天然低共熔溶劑促進纖維素酶水解橄欖苦苷的研究

王明明,陳根振,胡錦霞,曾韋丹,王 晗,裴 棟,曲清莉,邸多隆,3*

1甘肅中醫藥大學藥學院;2中國科學院蘭州化學物理研究所中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室,蘭州 730000;3青島市資源化學與新材料研究中心,青島 266000;4云南油橄欖大健康產業創新研究發展有限公司,麗江 674100

油橄欖(OleaeuropaeaL.)為木犀科木犀欖屬植物,是地中海地區重要的油料作物[1],甘肅、云南是我國油橄欖主要的種植地。油橄欖葉是油橄欖樹種植過程中廉價的副產品。每年每棵油橄欖樹大約需要修剪掉25 kg葉子,每年收獲葉子的總重量占油橄欖總重量的10%。油橄欖葉中含有多種生物活性化合物。如齊墩果酸、山楂酸、熊果酸、橄欖苦苷、羥基酪醇等[2]。

研究表明,橄欖苦苷在油橄欖樹中的所有部位中均有分布,其中油橄欖葉中橄欖苦苷的含量最高。在干燥的油橄欖葉中,橄欖苦苷的含量可以達到10%～17%。如圖1所示,橄欖苦苷水解后生成羥基酪醇、葡萄糖和欖烯酸[3]。其中羥基酪醇表現出比橄欖苦苷更好的生物活性。目前橄欖苦苷的水解方法主要包括酸水解、堿水解和酶水解。酸水解和堿水解需要強酸強堿和高溫環境,反應條件苛刻[4]。近年來,以酶作為催化劑來實現副產物的生物轉化受到了重視。與傳統的酸堿水解方法相比,酶水解橄欖苦苷具有反應條件溫和、環境污染少等優點[5]。Liu等[3]通過纖維素酶作為食品添加劑斷裂糖苷鍵,酶水解橄欖苦苷得到羥基酪醇。由于纖維素酶的熱不穩定性[6],在酶最適溫度下無法持續保持高活性,導致酶水解效率低下。因此,嘗試尋找一種新的綠色溶劑代替緩沖液,在提高橄欖苦苷溶解度的基礎上,增強纖維素酶在長時間反應中的穩定性,從而提高橄欖苦苷的酶水解效率。

圖1 橄欖苦苷酶水解示意圖

低共熔溶劑(deep eutectic solvent,DES)是氫鍵受體(hydrogen bond acceptor,HBA)和氫鍵供體(hydrogen bond donor,HBD)經高溫攪拌形成的均一透明的混合物,與單個組分相比具有更低的熔點[7]。由于DES具有良好的物理化學性質,包括可燃性低、不易揮發、易制備、高溶解性和與酶的高度相容性,因此DES作為無毒提取劑和增溶劑的應用日益廣泛[8]。最重要的是,酶在有機溶劑中易失活[9],DES作為溶劑可以防止這一現象發生。這也使DES代替有機溶劑,孵育纖維素酶成為可能。由天然HBA和HBD組成的DES被稱為NADES,比常規DES更安全,更綠色。在酶催化反應領域NADES作為綠色溶劑受到了廣泛關注[10]。NADES已成功應用于特定的酶促反應中,對酶的活性和穩定性均產生有利影響[11]。上述研究結果證明,NADES具有成為纖維素酶水解橄欖苦苷良好溶劑的可能。

本研究制備了以氯化膽堿或甜菜堿作為HBA,不同種類的多元醇作為HBD的6種NADES,考察對纖維素酶水解橄欖苦苷的影響。通過探究不同種類、不同濃度的NADES及其單體對酶水解速率的影響,構建一種高效、綠色的纖維素酶水解橄欖苦苷的新方法。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

干燥油橄欖葉、BMKX-4大孔樹脂和橄欖苦苷標樣準品(純度≥98.89%,批號:GSB 11-3936-2021)均由中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室提供;纖維素酶(李氏木霉,酶活10 000 U/g,批號:C12894980)、氯化膽堿(批號:C13490561)、甜菜堿(批號:B802317)和檸檬酸三鈉鹽(批號:C14003149)(均為分析純,純度98%)(上海麥克林生化科技股份有限公司);1,4-丁二醇(批號:20201210,純度≥99.0%)、1,2-丙二醇(批號:20130604,純度≥99.5%)、丙三醇(批號:20190815,純度≥99.0%)、乙二醇(批號20221207,純度≥99.5%)和一水合檸檬酸(批號:20180706,純度≥99.8%)(國藥集團化學試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,北京邁瑞達科技有限公司)。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260型高效液相色譜儀配DAD檢測器(安捷倫科技有限公司,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 橄欖苦苷提取物的制備

稱取干燥油橄欖葉200 g,分別加入12倍量(m/V)和10倍量(m/V)60%乙醇回流提取2次,每次2 h,合并提取液,55 ℃減壓回收乙醇至2 L,放冷過濾,得提取液。將提取液流過BMKX-4樹脂富集橄欖苦苷,用1∶9(V/V)的正己烷:乙酸乙酯為洗脫液,洗脫樹脂柱?；厥障疵撘?干燥。得到干燥的橄欖苦苷提取物,置于干燥器中保存。

1.3.2 低共熔溶劑的制備

將不同的HBA和HBD置于具塞錐形瓶中,并在80 ℃的條件下,攪拌2 h,直至形成均勻透明液體。表1為本研究制備的不同類型DES的組分和摩爾比。表2為HBA和HBD的結構。

表1 低共熔溶劑的組成

表2 HBA和HBD的結構

1.3.3 酶水解

考察溫度、時間和pH對橄欖苦苷酶水解率的影響。酶水解實驗在100 mL錐形瓶中進行,水浴加熱,磁力攪拌轉速為150 r/min。橄欖苦苷提取物作為底物。將產物在4 000 r/min條件下離心5 min,去除不溶性殘留物。HPLC檢測橄欖苦苷的濃度。

1.3.4 纖維素酶水解橄欖苦苷最適溫度和pH的研究

取橄欖苦苷提取物100 mg和纖維素酶10 mg加入40 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=5),分別在溫度為40、45、50、55、60 ℃的水浴條件下,反應24 h。

取橄欖苦苷提取物100 mg和纖維素酶10 mg用0.5 mol/L的HCl和0.2 mol/L的NaOH調節檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的pH。分別在pH為3、4、5、6、7,溫度為50 ℃的條件下,反應24 h。

1.3.5 不同種類DES對橄欖苦苷酶水解率的影響

取橄欖苦苷提取物100 mg和纖維素酶7 mg加入36 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液與4 mL的DES形成40 mL的10%DES-纖維素酶緩沖液系統。50 ℃水浴攪拌36 h,每3 h取樣,HPLC檢測橄欖苦苷濃度。

1.3.6 不同濃度DES對橄欖苦苷酶水解率的影響

取橄欖苦苷提取物100 mg和纖維素酶7 mg加入不同比例的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和DES-1,形成10%、20%、30%的DES-纖維素酶緩沖液溶劑系統。50 ℃水浴攪拌36 h,每3 h取樣,HPLC檢測橄欖苦苷濃度。

1.3.7 DES單體對橄欖苦苷酶水解率的影響

取橄欖苦苷提取物100 mg和纖維素酶7 mg分別向纖維素酶緩沖液系統中加入相應量的HBA和HBD。50 ℃水浴攪拌36 h,每3 h取樣,HPLC檢測橄欖苦苷濃度。

1.3.8 橄欖苦苷的HPLC分析

采用ZORBAX SB-Aq-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.3%乙酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脫:0～30 min,14%→27%;30～35 min,27%→31%B。流速為1 mL/min;進樣量為20 μL;檢測波長為232 nm。

分別制備濃度為0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL橄欖苦苷對照品,進樣量20 μL,每個樣品重復進樣三次,取其峰面積平均值。如圖2所示,以標準溶液中橄欖苦苷的濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,得標準曲線方程為y=49 371 370x+41 083,R2=0.999 4(y為峰面積;x為橄欖苦苷濃度,mg/mL)。

圖2 橄欖苦苷標準曲線

1.3.9 橄欖苦苷酶水解率的計算

根據公式(1)計算橄欖苦苷的酶水解率。

R=[1-(W/W0)]×100%

(1)

式中,R為橄欖苦苷酶水解率;W1為水解后橄欖苦苷的質量(mg);W0為水解前橄欖苦苷的質量(mg)。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶水解橄欖苦苷最適溫度與pH的考察

反應溫度是影響纖維素酶活性、反應速率以及橄欖苦苷及其產物溶解度的重要因素,圖3a顯示了反應溫度對橄欖苦苷酶水解率的影響。隨著溫度從40 ℃升高到50 ℃,橄欖苦苷的酶水解率從77.48%升高到84.54%。溫度的升高有利于橄欖苦苷溶解度的增加,也加快了底物與纖維素酶之間的傳質速度,促進了橄欖苦苷的酶水解。溫度高于50 ℃時,橄欖苦苷酶水解率急劇下降,這是由于過高的溫度,會導致纖維素酶失活[12],因此50 ℃是纖維素酶水解橄欖苦苷最適溫度。

圖3 溫度、pH對橄欖苦苷酶水解率的影響

pH對橄欖苦苷酶水解率的影響如圖3b所示,pH是影響酶活性的關鍵因素,pH由3增加到5時,橄欖苦苷酶水解率從67.42%迅速增加到84.54%。當pH高于5時,橄欖苦苷的酶水解率急劇下降。這是由于纖維素酶是一種弱酸性的酶,并且pH的任何變化都可能改變蛋白質中氨基酸的電離態。因此,酶的形態甚至底物的電荷性質都會受到pH的影響,從而影響底物與酶的結合,最終影響反應速率[13]。當pH為中性或者弱堿性時,纖維素酶很容易失活。因此纖維素酶水解橄欖苦苷的最適pH為5。

2.2 不同種類DES對橄欖苦苷酶水解率的影響

本研究篩選了6種以氯化膽堿或甜菜堿為HBA,不同多元醇為HBD組成的NADES(10%,V/V)對纖維素酶水解橄欖苦苷速率的影響進行了研究。圖4、圖5分別表示在緩沖液和10%DES-1為溶劑系統下橄欖苦苷酶水解前后的HPLC色譜圖(溫度為50 ℃,pH=5),色譜圖右側為對應的水解時間。色譜圖中1號峰為羥基酪醇,2號峰為橄欖苦苷。由圖6可以看出,本研究篩選的6種NADES對纖維素酶水解橄欖苦苷都具有一定的促進作用。由圖6可以看出,多元醇為氫鍵供體的DES對橄欖苦苷的酶水解都具有一定的促進作用,但不同的DES之間對橄欖苦苷酶水解速率也存在著差異。如圖7所示,在水解3 h時,多數DES對橄欖苦苷酶水解速率影響很小。通過顯著性分析發現,DES-1、2、6相比于緩沖液系統,并沒有顯著性(P>0.05);而DES-3、4、5為極顯著(P<0.01)。且DES-5在水解3 h后,其對橄欖苦苷酶水解率是緩沖液的1.7倍,其橄欖苦苷酶水解率遠高于其他DES和緩沖液;在水解18 h后,由氯化膽堿和丙三醇組成的DES表現出最好的酶解效果,這可能是因為DES-4能更好增加纖維素酶的穩定性,使其長時間保持良好活性。

圖4 橄欖苦苷在緩沖液中不同酶水解時間的HPLC色譜圖

圖5 橄欖苦苷在10%DES-1中不同酶水解時間的HPLC色譜圖

圖6 緩沖液與不同種類DES橄欖苦苷酶水解率曲線

圖7 不同種類DES對橄欖苦苷酶水解率的影響

多元醇作為氫鍵供體在生物催化方面的應用有許多報道,其在提高多種酶的活性和穩定性方面表現出廣泛的適應性。Jeng等[14]研究表明,基于氯化膽堿和丙三醇組成的DES延長了脂肪酶的半衰期,增加了脂肪酶在40 ℃時的穩定性,在最佳的HBA/HBD比例下使得脂肪酶的半衰期增加了9.2倍?；谔鸩藟A和木糖醇組成的25%NADES(V/V)提高了漆酶的熱穩定性,使其在70 ℃的條件下,仍然保持較高的活性[15]。據報道,多元醇可以穩定蛋白質三級結構,從而提高酶的穩定性[16]。為了更好地了解多元醇在分子水平上對酶活性和穩定性的影響,Varriale等[15]采用分子對接模擬了多元醇與漆酶的活性位點間的相互作用。結果表明,多元醇的羥基與漆酶活性氨基酸形成氫鍵相互作用,這些氫鍵相互作用是促進漆酶活性及其穩定性的重要因素。Sanchez等[17]通過分子動力學模擬也證明了丙三醇為HBD的DES對α-胰凝乳蛋白酶和溶菌酶均能提高其穩定性,并且由氯化膽堿和丙三醇組成的DES可以阻礙蛋白質結構的波動。在長時間水解后(36 h),DES-5具有最好的橄欖苦苷酶水解效率,這表明基于甜菜堿與1,4-丁二醇組成的DES能長時間保持纖維素酶的穩定性,促進了橄欖苦苷的酶水解效率[18]。

2.3 不同濃度的DES對橄欖苦苷酶水解率的影響

DES的高粘度是DES作為溶劑十分重要的物理性質,因為高粘度會影響催化轉化過程中酶與底物之間的傳質[19]。大多數DES的粘度較高,通常向DES中加入水來克服這一問題[20]。尋找合適的DES濃度對酶促反應極為重要。因此,我們討論了不同濃度的DES對橄欖苦苷酶水解率的影響。

由圖8可知,20%和30%DES-1的酶水解率低于緩沖液,而10%DES-1的酶水解率高于緩沖液。這說明20%和30%的DES-1對酶水解反應具有一定的抑制作用。而10%的DES-1對酶水解反應具有一定的促進作用。這可能是因為水含量的增高,降低了DES-1的粘度,增加了纖維素酶與橄欖苦苷提取物之間的傳質作用[21]。

圖8 不同濃度DES對橄欖苦苷酶水解率的影響

在含有酶、水和非水溶劑的溶劑系統中,混合物中水分子將分布在酶的表面而形成酶的結合水,或分布在溶劑相中成為自由水[22]。而這兩個區域的水分子在酶的表面時刻進行著水分子的交換。為了維持酶的活性,就需要滿足存在一定量的結合水來維持酶的活性[23]。當DES濃度過大時,一方面,高濃度DES會在酶表面形成氫鍵網絡,阻礙底物與酶的中心位點結合[24];另一方面,高濃度DES會與酶競爭結合水,使維持酶活性的結合水減少,降低酶的活性[25]。

由圖8可以看出,在10%DES-1溶劑系統下,隨著時間的推移其促進酶水解的效果更加顯著。這也表示,隨著反應時間的延長,緩沖液中纖維素酶的活力下降速率遠快于10%DES-1中的下降速率。因此,10%DES-1能促進纖維素酶水解橄欖苦苷的原因之一是低濃度的DES可以促進纖維素酶的穩定性[18]。

2.4 DES單組分對橄欖苦苷酶水解率的影響

過量的水會導致HBA與HBD之間強的氫鍵作用逐漸衰弱,最終DES組分之間的氫鍵相互作用完全消失[26]。Varriale等[15]通過計算不同濃度下DES組分之間的吉布斯自由能,證明了10%～20%(V/V)DES在緩沖液中其HBA和HBD是以分離的形式存在的。然而,也有許多報道證明了10%～20%(V/V)DES相比于其單個組分更有利于維持緩沖液中對酶的穩定性[17]。為了研究NADES和纖維素酶之間的相互作用,本研究通過DES-1討論了單個組分對酶水解率的影響。由圖9可以看出,DES單組分在緩沖液中對酶水解率有一定的提升,但是只有在10%DES-1的情況下,酶水解效率獲得了最高的增益。因此,這也證明了DES中的HBA和HBD對促進酶水解率不是單個組分的單獨作用,而是HBA和HBD之間的聯合作用來促進酶水解率。

圖9 DES單組分對橄欖苦苷酶水解率的影響

3 結論

本研究通過在緩沖液中加入不同種類和濃度的NADES,研究NADES對橄欖苦苷酶水解率的影響。結果發現選擇合適的種類和濃度的NADES,可以增加纖維素酶的穩定性,促進橄欖苦苷酶水解。在溫度為50 ℃,pH=5的條件下水解3 h,10%DES-5(V/V)為溶劑系統的橄欖苦苷酶水解率是緩沖液的1.7倍;水解36 h的酶水解率是緩沖液的1.5倍;該方法在酶水解條件溫和、高效和環保等優點的基礎上,使纖維素酶長時間高效水解橄欖苦苷成為可能。本研究以氯化膽堿或甜菜堿為HBA,多元醇為HBD的NADES對增強纖維素酶穩定性,促進橄欖苦苷酶水解具有良好的效果,為高效制備橄欖苦苷酶水解產物提供科學依據。