β-煙酰胺單核苷酸對氧糖剝奪PC12細胞自噬的影響

田夢芝,龍佳欣,陳笑一,陳惠媚,2,金澤龍,李思特,謝明霞,杜 可*

1湖南中醫藥大學;2中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室,長沙410208

缺血性腦血管疾病包括短暫性腦缺血和腦梗死兩型。其中腦梗死在中醫診斷學中命名為缺血性腦卒中(ischemia stroke,IS),是由于各種原因所致的局部腦組織區域血液供應障礙,導致腦組織缺血缺氧性病變壞死,進而產生一系列神經功能障礙的疾病。其致死率、致殘率高且病理機制復雜,每年給全球造成極大的經濟負擔[1]。腦細胞氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)是最常用的IS體外模型,廣泛用于基礎和臨床前腦卒中的研究[2]。

細胞自噬(autophagy)廣泛存在于真核細胞內,在調節細胞生存和死亡的過程中起著重要的作用[3,4]。大量研究提示自噬與IS的發生、發展密切相關,有研究表明[5]神經元自噬能減輕缺血性腦損傷,也有研究報道[6]神經元自噬能加重缺血性腦損傷,但具體機制尚不明確。

β-煙酰胺單核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)存在于多種食物中,對調節細胞衰老和維持機體正常功能至關重要,參與許多重要的細胞內信號通路的轉導。有研究報道,體外給予NMN能迅速轉化成NAD+而調節細胞衰老和維持機體正常功能[7]。NMN可以補償IS導致NAD+的減少而改善腦缺血神經元的損傷[8]。這提示NMN在IS中發揮著一定的作用。有研究表明[9],NMN能夠促進神經血管再生、改善腦微血管內皮功能、抗炎、抗凋亡。也有少量研究提示[10],其可通過調控自噬來發揮抗缺血性腦損傷的作用,然而NMN調控自噬抗IS的具體機制尚不明確。

本研究旨在構建氧糖剝奪PC12細胞模型,通過體外實驗MTT測細胞存活率,透射電鏡檢測自噬小體、自噬溶酶體,MDC觀測自噬小體熒光強度,Western blot檢測LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、P-mTOR/mTOR自噬相關蛋白表達情況,以期明確NMN對OGD誘導的PC12 細胞自噬損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12細胞株(商品號:TCR9),購自中國科學院上海細胞庫,本實驗室傳代培養。

1.1.2 藥品與試劑

β-煙酰胺單核苷酸(貨號:S31451-100 mg,上海源葉);3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(批號:265839,MCE);雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)(批號:HY-10219,MCE);胎牛血清(批號:2307029,VivaCell);1%青鏈霉素混合液(批號:42A0378K,普諾賽);DMEM高糖基礎培養基(批號:WHB823P261,普諾賽);DMEM無糖基礎培養基(批號:WH1022K081,普諾賽);BCA試劑盒(批號:23135865,Biosharp);蛋白酶抑制劑PMSF(批號:21355980,Biosharp);Beclin1(批號:10024164,Proteintech group);LC3(批號:00115896,Proteintech group);mTOR(批號:10018370,Proteintech group);P-mTOR(批號:10020406,Proteintech group);β-actin(批號:21004031,Proteintech group);羊抗鼠二抗(批號:D20802-25,LI-COR);羊抗兔二抗(批號:D21207-05,LI-COR);二甲基亞砜(批號:22102134,Solarbio);細胞自噬檢測試劑盒(MDC法)(批號:20221217,Solarbio);2.5% Gluta固定液(批號:20230208,Solarbio)。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(SJ-CJ-2FD,蘇州蘇潔凈化設備有限公司);倒置顯微鏡(AE2000,麥克奧迪實業集團有限公司);三氣培養箱(150i,美國Thermo Fisher公司);酶標儀 (ELX800,美國Bio-Tek公司);多功能微孔板檢測系統(CytationTM5,美國Bio Tek公司);紅外熒光掃描成像系統(Odyssey CLX,美國LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將PC12細胞接種于含有10%的胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養基中,置于37 ℃、5% CO2及濕度飽和的培養箱中培養,適時換液,經1～2次傳代后,收集對數期細胞備用。

1.2.2 OGD誘導PC12細胞自噬損傷模型制備

從培養箱中取出PC12細胞,棄掉培養液,用PBS清洗2遍,加入適量的DMEM無糖基礎培養基(缺糖),置于94% N2,5% CO2,1% O2條件下缺氧6 h(缺氧)。

1.2.3 MTT法測各組PC12細胞存活率

收集對數增長期細胞,以6×103個/孔接種于96孔板。設置正常對照組(Con)、OGD組、NMN(200、400、800、1 600、3 200 μmol/L)組,共計7組,每組5個復孔,每孔100 μL。37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱下培養24 h。OGD組在上述條件下培養24 h后,換DMEM 無糖培養基,再在94% N2,5% CO2,1% O2條件下培養6 h進行氧糖剝奪處理。NMN各濃度組藥物干預24 h,換DMEM無糖培養基,再在94% N2,5% CO2,1% O2條件下培養6 h 進行氧糖剝奪處理。采用MTT法測細胞存活率,每孔加50 μg/mL、100 μL MTT,37 ℃孵育4 h后于490 nm 波長處測定各組吸光度(A)值,按如下公式計算各組細胞存活率(R)。

R=[(A實驗-A空白)/(A正常對照-A空白)]×100%

1.2.4 透射電鏡觀察PC12細胞自噬小體及自噬溶酶體

細胞以1.5×106個/mL的密度接種于6 cm培養皿中,設置Con組、OGD組、NMN組、3-MA組、3-MA+NMN組、RAPA組、RAPA+NMN組。37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱下培養24 h。NMN(800 μmol/L)進行干預,3-MA(5 mmol/L)、RAPA(100 nmol/L)分別在加NMN前30 min加入。各組干預24 h后,除正常組外,其余組換DMEM無糖培養基在 94% N2,5% CO2,1% O2條件下培養6 h,使細胞處于氧糖剝奪狀態。棄除舊培養基,用含EDTA的胰酶消化細胞,收集到1.5 mL EP管中,在臺式冷凍離心機4 ℃下1 500 r/min離心10 min后棄去上清,用2.5% Gluta固定液固定細胞團,4 ℃冰箱保存過夜,1%鋨酸后固定2 h,依次以50%、70%、90%、100%的丙酮脫水,包埋、染色后,用透射電子顯微鏡觀察細胞內體數目和形態,并進行拍照,肉眼計數。

1.2.5 MDC熒光法觀測PC12細胞自噬小體

細胞以1×106個/mL密度接種于6孔板,同“1.2.4”一樣操作處理后,棄舊培養基,PBS清洗2次,加入60 μL MDC熒光染色液,37 ℃孵育15 min;去除染色液,用PBS清洗3次后在CytationTM5細胞成像多功能檢測儀CFP 20倍鏡下觀察各組自噬小體的熒光斑點,并拍照記錄,用Image J分析并計算熒光強度。

1.2.6 Western blot檢測LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、mTOR、P-mTOR的表達情況

收集對數增長期細胞,以2.5×106個/mL密度接種于10 cm培養皿中。按“1.2.4”分組培養處理后,棄除舊培養基,預冷PBS清洗2次,含有1% PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min,4 ℃下12 000 r/min冷凍離心10 min后取上清。定量、電泳后將蛋白轉至PVDF膜上,2.5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,4 ℃孵育一抗過夜,次日室溫孵二抗1.5 h。Odyssey CLX雙色紅外熒光掃描成像系統檢測LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、mTOR、P-mTOR的蛋白表達情況,β-actin為內參,計算相對灰度值及P-mTOR/mTOR比值。

1.2.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組細胞存活率情況

如圖1所示,與Con組比,OGD 組細胞存活率顯著降低(P<0.01)。與OGD組比,NMN 400、800、1 600 μmol/L濃度組的細胞存活率均顯著提高(P<0.01),NMN 200 μmol/L、3 200 μmol/L濃度組的細胞存活率無明顯差異(P>0.05)。

圖1 各組細胞存活率情況

2.2 透射電鏡觀察各組細胞自噬小體及自噬溶酶體情況

如圖2所示,Con組細胞形態正常,胞質均勻,有少量自噬溶酶體。與Con組比,OGD組胞質間隙變大,自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體增多,差異具有統計學意義(P<0.01)。與OGD組相比,NMN組及3-MA組自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體均減少,而RAPA組出現大量空泡及自噬小體和自噬溶酶體,差異具有統計學意義(P<0.01)。與3-MA組相比,3-MA+NMN組自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體減少,差異無統計學意義(P>0.05)。與RAPA組相比,RAPA+NMN組自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體均減少,差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖2 透射電鏡觀察各組PC12細胞自噬小體及自噬溶酶體

2.3 MDC熒光染色觀測各組PC12細胞自噬小體的情況

如圖3和表1所示,Con組可見僅有少量熒光斑點,熒光強度較弱。與Con相比,OGD組熒光斑點增多,且熒光強度增強(P<0.01)。與OGD組相比,NMN組、3-MA組熒光斑點顯著減少,熒光強度減弱(P<0.01);而RAPA組熒光斑點顯著增多,熒光強度增強(P<0.01)。與3-MA組相比,3-MA+NMN組熒光斑點減少,熒光強度減弱,差異具有統計學意義(P<0.01)。與RAPA組相比,RAPA+NMN組熒光斑點顯著減少,熒光強度減弱,差異具有統計學意義(P<0.01)。

表1 MDC熒光染色觀測各組PC12細胞自噬小體的情況

圖3 MDC熒光染色觀測各組PC12細胞自噬小體的情況(×20)

2.4 各組細胞自噬相關蛋白表達情況

如圖4所示,與Con相比,OGD組細胞中LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表達顯著上調(P<0.01),P-mTOR/mTOR、p62蛋白表達顯著下調(P<0.01);與OGD組相比,NMN組和3-MA組細胞中LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表達顯著下調(P<0.01),P-mTOR/mTOR、p62顯著上調(P<0.01),而RAPA組則剛好相反;與RAPA組相比,RAPA+NMN組細胞中的LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表達顯著下調(P<0.01),P-mTOR/mTOR、p62顯著上調(P<0.01)。

圖4 各組細胞自噬相關蛋白表達情況

3 討論與結論

2017年柳葉刀研究顯示[11],腦卒中是造成我國生命損失年數的主要疾病,其病情進展快、致死率和致殘率高。其中IS占整個腦卒中的60%～70% ,IS是由于血管阻塞導致大腦某一區域的血液供應減少而引起的[12]。腦組織缺血缺氧后,會引發細胞自噬、細胞凋亡、氧化應激、細胞內鈣超載等一系列病理生理反應[13]。IS幸存者康復周期長,加大了全球經濟負擔[1]。目前,市場上用于防治IS的藥物存在諸多禁忌。故不斷探索防治IS的藥物是非常有必要的。OGD是體外研究IS的經典模型[2]。PC12細胞系是研究神經元損傷最常用的細胞系之一,常用于缺血缺氧損傷的研究[14]。故本實驗采用OGD PC12細胞模型展開體外研究。

NMN是人體內天然存在的物質,也存在于很多食物之中,分子量為334.22。為煙酰胺磷酸核糖轉移酶反應的產物,也是NAD+的關鍵前體之一[7]。有研究發現[15],通過調節生物體內NMN的水平,對心腦血管疾病、神經退行性疾病及老化退行性疾病等有較好的治療和修復作用。也有研究報道[16],給予NMN可減少大鼠MCAO模型的梗死面積和神經功能損傷。在本實驗中,通過MTT證明了OGD能使PC12細胞存活率降低,NMN在400、800、1 600 μmol/L濃度可提高OGD PC12細胞存活率,其中800 μmol/L濃度時存活率最高;而在 NMN 200、3 200 μmol/L濃度時的細胞存活率無明顯差異,這說明200 μmol/L濃度還未能達到提高OGD誘導的PC12細胞存活率的有效濃度,而3 200 μmol/L濃度則可能是濃度過高而對細胞本身產生了一定的損害。

細胞自噬被稱為Ⅱ型細胞程序性死亡,是指細胞在自噬相關基因的調控下,利用溶酶體降解自身受損、變性或衰老的大分子物質以及細胞器以維持其生存、分化、生長及穩定的過程[3]。研究表明[17],IS后會誘發自噬,同時自噬也伴隨著IS病理過程的發生發展,在IS的急性期、亞急性期、恢復期和后遺癥期四個分期中扮演不同的調控作用[18]。

mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,相對分子質量為289 kDa。其不同蛋白質結合,可形成2種不同復合物,即mTORCl和mTORC2。mTORCl對雷帕霉素敏感,負責整合生長因子和營養信號,主要調控細胞自噬、核糖體生物發生、蛋白翻譯和脂質合成等[19]。mTOR被認為是自噬的閥門。研究表明,磷酸化mTOR可以減輕氧糖剝奪損傷,發揮保護細胞的作用[20]。3-MA是一種常用的自噬抑制劑[21]。RAPA是mTOR抑制劑,可通過抑制mTORC1誘導自噬的發生,也被叫作自噬激活劑[22]。本實驗設置3-MA、RAPA 組,用以干預調控OGD誘導的PC12細胞自噬;同時也設置了3-MA、RAPA與藥物聯用組來觀察NMN是否能對抗3-MA或RAPA對OGD誘導的PC12細胞自噬的影響。

Beclin-1、LC3和p62蛋白水平可作為自噬作用的重要檢測指標。Beclin1是一個成熟的自噬調節因子,與自噬呈正相關。Beclin1與VPS15、VPS34 、ATG14等蛋白相互作用來執行自噬和膜運輸功能[23]。LC3是酵母中的泛素樣修飾劑 ATG8的同源物,被認為在自噬過程中起作用。LC3經過ATG4處理后失去C末端殘基轉變成LC3-I。LC3-I經歷泛素化樣酶促反應級聯,共價連接至自噬體膜的脂質分子磷脂酰乙醇胺,轉變成LC3-Ⅱ[24],LC3-II/LC3-I比值升高則說明自噬水平升高[25]。p62是反映自噬活性的標記蛋白,其蛋白的水平與自噬呈負相關,即出現自噬時,在細胞質中p62蛋白不斷被降解;當自噬活性減弱、自噬功能缺陷時,p62蛋白會在細胞質中不斷累積[26]。本實驗通過Western blot技術證實了NMN能夠下調 Beclin1、LC3-II/LC3-I蛋白相對表達量,上調P-mTOR/mTOR、p62蛋白表達量。此外還運用透射電鏡技術和MDC法證實了NMN可減少OGD PC12細胞的自噬小體、自噬溶酶體數量及熒光斑點和強度。以上說明NMN能夠抑制OGD誘導的PC12細胞自噬。

綜上,提示一定劑量的NMN可抗OGD誘導的PC12細胞自噬損傷,從而發揮細胞保護作用,并且這種保護作用可能和mTOR相關通路有關。本研究可為NMN防治OGD誘導的細胞自噬損傷提供一定的靶標參考,為天然化合物NMN的開發積累一定實驗室數據。