗氧化活性

檸檬精油抗DPPH、ABTS自由基的效果強于乙酸橙花酯(見圖9),且抗ABTS的效果優于抗DPPH,與同濃度的陽性對照VC相近?？梢姍幟示投喑煞种g有協同性。

圖9 檸檬精油和乙酸橙花酯對DPPH和ABTS的清除率

2.9 濃度對細胞活性的影響

檸檬精油和乙酸橙花酯對HaCaT細胞的活性影響(見圖10)。在0.001～1 μg/mL的濃度范圍內,幾乎不影響細胞的存活率,在一定程度上對細胞生長還有促進作用。當濃度≥10 μg/mL時,細胞的活力大大降低。因此,選擇精油濃度≤1 μg/mL進行后續實驗。

圖10 檸檬精油和乙酸橙花酯濃度對HaCaT活力的影響

2.10 細胞內抗氧化活性和抗炎癥的影響

精油對LPS刺激的HaCaT細胞中ROS的清除率(見圖11a)。通過檢測熒光強度發現,與正常組相比,模型組熒光強度明顯增強(P<0.01),表示細胞炎癥造模成功。與模型組比較,檸檬精油與乙酸橙花酯對ROS都有清除作用,呈劑量依賴性。說明檸檬精油及其關鍵單體乙酸橙花酯通過降低細胞內ROS水平緩解氧化應激帶給細胞的炎癥損傷。

圖11 檸檬和乙酸橙酯對LPS刺激的HaCaT細胞的影響

通過對炎癥因子的檢測結果發現(見圖11),模型組的NO、TNF-α及IL-6水平顯著升高(P<0.01),給予檸檬精油與乙酸橙花酯干預后有不同程度的降低,呈劑量依賴性。上述結果初步證明了檸檬精油及其關鍵成分乙酸橙花酯對炎癥相關因子和趨化因子的調節作用。

2.11 嗅吸檸檬精油對小鼠行為學的影響

與空白組比較,模型組小鼠在水中央區域活動范圍、目標象限游泳時間以及穿越次數明顯減少(P<0.01),說明采用CUMS刺激造焦慮模型成功(見圖12)。檸檬精油組及乙酸橙花酯組與模型組比較,總體在水中央區域活動距離、目標象限游泳時間以及穿越次數都強于模型組,且檸檬精油組差異有統計學意義(P<0.01),表明經過嗅吸霧化的檸檬精油后,小鼠的學習記憶能力均較模型組有一定的改善(見表3)。

表3 小鼠水迷宮實驗結果

圖12 水迷宮軌跡圖

2.12 嗅吸檸檬精油對小鼠血漿中DRD1、GRIA2及IL6水平的影響

依據“2.6、2.7”網絡藥理學研究結論,檸檬精油主要作用靶點是DRD1、GRIA2、IL-6蛋白,對血漿中上述蛋白的ELISA檢測結果(見表4)。

表4 嗅吸精油對小鼠血漿中DRD1、GRIA2、IL6含量的影響

焦慮組小鼠血漿中GRIA2、IL6含量較空白組上升,但DRD1較空白組有所下降,其中GRIA2、IL-6差異有極顯著性(P<0.01),造模成功;各給藥組與焦慮組比較,GRIA2、IL6含量均低于焦慮組,而DRD1含量有所上升,其中IL-6有顯著性差異(P<0.05),但是均高于空白組,表示嗅吸精油后對焦慮癥狀有不同程度的緩解但還沒有恢復到正常水平。

2.13 海馬組織的HE染色

小鼠海馬的HE染色可知,相比空白組,模型組小鼠海馬區存在大量細胞核固縮,神經元形態發生改變,神經元有損傷。而嗅吸LEO和NA組小鼠的海馬中偶見核固縮,且癥狀有所緩減。表明LEO和NA都可以一定程度上保護和修復小鼠海馬組織的神經元形態,對焦慮狀態起到一定的改善作用(見圖13)。

圖13 小鼠海馬組織的HE染色(400×)

3 討論與結論

本研究通過網絡藥理學的方法,挖掘檸檬精油抗焦慮的關鍵成分、作用靶點及信號通路,從而探索檸檬精油抗焦慮癥的潛在作用機制。通過構建“檸檬精油-活性成分-靶點-通路-焦慮”網絡,識別出檸檬精油抗焦慮的關鍵成分有19個(如檸檬烯、α-松油醇、甲基丁香酚、β-蒎烯、乙酸橙花酯、β-石竹烯、4-萜品醇等),關鍵作用靶點有18個(如GABRA1、GABRA2、GABRA5、MAO、SLC6A3、SLC6A2、DRD1、GRIA2、IL-6等),涉及的主要通路有神經活性配體-受體相互作用、羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、尼古丁成癮、可卡因成癮等信號通路。

檸檬精油的揮發性物質以萜類化合物含量較高,已有研究發現[14,15]萜類具有抗焦慮、抑郁以及改善認知障礙的作用。乙酸橙花酯具有抗炎和抗氧化效果,廣泛作用于如神經炎、焦慮癥等的治療[16];通過定量構效關系模型計算對多巴胺受體D2、血清素轉運體和5-羥色胺受體1A的親和力,得出乙酸橙花酯可能是有效的抗抑郁藥和神經抑制劑[17]。乙酸橙花酯能調控單胺氧化酶A,防止5-羥色胺在單胺氧化酶A作用下生成5-羥基吲哚乙酸,使突觸間隙的5-羥色胺濃度減少,從而起到緩解焦慮的作用[18]。

DRD1屬于代謝型G蛋白偶聯受體,可以通過非受體酪氨酸激酶以Gαq蛋白依賴抑制DRD1的方式減少離子型谷氨酸受體介導的脊髓神經元的激活,從而緩解慢性疼痛[19],也有研究表明可通過電針刺激杏仁基底外側激活DRD1來緩解小鼠焦慮行為導致的神經損傷[20]。由GRIA2編碼的亞基在神經元中高度表達,敲除GRIA2后,小鼠在高架迷宮中表現出焦慮感降低[21]。IL-6是一種與中樞神經系統神經炎癥相關的細胞因子,在小膠質細胞中激活紋狀體腦區可上調包括IL-6在內的炎性分子表達,并且誘導小鼠產生負性情感以及快感缺失[22]。

分子對接驗證了檸檬精油的核心化合物乙酸橙花酯、檸檬烯、β-蒎稀、4-萜品醇、α-松油烯與核心靶標DRD1、GRIA2、IL-6蛋白之間的相互結合能均低于-5 Kcal/mol,具有較好的結合活性,表明檸檬精油具有抗焦慮癥的良好分子基礎。表明檸檬精油抗焦慮的作用機制是通過多成分、多靶點、多通路的相互調節作用實現的。根據網絡預測結果,在細胞中對檸檬精油進行抗焦慮體外驗證。

一旦機體的抗氧化機制遭到破壞,可產生氧化應激,導致炎性細胞因子的產生,促進炎癥發生[23]。DA能神經元因氧化性損傷會導致焦慮的發生。通過對DPPH、ABTS自由基清除檢測,檸檬精油的清除效果優于單體乙酸橙花酯。同時檸檬精油能夠降低LPS誘導的HaCaT細胞內ROS水平且呈劑量依賴性,能有效降低NO、TNF-α和IL-6炎癥因子,從而緩解氧化應激引起的細胞炎癥損傷。檸檬精油也可改善小鼠焦慮時的認知能力,對組織損傷有所緩減,并降低血清中相關蛋白含量。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學方法,篩選出了檸檬精油干預焦慮癥的主要化學成分、作用靶點和信號通路,并通過實驗進行驗證,得出檸檬精油中的檸檬烯、乙酸橙花酯等成分通過對DRD1、GRIA2、IL6等靶點調控多條信號通路,降低細胞氧化應激、抑制神經炎癥反應,從而干預焦慮癥。

研究結果表明檸檬精油成分中化合物的可調控不同靶點,而同一靶點可干預不同的生物學過程及信號通路,體現了檸檬精油多通路、多靶點聯合作用的特點。但限于網絡藥理學方法論的局限性以及中藥組分在提取時發生化學反應的復雜性,本研究主要是以生物信息學與生化指標的結果為基礎,后續將在此基礎進一步完善從基因組或蛋白組學方面進行驗證,進而明晰檸檬精油的主要調控靶點與作用機制。