滇桂艾納香提取物促進DUB大鼠子宮收縮機制分析

陳秀婷,韋玥吟,覃田田,吳超權,李宇清

(1.廣西中醫藥大學藥學院,廣西 南寧 530200;2.廣西壯族自治區食品藥品檢驗所,廣西 南寧 530200;3.廣西中醫藥大學,廣西高校中藥藥理重點實驗室,廣西 南寧 530200)

功能失調性子宮出血(DUB)是一種因神經內分泌系統功能失調所致疾病,多因神經內分泌失?；蛳虑鹉X-垂體-卵巢軸功能失常[1],機體排卵功能受到抑制而引起的子宮異常出血,是婦科臨床常見病。DUB在中醫學中屬于“崩漏”疾病范疇,即經血非時暴下或淋漓不止[2]。在《中藥新藥臨床研究指導原則》中將其描述為脾虛、血瘀等。臨床上主要采用性激素、止血藥物及調整周期等方法治療DUB,但療效不穩定,副作用大。中藥對DUB的治療具有多層次、多途徑、多靶點的止血和調節作用,較西藥具有其獨特優勢[3]。

滇桂艾納香為菊科植物假東風草[Blumeariparia(Bl.)DC]的干燥全草,味淡、性平,歸肝、脾經,具有活血化瘀、止血調經之功效。其為壯族民間草藥,在廣西具有悠久的使用歷史,多用于婦女產后出血、血崩以及其他子宮出血等疾病[4]?，F代藥理學研究發現滇桂艾納香除了有促凝血作用外,還能顯著影響子宮的收縮能力,其在《中華藥?！分杏袨椤笆諗恐寡?具有活血不傷血,止血不留瘀之功,可用于各種出血癥”的描述。滇桂艾納香的成藥制劑婦血康顆粒在臨床上用于治療瘀血阻滯、月經過多、經期過長、產后惡露不絕等癥[5],但由于活性成分尚未明確,作用機制尚未清晰,制劑標準較為落后,制約了臨床推廣與應用。

本文將通過利用米非司酮聯合米索前列醇建立DUB大鼠模型,對滇桂艾納香提取物治療DUB的作用及其作用機制進行研究,為滇桂艾納香在臨床上的進一步推廣提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠,雌鼠250～300 g,雄鼠300～350 g,由廣西醫科大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(桂)2014-0002。實驗動物使用許可證:SYXK桂2019-0001。飼養于標準實驗動物環境,實驗全程除采樣前禁食外,動物可自由攝取水和食物。本研究通過廣西中醫藥大學動物倫理委員會審核批準,倫理審查證書編號:DW20190611-072,實驗操作嚴格遵循動物福利相關規定。

1.2 實驗藥物及主要試劑滇桂艾納香提取物(為滇桂艾納香乙醇提取物,經乙酸乙酯萃取后,大孔樹脂吸附,50%乙醇洗脫得到的提取物);咖啡酸(批號:MUST-19120802)、原兒茶酸(批號:MUST-19111305)、丁香酸(MUST-19111601)、沒食子酸(批號:MUST-19122310)均購于成都曼思特生物科技有限公司;水楊酸(批號:Y-0670191201)、香草酸(批號:Y0670191022)均購于上海柏卡化學技術有限公司;益母草顆粒(昆明中藥廠有限公司,批號:571138);米非司酮片(批號:190507)、米索前列醇(批號:190501)均購買于湖北葛店人福藥業有限責任公司;全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司;批號:20191106);鈣離子檢測試劑盒(杰賽博生物科技有限公司,批號:3GI270);蛋白激酶A(PKA)試劑盒(加拿大Immune Chem免疫化學藥劑有限公司,批號:ICP0216);磷酸甘油酸脫氫酶(GADPM)兔單克隆抗體(批號:10)、環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)兔單克隆抗體(批號:4)、磷酸化-CREB兔單克隆抗體(批號:14)均購于Cell Signaling Technology公司;重組β2腎上腺素受體(β2AR)抗體[艾博抗(上海)貿易有限公司,批號:GR3232710-7];BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:14F19B46)、HRP-羊抗兔 IgG(批號:BST14G29C54)均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要實驗儀器BL-420F生物肌張力測定系統(成都泰盟軟件有限公司);HW-400E恒溫平滑肌槽(成都泰盟軟件有限公司);PowerPac HC電泳槽[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司];LC-2030 Plus 高效液相色譜儀(日本株式會社島津制作所)。

2 方法

2.1 滇桂艾納香提取物有機酸含量的檢測本課題組在前期研究中發現[6],滇桂艾納香促進子宮收縮可能主要依托其中的有機酸類化學成分。本研究采用高效液相色譜(HPLC)法檢測滇桂艾納香提取物中的有機酸及其含量。色譜柱:Agilent 5 TC-C18色譜柱,流速:1 mL·min-1,柱溫:30 ℃,進樣量10 μL。根據外標法計算可知其所含有機酸及其含量為:沒食子酸(0.037 8 mg·g-1)、原兒茶酸(0.333 2 mg·g-1)、香草酸(0.080 6 mg·g-1)。

2.2 動物分組及給藥參考王曉東等[7-8]的實驗方法,取性成熟未受孕的雌性與性成熟雄性SD大鼠1∶2合籠,次日上午對看到陰道栓的雌性大鼠進行陰道涂片檢查,若發現精子及角化上皮細胞,則為妊娠第1天,如果未成功受孕,則繼續合籠,直至發現陰道栓。于妊娠第7天灌胃米非司酮(8.3 mg·kg-1),10 h后灌胃米索前列醇(0.1 mg·kg-1)引起不完全流產模型,并向大鼠陰道內放置約60 mg醫用棉球1枚,次日起分別于8∶00取出棉球見出血者即認為DUB模型建立,將成模的雌性大鼠隨機分5組,每組8只,分別為正常妊娠組,DUB模型組,益母草顆粒3.125 g·kg-1組,滇桂艾納香0.4 g·kg-1組,滇桂艾納香0.2 g·kg-1組,另取8只未受孕性成熟雌性大鼠作空白對照。各組動物在造模后第2天按劑量灌胃相應藥物,空白對照組、正常妊娠組及DUB模型組動物灌胃等量蒸餾水,灌胃每天1次,連續灌胃至妊娠第14天。

2.3 大鼠離體子宮平滑肌收縮能力測定末次灌胃給藥1 h后,腹腔注射戊巴比妥鈉(70 mg·kg-1)麻醉,將子宮從大鼠體內分離,置于恒溫平滑肌槽的37 ℃洛氏液中,連接生物肌張力測定系統,給離體子宮加1.0 g的前負荷,待子宮收縮平穩后,記錄8 min內子宮平滑肌的收縮曲線并讀取最大收縮力、收縮頻率。

2.4 DUB大鼠子宮組織中PKA激酶活性及Ca2+濃度的檢測取100 mg大鼠子宮組織,與PBS按1∶10的比例進行勻漿,靜置后離心取上清,分別按PKA活性檢測試劑盒及Ca2+濃度檢測試劑盒說明書要求進行測定。

2.5 Western blotting法檢測DUB大鼠子宮中β2AR、CREB、p-CREB蛋白的表達根據全蛋白提取試劑盒提取大鼠子宮總蛋白,用BCA法測定蛋白含量。將蛋白樣本變性、電泳、轉膜后,分別使用β2AR(1∶2 000)、CERB(1∶1 000)、p-CREB(1∶800)、GAPDH(1∶3 000)一抗,4 ℃孵育過夜。后用HRP-羊抗兔 IgG(1∶10 000)置于搖床中室溫孵育2 h,加入ECL試劑后進行顯影。利用Image J軟件分析條帶灰度,以目的蛋白條帶與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值,對目的蛋白進行相對定量。

3 結果

3.1 滇桂艾納香提取物促進DUB大鼠子宮收縮如表1所示,與空白對照組相比,正常妊娠組大鼠子宮最大收縮力明顯降低(P<0.01),收縮頻率升高(P<0.05),DUB模型組大鼠子宮最大收縮力有所下降,收縮頻率有所上升,但差異均無統計學意義。與DUB模型組相比,滇桂艾納香0.2 g·kg-1組大鼠子宮收縮頻率提高(P<0.05),但最大收縮力與DUB模型組大鼠沒有統計學差異,其對子宮收縮的影響與益母草相似。

表1 滇桂艾納香提取物對DUB大鼠子宮收縮的影響

3.2 滇桂艾納香提取物降低DUB大鼠子宮平滑肌PKA激酶活力如表2所示,與DUB模型組相比,滇桂艾納香0.4 g·kg-1組大鼠子宮平滑肌PKA活力水平下調(P<0.01);滇桂艾納香0.2 g·kg-1組大鼠子宮平滑肌PKA水平也呈現下調趨勢。

表2 滇桂艾納香提取物對DUB大鼠子宮平滑肌PKA激酶活力的影響

如表3、圖1所示,空白對照組的β2AR蛋白表達量較高,但DUB模型組及各個給藥組動物子宮平滑肌β2AR表達量差異無統計學意義,滇桂艾納香提取物不能明顯影響子宮平滑肌β2AR蛋白的表達水平。

圖1 滇桂艾納香提取物對DUB大鼠子宮平滑肌β2受體表達的影響

表3 滇桂艾納香提取物對DUB大鼠子宮平滑肌β2AR表達的影響

3.3 滇桂艾納香提取物增加DUB大鼠子宮平滑肌Ca2+濃度及CREB磷酸化如表4所示,DUB模型組Ca2+濃度略高于空白對照組,但二者差異無統計學意義;與DUB模型組相比,滇桂艾納香0.4 g·kg-1組子宮平滑肌Ca2+濃度增加(P<0.05),滇桂艾納香0.2 g·kg-1組子宮平滑肌Ca2+濃度明顯增加(P<0.01),表明滇桂艾納香提取物可以增加DUB大鼠子宮平滑肌Ca2+濃度。

表4 滇桂艾納香提取物對DUB大鼠子宮平滑肌Ca2+濃度的影響

如表5、圖2所示,與空白對照組相比,正常妊娠組大鼠p-CREB蛋白表達上升(P<0.05);與DUB模型組相比,滇桂艾納香0.2 g·kg-1組大鼠p-CREB蛋白表達上升(P<0.05)。滇桂艾納香0.4 g·kg-1組大鼠p-CREB/CREB較空白對照組以及DUB模型組均上升(P<0.05),表明滇桂艾納香提取物可以增加DUB大鼠CERB磷酸化水平。

圖2 滇桂艾納香提取物對DUB大鼠子宮平滑肌CREB活化水平的影響

表5 滇桂艾納香提取物對DUB大鼠子宮平滑肌CREB活化水平的影響

4 討論

DUB在中醫學中歸屬于“崩漏”疾病范疇,即患者因臟腑受損、氣血失調等無法制約經血,使經血非經期而下,逐漸變成崩漏[9]。滇桂艾納香是傳統的壯族民間用藥,具有調經止血的功效,可用于治療經期提前、產后血崩、婦女功能性子宮出血等癥狀,因其有療效好且副作用小的特點,以滇桂艾納香為主要原料制成的婦血康顆粒、伊血安顆粒等多種民族成藥現已應用于臨床。目前對于滇桂艾納香的研究,大多還停留在化學成分及含量的研究上,藥效物質基礎及作用機制都尚未明晰。鄭丹等[10-11]發現滇桂艾納香的乙醇提取物中含有大量有機酸成分,這與本實驗前期研究結果[6]相同。根據本實驗結果并結合姜建萍等[12]的研究發現,認為滇桂艾納香提取物中的有機酸成分可能是通過促進子宮收縮這一途徑產生對DUB的治療作用,這與Huang等[13]的報道相一致。

子宮收縮功能受損引發宮縮乏力是產后出血的主要原因[14],因此增強子宮收縮可有效控制由產后子宮收縮乏力所造成的出血。滇桂艾納香可能是通過調節子宮平滑肌的收縮狀態治療DUB。如姜建萍等[12]發現,滇桂艾納香提取物及其含藥血清均可提高小鼠離體子宮和大鼠在體子宮的收縮能力。本研究發現,使用滇桂艾納提取物治療的DUB大鼠子宮收縮頻率升高,表明該提取物能促進早孕流產不全大鼠子宮的收縮,與那裘雪等[15]報道的滇桂艾納香近緣種植物白花九里明的有機酸提取物可顯著興奮小鼠離體子宮平滑肌的結果相吻合。

子宮收縮的分子機制包括細胞內鈣濃度的變化、鈣敏化機制的調節等。在子宮收縮過程中,Ca2+起到了非常重要的調控作用[16-17],如Kusaka等[18]發現在大鼠肌層細胞中,PKC可通過影響Ca2+離子濃度,調節子宮的收縮狀態。目前臨床上用于促進子宮收縮的藥物縮宮素主要是通過刺激子宮釋放大量的Ca2+,促使Ca2+迅速流到棘細胞中,使子宮收縮[19];米索前列醇在體內轉化為米索前列醇酸后,通過提高子宮平滑肌細胞通透性和Ca2+濃度,從而增強子宮收縮力[20-21]。CREB是一種細胞核內調控因子,能被多種因子誘導磷酸化激活,如PKC、ERK、Ca2+濃度[22]、鈣調蛋白激酶(CaM kinases,CaMKs)[23]等。由實驗結果可知,滇桂艾納香0.4 g·kg-1組Ca2+離子濃度增加,0.2 g·kg-1組Ca2+離子濃度明顯增加,同時子宮p-CREB/CREB水平上升,這提示伴隨著Ca2+濃度增加的CREB激活可能是滇桂艾納香提取物調節子宮收縮的重要作用機制。

根據Phillips等[24]發現CREB在G蛋白的調節中起關鍵作用,并能顯著影響子宮肌層的觀點,本課題組前期基于網絡藥理學研究發現,滇桂艾納香中的有機酸成分可能是通過影響調控子宮平滑肌β2受體及其下游相關信號通路產生治療DUB的作用。β腎上腺素受體是一種跨膜的G蛋白偶聯受體,通過活化胞內PKA實現細胞外的信號向細胞內傳導激活[18],子宮平滑肌上的β2腎上腺素受體的激活能直接抑制子宮平滑肌的收縮。當β2受體活性被抑制時,PKA激酶活性也隨之降低。本研究中滇桂艾納香治療的DUB大鼠子宮平滑肌PKA活力水平顯著降低,同時子宮組織中β2AR蛋白表達水平無顯著變化,可推斷滇桂艾納香提取物降低PKA活力的效果可能源于對降低β2腎上腺素受體的激活水平,從而促使子宮平滑肌收縮,產生治療DUB的作用,這與韋玥吟等[6]滇桂艾納香可能是通過阻斷β腎上腺素受體從而影響子宮收縮的觀點相一致。

綜合上述,滇桂艾納香提取物具有興奮DUB大鼠子宮平滑肌的作用,其機制可能是通過抑制β2腎上腺素受體的活化,間接促進細胞內Ca2+增加和促進轉錄調節因子CREB的活化,從而可能增加子宮平滑肌中與收縮相關的轉錄調控,促使子宮肌層收縮以產生治療DUB的作用。