房山紫堇地上部分化學成分及其抗乳腺癌細胞增殖作用研究

鄧衛芳,賀金亮,朱一棟,鄧超凡,南澤東*

1山西中醫藥大學第一臨床學院,晉中 030619;2北方民族大學化學與化學工程學院 化工技術基礎國家民委重點實驗室,銀川 750021

房山紫堇Corydalisfangshanensis為罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬一年生草本植物,主要分布在北京房山、山西、河南、河北等地,生于海拔500～1 600 m的石灰巖多石山坡上[1]。紫堇屬藥材多以全草入藥,性味以甘、寒為主,具有清熱解毒之功效,多用于治療感冒發熱、瘡瘍癰腫、潰爛等癥[2]。前期研究發現該屬植物含有生物堿、黃酮、香豆素、有機酸等化學成分,其中生物堿是主要藥理活性成分[3]?，F代藥理學研究發現該屬生物堿類成分具有抗腫瘤、抗炎癥痛、抗心肌缺血、抗菌、保肝等多種活性[4]。2020版《中華人民共和國藥典》收錄紫堇屬中延胡索C.yanhusuo、夏天無C.decumbens、苦地丁C.bungeana等藥用植物,復方延胡索片、夏天無注射液等藥物在臨床都有應用[5]。目前,由于生長環境、產量等原因,對房山紫堇的化學成分或藥理活性研究鮮有報道,阻礙了其藥用成分的發掘。為此,本研究對采自山西左權縣的房山紫堇進行系統的化學成分及體外抗乳腺腫瘤細胞毒活性的研究,采用多種色譜分離技術,對80%乙醇粗提物進行系統分離,并對分離得到的化合物進行乳腺腫瘤細胞抑制作用測試,以期為該藥材抗乳腺癌應用及其后期質量控制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Bruker AV-600、500、400型核磁共振儀(德國Bruker公司);Bruker micrOTOF QⅡ高分辨質譜儀(美國Bruker Daltonics公司);Waters Xevo TQD低分辨質譜儀(美國Waters公司);Spectrum 100 FTIR紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司);Agress1100型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司);Hanon P850型旋光儀(濟南海能儀器公司);Thermo BDS-C18(10 mm×250 mm,5 μm)半制備色譜柱(美國Thermo Fisher公司);KS-240超聲機(深圳市潔康洗凈電器公司);CO2細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司);DMILLED型熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司);EnSpire型全波長酶標儀(美國Perkinelmer公司);BCV-4S1超凈工作臺(上海一恒有限公司)。

正相硅膠(200～300目,批號2321030026,青島海洋化工廠;300～400目,北京伊諾凱科技公司);Sephadex LH-20凝膠(批號17-0090-02,瑞典Pharmacia公司);Rp-C18硅膠(批號F1855900505,德國默克公司);GF254型薄層色譜板(煙臺江友硅膠開發有限公司);甲醇和乙腈(色譜級,純度>99.9%,美國邁瑞達公司);其余化學試劑均為分析純(批號:天津大茂化學試劑廠);MCI-gel(CHP20P,75～150 μm,日本三菱公司,批號:7H801);DMEM培養基(批號:11960-069,美國Thermo Fisher公司);胎牛血清(批號:E510008-0100,上海生工生物工程公司);MTT及DMSO化學試劑(純度≥99.8%、99.7%,美國Sigma-Aldrich公司);陽性對照藥注射用順鉑(凍干型,批號:2H0344B03,山東齊魯制藥有限公司)。

房山紫堇藥材2018年9月采自山西左權縣,由四川省食品藥品學校秦運潭副教授鑒定為房山紫堇Corydalisfangshanensis,標本存于北方民族大學化工學院(No.CF20180901)?？鼓[瘤活性測試所用的乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 提取分離

房山紫堇藥材3.5 kg,切碎后用80%乙醇超聲提取3次(30 min/次),合并提取液并減壓濃縮,得濃縮浸膏180 g。將其分散到蒸餾水中,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,最后得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三個部位量分別為36.0、23.0和32.0 g。

乙酸乙酯部位浸膏(23.0 g),經正相硅膠柱色譜分離(200～300目,0.8 kg),以二氯甲烷-甲醇(20∶1→1∶1,V/V)梯度洗脫,薄層色譜檢測合并得到5個粗流分FZB1～FZB5。FZB2經Sephadex LH-20色譜分離,以二氯甲烷-甲醇(1∶1,V/V)洗脫得流分FZB2-1。FZB2-1經正相硅膠(300～400目)柱色譜分離,用石油醚-二氯甲烷-甲醇+0.5%甲酸(20∶20∶1→3∶3∶1,V/V)梯度洗脫,得到化合物1(8.0 mg)、5(5.2 mg)和6(10.0 mg);FZB3經MCI色譜分離,以甲醇-水(20%→80%,V/V)梯度洗脫得到三個主要流分FZB3-1～FZB3-3。FZB3-1經硅膠(300～400目)柱色譜分離,以石油醚-二氯甲烷-甲醇+0.5%甲酸(5∶5∶1,V/V)等度洗脫,依次得到化合物3(5.0 mg)、4(6.0 mg)和2(4.0 mg);FZB3-2經制備薄層色譜分離,并經Sephadex LH-20色譜分離,以二氯甲烷-甲醇(1∶1,V/V)洗脫得到化合物7(6.0 mg)和8(10.0 mg);FZB3-3經硅膠(300～400目)柱色譜分離,以氨水飽和的石油醚-二氯甲烷-甲醇(8∶8∶1,V/V)等度洗脫,得到化合物12(12.0 mg)和11(5.0 mg);FZB4經Sephadex LH-20色譜分離,以二氯甲烷-甲醇(1∶1,V/V)洗脫得流分FZB4-1。FZB4-1經硅膠(300～400目)柱色譜分離,以氨水飽和的石油醚-二氯甲烷-甲醇(5∶5∶1,V/V)等度洗脫,得到化合物9(3.0 mg)和10(4.0 mg);FZB5經硅膠(300～400目)柱色譜分離,以二氯甲烷-甲醇系統(10∶1→3∶1,V/V)梯度洗脫,得到化合物13(3.5 mg)。

正丁醇浸膏(32.0 g),經正相硅膠柱(200～300目,1.0 kg)色譜分離,用二氯甲烷-甲醇系統(15∶1→2∶1,V/V)梯度洗脫,最終合并得到6個粗流分FZD1～FZD6。FZD1經MCI柱色譜分離,以甲醇-水(20%→80%,V/V)梯度洗脫得到FZD1-1流分。FZD1-1經半制備高效液相色譜分離,以甲醇-水(35∶65,V/V)系統洗脫得到化合物16(8.0 mg,tR=18.96 min)和17(9.0 mg,tR=19.34 min);FZD2經Sephadex LH-20色譜分離,以二氯甲烷-甲醇(1∶1,V/V)洗脫,得流分FZD2-1。FZD2-1經薄層色譜分離,以二氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開劑,得到化合物14(8.0 mg);FZD5經正相硅膠(300～400目)柱色譜分離,以乙酸乙酯-甲醇(10∶1→3∶1,V/V)梯度洗脫,得到化合物15(4.2 mg)。

1.2.2 活性檢測

采用MTT法[6]測試化合物1～17對兩種人乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7增殖抑制作用。將所測化合物均用DMSO溶解后配成濃度為10 mmol/L儲備液,保藏于4 ℃冰箱備用。臨用前,加入培養基液稀釋成所需濃度,本實驗配制為0.032、0.16、0.8、4.0、20.0、100.0 μmol/L等6種不同濃度。用含10%胎牛血清的DMEM培養液將乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7配成細胞懸液,并于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,將對數生長期的細胞懸浮液接種于96孔板中(約4.5×104個/mL),每孔100 μL。培養24 h后,再加入上述不同濃度的含藥培養基,同時設置空白組和陽性順鉑(DDP)對照組,37 ℃繼續培養48 h,然后避光條件下每孔加入20 μL的MTT溶液,繼續孵化4 h后棄去培養液,每孔加入150 μL的DMSO后用酶標儀(λ=570 nm)測定其吸光度A值。根據公式計算抑制率:抑制率=(A對照-A加藥)/(A對照-A空白)×100%。實驗重復3次,然后用SPSS軟件(23.0版本)計算IC50值。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1白色固體粉末;碘化鉍鉀顯紫紅色;(+)-HR-ESI-MS:m/z272.089 7 [M+Na]+(calcd for C13H15NO4Na,272.089 3)。紅外光譜顯示特征的羰基吸收峰(1 753、1 650 cm-1)及苯環吸收峰(923 cm-1);1H NMR(見表1)顯示有兩個對位苯環氫信號7.73(1H,s,H-8)、6.70(1H,s,H-5),說明該化合物有一個1,2,4,5四取代苯環結構;1H-1H COSY(見圖1)給出一個-CH2CH2-片段,結合氫譜3.54(2H,t,J=6.6 Hz,H-3)可知其中一個亞甲基連N原子,通過13C NMR還得到酰胺羰基信號164.0(C-1),通過分析以上NMR數據推測該化合物具有異喹啉骨架,通過HMBC(見圖1)實驗中H-4與C-5相關,以及H-8與C-1相關進一步證實該化合物的母核為一個異喹啉。之外,通過1H和13C NMR(見表1)得到一個連氮甲基信號3.11(3H,s,N-CH3),一個乙?；盘?.30(3H,s,-COCH3),一個甲氧基信號3.58(3H,s,-OCH3)。在1D-NOE實驗中,甲氧基與H-5相關證明甲氧基連到C-6上,乙?；cH-8相關證明乙?；B到C-7上。自此,化合物1的結構確定為7-acetyl thalifoline,檢索Scifinder、中國知網等數據庫顯示該結構曾在2002年通過合成的方法得到[7]。因此,本文中該化合物作為天然產物首次報道。

表1 化合物1的氫譜和碳譜(600 MHz and 150 MHz,CDCl3)

圖1 化合物1的1H-1H COSY和主要HMBC相關

化合物2白色無定型粉末,碘化鉍鉀呈陽性;ESI-MS:m/z192.2 [M]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:8.79(1H,s,H-1),7.18(1H,s,H-5),7.08(1H,s,H-8),4.02(3H,s,6-OCH3),3.98(2H,t,J=8.5 Hz,H-3),3.71(3H,s,N-CH3),3.21(2H,t,J=8.5 Hz,H-4);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:166.5(C-1),50.8(C-3),26.0(C-4),131.9(C-4a),112.2(C-5),157.9(C-6),147.9(C-7),119.9(C-8),118.7(C-8a),57.1(6-OMe),47.3(N-CH3)。以上數據與文獻[8]報道一致,故確定該化合物為pycnarrhine。

化合物10為淡黃色固體粉末,碘化鉍鉀呈陽性;ESI-MS:m/z336.1 [M]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:9.71(1H,s,H-8),7.99(1H,d,J=9.0 Hz,H-12),7.90(1H,d,J=9.0 Hz,H-11),7.36(1H,s,H-1),6.93(1H,s,H-4),6.48(2H,s,-OCH2O-),4.76(2H,t,J=6.0 Hz,H-6),3.95(3H,s,3-OCH3),3.12(2H,t,J=6.0 Hz,H-5),2.99(3H,s,13-CH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:115.6(C-1),146.5(C-2),150.9(C-3),115.9(C-4),132.2(C-4a),28.5(C-5),58.8(C-6),143.6(C-8),119.6(C-8a),146.5(C-9),148.9(C-10),120.5(C-11),121.4(C-12),133.3(C-12a),134.7(C-13),138.0(C-14),112.9(C-14a),57.0(3-OCH3),106.2(-OCH2O-),18.8(13-CH3)。以上數據與文獻[16]報道一致,故確定該化合物為脫氫甲卡維丁。

化合物11為白色無定型粉末固體,碘化鉍鉀呈陽性;ESI-MS:m/z265.2 [M+H]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.43(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.12(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.02(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.42(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),3.88(3H,s,3-OCH3),3.33(2H,t,J=6.0 Hz,H-1′),3.21(2H,t,J=6.0 Hz,H-4′),1.63(4H,m,H-2′,3′);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:128.2(C-1),111.6(C-2),148.5(C-3),149.3(C-4),118.2(C-5),123.3(C-6),142.2(C-7),116.5(C-8),169.4(C-9),42.1(C-1′),27.8(C-2′),27.2(C-3′),39.7(C-4′),56.4(3-OCH3)。以上數據與文獻[17]報道一致,故確定該化合物為feruloylputrescine。

化合物12為白色固體粉末,碘化鉍鉀呈陽性;ESI-MS:m/z193.1 [M+H]+;1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.86(1H,d,J=9.5 Hz,H-7),7.10(1H,s,H-1),6.76(1H,s,H-4),6.19(1H,d,J=9.5 Hz,H-6),3.91(3H,s,3-OCH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:109.9(C-1),147.1(C-3),104.0(C-4),164.1(C-5),112.5(C-6),146.1(C-7),151.5(C-8),153.1(C-8a),56.8(3-OCH3)。以上數據與文獻[18]報道一致,故確定該化合物為木黃酮。

化合物13為白色固體粉末;ESI-MS:m/z207.2 [M-H]-;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.60(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.19(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.06(1H,dd,J=8.5,2.0 Hz,H-6),6.81(1H,d,J=8.5 Hz,H-5),6.35(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),3.89、3.77(各3H,s,2×OCH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:127.7(C-1),111.7(C-2),149.4(C-3),150.6(C-4),115.2(C-5),124.1(C-6),146.8(C-7),116.5(C-8),169.7(C-9),56.5(3-OCH3),52.0(4-OCH3)。以上數據與文獻[19]報道一致,故確定該化合物為二甲基咖啡酸。

化合物14為白色固體粉末;ESI-MS:m/z357.1 [M+H]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.70(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.20(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.09(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6),6.81(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.38(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),5.56(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′),3.89(3H,s,3-OCH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:124.4(C-1),111.9(C-2),149.4(C-3),150.9(C-4),116.5(C-5),127.6(C-6),148.2(C-7),114.8(C-8),167.7(C-9),95.8(C-1′),74.1(C-2′),78.1(C-3′),71.1(C-4′),78.8(C-5′),62.4(C-6′),56.5(3-OCH3)。以上數據與文獻[20]報道一致,故確定該化合物為4-羥基-3-甲氧基桂皮?；?β-D-葡萄糖苷。

化合物15為黃色固體粉末;ESI-MS:m/z625.2 [M+H]+,結合13C NMR數據得到分子式為C28H32O16;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.94(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.62(1H,dd,J=8.5,2.0 Hz,H-6′),6.90(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.42(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.21(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.22(1H,d,J=7.0 Hz,H-1′′),4.52(1H,d,J=1.5 Hz,H-1′′′),3.94(3H,s,3′-OCH3),1.08(3H,d,J=6.5 Hz,H-6′′′);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:158.5(C-2),135.5(C-3),179.4(C-4),163.1(C-5),99.9(C-6),166.1(C-7),94.9(C-8),158.9(C-9),104.4(C-10),123.0(C-1′),114.6(C-2′),148.3(C-3′),150.9(C-4′),116.1(C-5′),124.0(C-6′),56.8(3′-OCH3),104.4(C-1′′),75.9(C-2′′),77.4(C-3′′),71.6(C-4′′),78.2(C-5′′),68.5(C-6′′),102.5(C-1′′′),72.1(C-2′′′),72.3(C-3′′′),73.8(C-4′′′),69.8(C-1′′′),17.9(C-6′′′)。以上數據與文獻[21]報道一致,故確定該化合物為水仙苷。

化合物1～17的結構見圖2。

圖2 化合物1～17的化學結構

2.2 活性測試

抗腫瘤活性測試(見表2)顯示,化合物2～10、13、15～17對MDA-MB-231細胞有一定的抑制作用,其IC50值范圍為8.00～79.99 μmol/L(順鉑IC50=3.54 μmol/L),化合物2～10、16、17對MCF-7細胞有抑制作用,IC50值范圍為7.29～86.91 μmol/L(陽性對照順鉑IC50=23.02 μmol/L)。從抗乳腺癌腫瘤測試結果來看,大部分生物堿類成分對兩種人乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7表現出不同程度的增殖抑制作用,芐基異喹啉生物堿3、4、10的抑制作用較顯著,可能與其結構中含有氮正離子有關。此外,兩種木脂素苷類化合物16和17對兩種乳腺癌細胞抑制作用也比較明顯。

表2 化合物1～17對乳腺癌細胞抑制活性

3 結論

本實驗從房山紫堇80%乙醇提取物中(乙酸乙酯和正丁醇)共分離得到17個單體化合物,化合物1～10為異喹啉生物堿類成分,11、12為其他生物堿類成分,化合物13、14為苯丙素類成分,化合物15為黃酮苷類成分,化合物16、17為木脂素苷類成分。其中,化合物1作為天然產物首次報道,2～17是首次從房山紫堇中分離得到。上述分離得到的化合物與文獻報道的紫堇屬成分類型基本一致。體外抑制乳腺癌細胞增殖的活性測試結果顯示,化合物3、4、7、10對MDA-MB-231具有明顯的抑制活性,化合物4、17對MCF-7細胞具有明顯的抑制活性,其他化合物對上述乳腺癌腫瘤細胞沒有表現出抑制作用?；钚詼y試結果來看,大部分芐基異喹啉生物堿類成分都有一定的抑制作用,但是分離得到的生物堿類化合物總體較少,很難對其構效關系進行有效的總結,后續工作可以對一些含量較高的芐基異喹啉生物堿類成分進行結構修飾,然后總結其構效關系。本研究結果對房山紫堇藥材藥效物質基礎的闡明、質量控制及藥理作用的進一步深入研究有一定的參考價值。