基于數據挖掘和網絡藥理學探究海洋中藥治療乳腺增生的用藥規律及作用機制

張婉悅,楊旭杰

河北中醫藥大學基礎醫學院,石家莊 050020

乳腺增生是由乳腺纖維和上皮組織增生引起的退行性疾病,臨床表現以兩側或單側乳房出現硬結腫塊為主,多伴疼痛,本病病情與月經周期及情緒變化相關,好發于25～44歲的女性[1]。乳腺增生具有發病率高、難治愈、易復發的特點,近年來,乳腺增生的發病率逐年上升,且發病有年輕化的趨勢,本病具有一定的惡變傾向,其中重度乳腺增生、非典型乳腺增生和囊性乳腺增生患者的乳腺癌發病率較高[2]。中醫藥治療乳腺增生具有歷史悠久、經驗豐富的特點,已上市的中成藥如乳康片、乳癖消片等均具有較好療效。

海洋中藥是傳統中藥的重要組成部分,指在中醫學理論指導下,來源于海洋且用于防治疾病的天然藥物,海洋中藥多生長在海域、海灘、濱海濕地、鹽土等受海水浸潤影響的濱海地帶[3],獨特的生長環境使海洋中藥具有獨特的藥用價值[4]。目前已上市的海洋來源藥物種類較少,且相關藥物的研發成功率較高,使得海洋中藥具有較大的發展空間。

專利文獻是知識產權的重要組成部分,囊括了全球90%以上的最新技術情報,能夠反映發明創造的技術特征[5]。新穎性、創造性、實用性是影響專利能否獲得授權的重要因素,專利經多次審核后,只有符合規定、質量較優的專利申請案能夠獲得授權。本研究以治療乳腺增生為主要目的的授權專利組方為研究對象,旨在挖掘含海洋中藥的專利組方的用藥規律及核心藥組發揮療效的作用機制,以期為相關專利的申請及相關藥物的開發利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源

以國家知識產權局網站(http://pss-system.cnipa.gov.cn/)作為數據來源,獲取1993年1月31日至2022年9月30日間治療乳腺增生的專利文獻,此外本研究還選擇了專利事務所、知識產權機構、中醫藥企業、高校等單位作為信息來源,以保證數據的查全率。

1.2 納入標準

①以治療乳腺增生為主要目的的專利文獻;②已獲得授權的專利文獻;③含海洋中藥的專利文獻。

1.3 排除標準

①排除治療儀器、熏洗裝置等不含中藥成分的專利文獻;②排除重復的專利文獻;③排除公開、駁回、撤回等其他法律狀態下的專利文獻。

1.4 建立數據庫與數據標準化

1.4.1 建立數據庫

將以上數據錄入WPS Excel建立數據庫,由雙人兩臺計算機錄入并復查,對差異數據進行修改。

1.4.2 數據標準化

藥物名稱優先依據2020版《中國藥典》進行規范,未收錄者依據《中華本草》《中藥大辭典》規范。如將“川軍”規范為“大黃”,“二花”規范為“金銀花”,“坤草”規范為“益母草”;海洋中藥的確認及名稱標準化依據《中華海洋本草》進行。

1.5 數據分析

運用WPS Excel中數據透視表對藥物進行頻數統計;運用SPSS Statistics 21.0對頻數≥40的藥物進行聚類分析;運用SPSS Modeler18.0建模,進行Apriori關聯規則分析。

1.6 網絡藥理學分析

1.6.1 藥物成分的篩選與靶點信息獲取

在TCMSP數據庫,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性指數(drug likeness,DL)≥0.18為條件,篩選柴胡、當歸的主要成分,在BATMAN-TCM數據庫以Score cutoff≥20,P-value<0.5的條件,篩選牡蠣的主要成分,結合文獻補充藥物的靶點信息,在Pubchem數據庫中獲得藥物成分的分子結構圖,將分子結構圖導入Swiss ADME平臺中,參考相關文獻,對胃腸吸收(GI absorption)為high、藥物相似性中有兩個及兩個以上“yes”的成分予以納入,對于未納入的藥物成分,參考相關文獻,若為主要成分或作用明顯者仍予以納入。在Pharm Mapper數據庫中獲取藥物成分的潛在靶點。利用uniprot數據庫,獲取已驗證的人類靶點基因名稱。將上述信息錄入WPS Excel表格,運用Cytoscape3.8.0軟件繪制藥物-成分-靶點網絡圖。

1.6.2 乳腺增生相關靶點的獲取

以“hyperplasia of mammary glands”為關鍵詞,在GeneCards數據庫及OMIM數據庫進行檢索。為獲取相關性較高的疾病靶點,計算GeneCards數據庫中疾病靶點的相關度分數(relevance score)中位數,記為M,篩選相關度分數>2M的基因靶點,與OMIM數據庫中獲取的靶點合并去重后,錄入WPS Excel表格。

1.6.3 蛋白質互作(PPI)網絡的構建與核心靶點獲取

使用微生信網站繪制藥物-疾病Venn圖。將Venn圖中藥物-疾病的交集靶點導入String數據庫,設置蛋白種屬為人類、medium confidence>0.4,構建PPI網絡。運用Cytoscape3.8.0軟件中的CytoNCA計算其拓撲參數,篩選核心藥組中治療乳腺增生的關鍵靶點。

1.6.4 核心成分獲取

運用Cytoscape3.8.0軟件,將藥物-疾病的交集靶點導入藥物-成分-靶點網絡圖中進行篩選,繪制成分-靶點網絡圖,并運用CytoNCA計算其拓撲參數,獲取網絡中的核心成分。

1.6.5 GO生物功能分析與KEGG通路富集分析

利用Metascape數據庫進行GO生物功能分析和KEGG通路富集分析,利用微生信網站繪制GO生物功能條目圖和KEGG通路富集氣泡圖。

1.7 分子對接

利用Pubchem數據庫獲取配體信息,運用OpenBabel-2.4.1軟件將文件格式轉換為mol2格式,運用AutoDuckTools-1.5.7軟件對配體加氫、分配電荷、設置扭轉鍵。利用PDB數據庫獲取受體信息,運用Pymol軟件去除受體中的水及配體,運用AutoDuckTools1.5.7對受體加氫。將上述文件保存為pdbqt格式,導入AutoDuckTools-1.5.7軟件,運行autogrid4、autodock4將受體配體對接,所得結果運用Pymol進行可視化。

1.8 動物實驗

1.8.1 動物

雌性SD大鼠60只,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010,本實驗經河北中醫學院倫理委員會審批(編號:DWLL2018059),實驗動物的相關操作符合實驗動物管理條例。

1.8.2 主要試劑與儀器

枸櫞酸他莫昔芬(上海復旦復華藥業有限公司,批號:200905);黃體酮注射液(批號:B210205)、苯甲酸雌二醇注射液(批號:B210206)(寧波三生生物科技有限公司);ChemiDOC XRS型凝膠成像分析系統、S1000型逆轉錄儀、CFX96型Optics Module PCR儀、10705型酶標儀、CG05型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)儀、BJYX2017002型逆轉錄儀(美國Bio-Rad公司)。

1.8.3 藥物制備

實驗所需中藥飲片購自北京廣安門醫院中藥房,經承德醫學院中藥研究所蘇占輝副教授鑒定均為正品。藥組中柴胡10 g、當歸10 g、牡蠣30 g,常規浸泡1 h,煎2次,每次文火煎煮30 min,得到藥液濃縮至每毫升藥液含生藥1 g,冷卻后置4 ℃冰箱備用。

1.8.4 分組與給藥

按照隨機數字表法隨機選取大鼠10只作為正常組,剩余大鼠隨機分為5組,分別為模型組、枸櫞酸他莫昔芬組、中藥組合物高、中、低劑量組。中藥組合高、中、低劑量組每日分別給予12、6、3 g/kg中藥組合物藥劑灌胃,枸櫞酸他莫昔芬組每日給予4 mg/kg枸櫞酸他莫昔芬灌胃,等效劑量按人與動物體型系數折算。正常組和模型組每日給予等量蒸餾水灌胃,持續干預30 d。

1.8.5 標本采集

于末次灌胃給藥后,各組大鼠禁食不禁水24 h,采用1%戊巴比妥鈉按1 mL/kg腹腔注射進行麻醉后,常規觀察大鼠一般癥狀、體征。實驗過程中觀察各組大鼠一般生存狀況(體質量、性情、毛發等)和大鼠乳頭形態(形態、皮色等)。

1.8.6 大鼠乳頭形態學測定

大鼠麻醉后,將大鼠第二對乳頭周圍脫毛,腹部向上置于超聲操作臺,使用醫用膠帶固定其四肢,用游標卡尺測量乳頭直徑和高度。

1.8.7 血清中雌激素及孕酮含量測定

麻醉大鼠后取血,使用高速冷凍離心機離心10min,取上層血清,采用ELISA法檢測大鼠血清中雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,PG)含量。

1.8.8 乳腺組織中PTEN、PI3K、Akt mRNA表達

使用Real-time PCR法,取乳腺組織0.1 g,提取試劑盒抽提組織中總RNA,測定RNA濃度(吸光度A260/A280,1.8～2.0)。RNA反轉錄為cDNA以備擴增,引物(寶生物工程有限公司)以GAPDH作為內參基因(引物序列見表1),擴增(95 ℃預變性5 min,94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、60個循環)。獲取目的基因和內參基因的循環閾值(Ct),2-ΔΔCt計算目的蛋白mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.8.9 統計學方法

2 結果

2.1 數據挖掘結果

2.1.1 中藥頻數統計

檢索得乳腺增生授權專利共計387篇,篩選后納入含海洋中藥的專利組方157首,涉及中藥398味,用藥頻數共計2 437次,單首專利組方中用藥最多55味、最少2味。海洋中藥的用藥頻數共計257次,涉及22味海洋中藥。專利組方中使用頻數≥40的中藥有13味,其中高頻海洋中藥三味:牡蠣(83次,52.87%)、海藻(72次,45.86%)、昆布(57次,36.31%),高頻非海洋中藥有柴胡(83次,52.87%)、當歸(70次,44.59%)、夏枯草(67 次,42.68%)等(見表2)。

表2 含海洋中藥專利組方治療乳腺增生的高頻藥物

2.1.2 聚類分析

運用SPSS Statistics21.0,選取使用頻數≥40的藥物,聚類方法設置為組間聚類,度量標準設置為Pearson相關性進行系統聚類分析,并繪制樹狀圖(見圖1)。當組間距離為23.5時,可將藥物分為三類。類別A:莪術、三棱、海藻、昆布;類別B:香附、青皮、丹參、柴胡、牡蠣、郁金、當歸、王不留行;類別C:夏枯草。

圖1 聚類分析圖

2.1.3 中藥的關聯規則分析

將專利組方導入SPSS Modeler18.0軟件,運用Apriori模型,設置支持度≥10%,置信度≥80%進行關聯規則分析。關聯規則較強的藥物組合有柴胡-牡蠣+當歸、沒藥-乳香、柴胡-夏枯草+牡蠣、柴胡-郁金+牡蠣、柴胡-青皮+牡蠣(見表3)。選取其中支持度、置信度最高的藥組柴胡-牡蠣+當歸,進行網絡藥理學研究。

表3 關聯規則分析

2.2 網絡藥理學分析結果

2.2.1 核心藥組的藥物作用靶點獲取及疾病靶點篩選

綜合數據庫及文獻查閱結果[6-9],共納入37個藥物成分,其中柴胡21個,當歸7個,牡蠣9個(見表4),整理藥物成分的作用靶點,去除重復值后獲得靶點317個。

表4 核心藥組成分

在GeneCards數據庫、OMIM數據庫中輸入“hyperplasia of mammary glands”檢索乳腺增生疾病靶點,分別檢索得4 832個、462個乳腺增生的潛在靶點。為去除相關性低的疾病靶點,計算GeneCards數據庫中相關度分數中位數,記為M,取相關度分數>2M的靶點。整理去重后共獲得潛在靶點1 386個。運用Cytoscape3.8.0軟件繪制成分-靶點網絡圖(見圖2)。

圖2 藥物-成分-靶點網絡

2.2.2 藥物-疾病共同靶點獲取及PPI網絡的構建結果

取藥物與疾病的共同靶點繪制Venn圖(見圖3),將交集靶點導入String數據庫構建PPI網絡,使用Cytoscape3.8.0軟件進行可視化(見圖4),計算網絡中節點的拓撲參數(見圖5),其中TP53的拓撲值最高,推測是相關藥物發揮治療作用的重要靶點,此外AKT1、ALB、ESR1等靶點也相對重要。

圖3 藥物-疾病靶點Venn圖

圖4 PPI網絡

圖5 重要靶點統計條目圖

2.2.3 核心成分獲取

運用Cytoscape3.8.0軟件,繪制成分-靶點網絡圖(見圖6),并運用CytoNCA分析網絡的拓撲參數,計算參數中度中心性(degree centrality,DC)、緊密中心性(closeness centrality,CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、中介中心性(between centrality,BC)的平均數,取大于平均值的成分作為核心成分(見表5),篩選后共獲得四個成分,其中槲皮素拓撲值最高,推測其為高頻藥組發揮療效的主要成分,此外,山奈酚、異鼠李素、β-谷甾醇也較為重要。

圖6 成分-靶點網絡

表5 成分拓撲值

2.2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析結果

利用Metascape數據庫,在P<0.01的條件下,進行GO富集分析與KEGG通路富集分析,利用微生信網站繪制GO富集分析條目圖(見圖7)及KEGG通路富集條目圖(見圖8)。結果顯示核心藥組參與的生物學過程主要涉及激素反應(response to hormone)、對無機物質的反應(response to inorganic substance)、細胞對脂質的反應(cellular response to lipid)等;細胞組分涉及膜筏(membrane raft)、轉錄調節復合物(transcription regulator complex)、質膜蛋白復合物(plasma membrane protein complex)等;分子功能可能與DNA結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、激酶結合(kinase binding)相關。KEGG通路富集分析獲得197條通路,按照P值由小到大排序,選取排名前20的條目繪制氣泡圖(見圖8),發現與核心藥組治療乳腺增生關系較為密切的通路有P13K-ATK信號通路、TNF信號通路、內分泌抵抗等。

圖7 GO生物功能條目圖

2.3 分子對接結果

選取靶點TP53(PBDID:1aie)、AKT1(PBDID:6hhg)、ALB(PBDID:7vr0)、ESR1(PBDID:1sj0)與核心成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素、β-谷甾醇進行分子對接。結合能越低,說明成分與蛋白靶點間的結合越緊密[10],核心成分與靶點間的對接能在-5.86 kcal/mol至-10.32 kcal/mol間(見表6),提示成分和靶點間對接情況良好。以槲皮素與靶點間的構象關系為例,進行可視化展示(見圖9)。

圖9 分子對接模式圖

表6 分子對接結果

2.4 實驗驗證

2.4.1 中藥組合對大鼠乳頭直徑和高度的影響

與正常組比較,模型組大鼠的乳頭直徑明顯縮小、高度明顯降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠乳頭直徑明顯縮小、高度明顯降低(P<0.05)(見表7)。

表7 核心藥組對大鼠乳頭直徑和高度的影響

2.4.2 中藥組合對大鼠血清E2及PG表達的影響

與正常組比較,模型組大鼠血清中E2水平顯著升高、PG水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組中的大鼠血清中E2水平降低、PG水平升高(P<0.05),以高劑量中藥組合效果最佳(見表8)。

表8 核心藥組對大鼠血清E2及PG表達的影響

2.4.3 中藥組合對大鼠乳腺組織中PTEN、PI3K、Akt mRNA表達的影響

模型組與正常組比較,大鼠乳腺組織中的PTEN mRNA明顯下降(P<0.05),PI3K、Akt mRNA明顯升高(P<0.05);與模型組相比,高劑量組的PTEN mRNA明顯升高,PI3K、Akt mRNA明顯下降(P<0.05),表明中藥組合對P13K-ATK信號通路具有抑制作用(見表9)。

表9 核心藥組對大鼠乳腺組織中PTEN、PI3K、Akt mRNA的影響

3 討論與結論

中醫學將乳腺增生歸屬“乳癖”范疇,《外科正宗》載:“憂郁傷肝,思慮傷脾,積想在心,所愿不得志者,致經絡痞澀,聚結成核?！敝赋霰静∑鸩《嘤汕橹静凰?、七情過極而損傷肝脾,導致肝失疏泄、脾失健運;或因肝腎虧損、沖任失調,導致痰凝、瘀血郁滯乳絡,凝滯成核,遂成本病。

對含海洋中藥的授權專利組方進行數據挖掘,發現專利組方中治療乳腺增生的海洋中藥以牡蠣、海藻、昆布為主。牡蠣能潛陽補陰、軟堅散結,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功能,牡蠣水解物能產生強烈的免疫刺激作用,且具有抗腫瘤活性[11];海藻性寒、味苦咸,能軟堅散結,是臨床常用治療乳腺增生的藥物,《本草備要》認為海藻“咸潤下而軟堅,寒行水以泄熱,能消堅聚”;昆布性寒、味咸,功效類似于海藻,藥理研究顯示昆布具有調節免疫、抗腫瘤的作用,此外,昆布能夠下調Bcl-2基因蛋白表白,增加異常增殖的乳癌細胞對化療藥物的敏感性[12]。非海洋藥物中,柴胡是治療乳腺增生的常用藥物,柴胡能條達肝氣、疏肝解郁、調節氣機,擅治肝氣郁結型乳腺增生;當歸為“補血之圣藥”,既能補血,又能活血行滯,具有抗炎、抗腫瘤、調節免疫等作用[13];夏枯草既能清肝經火,又能散結消腫,其治療乳腺疾病的作用首載于《神農本草經》,迄今千年有余,療效廣經驗證。研究證實,夏枯草通過調控激素代謝水平,抑制乳腺增生;另一方面,夏枯草可以調節免疫功能,清除體內病變細胞[14]。

對高頻藥物進行聚類分析,類別A中莪術、三棱可活血行氣止痛,海藻、昆布能軟堅散結,本組藥物的功效以活血散積止痛為主;類別B中香附、柴胡能疏肝理氣、條達郁滯,二藥是柴胡疏肝散的組成部分,具有理氣解郁的作用,郁金行氣化瘀、青皮破氣疏肝,王不留行、丹參能活血,當歸補血活血,牡蠣軟堅散結,本組藥物功效以疏肝理氣活血為主;類別C中夏枯草能清瀉肝火、散結消腫。三類藥物組合功效各有側重,可依據患者具體證型靈活應用。關聯規則分析結果表明柴胡-牡蠣-當歸藥組關聯性最高,柴胡疏肝理氣、當歸補血活血,二藥相合既能理氣疏肝,又能補血養肝,再配以海洋藥物牡蠣,既能軟堅散結,又能防止疏肝藥物宣散太過,本藥組能理氣活血疏肝,有助于宣通乳絡,促進氣血運行恢復正常,查閱文獻發現,柴胡-牡蠣-當歸藥組多應用于臨床,且具有較好的臨床效果[15]。乳頭直徑和高度能從形態學上直觀反映乳腺增生的增生程度[16]。E2的升高及PG降低,導致乳腺實質過度增生,在乳腺組織的病變過程中起主導作用[17]。實驗表明柴胡-當歸-牡蠣藥組能縮小乳頭直徑、降低乳頭高度,且能降低血清中E2表達、提高PG表達水平,能改善乳房形態,抑制乳腺增生。

運用網絡藥理學對核心藥組進一步分析,發現槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇度值最高。槲皮素的結構與雌激素類似,具有雌激素效能,對雌激素具有雙向調節作用,此外,槲皮素能下調Bcl-2蛋白表達、上調Bax蛋白表達,從而誘導細胞凋亡,治療乳腺增生[18,19];山柰酚是一種黃酮類化合物,具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等作用,山柰酚可以活化半胱天冬酶,促使細胞凋亡,抑制細胞增生[20];異鼠李素具有抗氧化活性,可由AKT和ERK信號通路介導,抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[21];β-谷甾醇具有抗炎作用,能調控多種細胞信號通路,具有抑制細胞增殖和血管生成的作用[22]。

本研究共篩選出317個藥物潛在作用靶點,依據拓撲參數,推測TP53、AKT1、ALB、ESR1是核心組方治療乳腺增生的核心作用靶點。研究表明,TP53在Nedd4介導下調節Spy1蛋白,當TP53突變時,Spy1蛋白積聚,導致乳腺增生[23];在小鼠模型中,雌激素受體過表達時,MMTV啟動子啟動AKT1,AKT1驅動成纖維細胞轉化,促進乳腺管腔上皮細胞的存活和遷移[24];ALB是白蛋白的基因表達,白蛋白來源于肝臟,能有效抑制中性粒細胞誘捕網(NETs)的生成[25],NETs參與了細胞殺傷、無菌性炎癥、組織損傷,且能在一定程度上促進腫瘤細胞增殖,在乳腺癌的疾病進程中起重要作用[26],乳腺增生存在癌變可能,結合相關文獻,推測ALB可能是預防乳腺增生癌變的重要靶點;乳腺組織中早期遺傳缺陷、環境條件等因素可能導致ESR1突變,其中XbaⅠ位點的變異增加了乳腺增生的發病風險[27]。

通過GO功能富集分析,發現高頻藥組可能于膜筏等部位發揮治療乳腺增生的作用,膜筏是由蛋白或類球蛋白所組成的細胞膜微結構域,參與如血管壁細胞凋亡、免疫細胞活化等生物學功能的調節[28]。藥組發揮治療作用的生物學過程主要涉及激素反應、對無機物質的反應、細胞對脂質的反應等,與DNA結合轉錄因子結合、蛋白激酶活性、激酶結合等方面的分子功能密切相關。

本研究發現,P13K-ATK信號通路可能是柴胡-牡蠣+當歸藥組治療乳腺增生的重要通路。P13K-ATK信號通路與細胞增殖、遷移、分化、凋亡密切相關[29],乳腺上皮細胞中P13K-ATK信號通路被激活后,對雌激素的生長抑制具有抑制作用,從而導致乳腺上皮細胞的增生性改變。實驗表明,核心藥組具有抑制P13K-ATK信號通路的作用。拓撲值排名前十的核心靶點中,AKT1、TP53、EGFR、VEGFA、MYC、IL6均位于P13K-ATK信號通路,推測可能是核心藥組抑制P13K-ATK信號通路的重要媒介。此外,抑癌基因PTEN能夠抑制P13K-ATK信號通路,從而抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡[30]。KEGG通路富集分析結果顯示,藥物靶點較多作用于癌癥相關通路,提示中藥組方在治療乳腺增生同時,具有減緩疾病發展進程、延緩甚至阻止乳腺癌發生的可能性。核心藥組還能作用于動脈粥樣硬化、乙型肝炎、丙型肝炎等通路,體現中醫理論中異病同治的思想,為相關申請人后續申請乳腺增生復方專利,拓寬專利權保護范圍提供參考。

綜上所述,本文運用數據挖掘、網絡藥理學及動物實驗,以授權專利組方為研究對象,從理論層面探究其中海洋中藥治療乳腺增生的用藥規律及核心藥組治療乳腺增生的作用機制。本文的研究結果對進一步開發海洋中藥,促進相關專利的申請具有積極意義。

中藥牡蠣多去肉,以殼入藥,目前牡蠣殼成分的測定年代較早,公知有效成分主要是礦物質,此類物質可查的作用靶點較少,導致相關成分的拓撲參數較小,在網絡中排名較為靠后,但牡蠣作為治療乳腺增生的臨床常用藥物,其治療作用不容忽視。本研究揭示出對牡蠣成分、靶點等方面的研究不夠充分這一現狀,為相關的系列研究提供了新思路。本研究團隊已經設計了牡蠣潛在成分深入挖掘的相關實驗,并且密切關注同行的藥理研究進展,隨著牡蠣有效成分的不斷公開,牡蠣治療乳腺增生的藥理機制必將有新的突破。