炮制前后地骨皮藥材與飲片質量相關性分析

董汛,周林,牛延菲,謝佳穎,陸雪萍,李小輝,楊增明

(1.云南省藥物研究所,云南 昆明 650111;2.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室,云南 昆明 650111)

中藥材地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥根皮[1]。春初或秋后采挖根部,洗凈,剝取根皮,曬干。寧夏枸杞原產我國內蒙古、山西北部、陜西北部、甘肅、寧夏等北部省區,目前多栽培,以寧夏、甘肅等地栽培多、產量大。枸杞則廣泛分布于我國東北、河北、山西、陜西、甘肅南部以及西南、華中、華南和華東各省區,多為野生[2]。地骨皮甘,寒。歸肺、肝、腎經。具有涼血除蒸,清肺降火的功效。用于陰虛潮熱,骨蒸盜汗,肺熱咳嗽,咯血,衄血,內熱消渴[1]。地骨皮藥材及飲片標準收載于《中國藥典》2020年版(一部),以及《香港中藥材標準》第六冊[3]、《日本藥典》(JP 17)[4]等中藥材標準中?！吨袊幍洹芬幎ǖ毓瞧わ嬈呐谥品椒椤俺ルs質及殘余木心,洗凈,曬干或低溫干燥”。地骨皮藥材中地骨皮乙素的高效液相色譜測定和特征圖譜研究,已有相關報道[5-8],未見基于多指標分析的藥材與飲片相關性研究報道。本文首次以地骨皮關鍵質量屬性之地骨皮乙素含量、特征圖譜、浸出物、總灰分與酸不溶性灰分為指標,以多個代表性產地、多批代表性樣品為對象,對地骨皮藥材與飲片間的質量相關性進行了系統研究和分析,為相關中藥新藥的研究設計、藥品生產質量管理等提供參考。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司);Mettler Toledo XSE205電子天平、AB-204N電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);SX-2.5-12箱式電阻爐(天津市泰斯特儀器有限公司);DHG-9037A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);HH-6數顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司);XY-500型洗藥機(南京遠大干燥設備廠);CT-C-Ⅱ型熱風循環烘箱(中國范群干燥設備有限公司)。

地骨皮藥材,采集自寧夏、甘肅,各產地代表性原植物標本均經中國科學院昆明植物研究所標本館李嶸研究員鑒定為寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.),所有樣品依據法定標準[1]鑒定與檢驗,均符合規定,所有標本和樣品保存于云南省藥物研究所。地骨皮乙素(批號:20190524),自制,經MS(Waters Xevo TQ-S,ESI、HRESI)、NMR(Bruker DRX-500,13C、1H、HSQC、COSY、HMBC、ROESY、HSQCTOCSY)、IR鑒定確證結構,經標定含量為90.68%[含量(%)=HPLC色譜純度-水分-熾灼殘渣-溶劑殘留];地骨皮甲素(批號:20190624),自制,經MS、NMR鑒定結構,HPLC含量90.79%(面積歸一化法)。色譜純乙腈(Merck公司);三氟乙酸等其他試劑為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 地骨皮飲片炮制人工揀選,除去雜質及殘余木心,篩去灰屑,洗藥機清洗(筒體轉速10 r·min-1,水壓0.4 MPa,沖洗時間60 s),熱風循環烤箱50～60 ℃干燥,放涼,篩去灰屑,包裝。

2.2 地骨皮乙素含量測定方法地骨皮乙素是地骨皮的主要活性成分[9-11],專屬性強、含量較高[6,12],我們參照《香港中藥材標準》(第六冊)[3]地骨皮質量標準及文獻[6]方法,建立了地骨皮中地骨皮乙素含量測定方法。

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗色譜柱為Agilent ZORBAX C18SB-AQ Stable Bond Analytical(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%三氟乙酸水溶液(B),梯度洗脫程序:0～26 min,5%A→7% A;26～27 min,7% A→8% A;27～65 min,8% A→11% A;65～70 min,11% A→14% A;流速1.0 mL·min-1;檢測波長280 nm;柱溫40 ℃;進樣量10 μL。理論板數按地骨皮乙素峰計算應不低于10 000。

2.2.2 對照品溶液的制備取地骨皮乙素對照品適量,精密稱定,加甲醇-1%冰醋酸溶液(1∶1)的混合溶液制成每1 mL含0.4 mg的溶液,搖勻,即得。

2.2.3 供試品溶液的制備取本品粉末(過四號篩)約0.5 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液50 mL,稱定重量,加熱回流30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.3 地骨皮乙素含量測定方法學考察

2.3.1 專屬性供試品溶液色譜圖(見圖1)中,供試品溶液目標峰與對照品溶液色譜峰相對保留時間、峰型一致;地骨皮乙素與相鄰峰(地骨皮甲素)分離度符合要求,地骨皮乙素色譜峰光譜純度良好(純度角度0.499,純度閾值0.801),該方法具有良好的專屬性。

圖1 22批地骨皮藥材及對應飲片HPLC色譜圖(S1～S22)和對照特征圖譜(R)

2.3.2 精密度試驗取地骨皮乙素對照品溶液,連續進樣7次,記錄峰面積,結果7次峰面積的RSD為0.77%,表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性關系考察精密稱取地骨皮乙素對照品適量,加甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液制成濃度分別為4.116 0、1.646 4、0.823 2、0.411 6、0.247 0、0.164 6、0.082 3、0.041 2 mg·mL-1的對照品溶液,按“2.2”項下色譜條件分別進樣,記錄峰面積,以峰面積為縱坐標(Y),濃度為橫坐標(X)進行線性回歸,得回歸方程Y=4 452 013X+38 923,相關系數r=0.999 9,結果表明,地骨皮乙素在0.041 2～4.116 0 mg·mL-1范圍內,線性關系良好。

2.3.4 穩定性試驗取地骨皮藥材(批號:2018110621)粉末,按已確定的方法(見“2.2.3”項下)進行供試品溶液制備,依次于0、2、4、8、12、24、48 h進樣檢測,計算地骨皮乙素含量,得到不同時間地骨皮乙素含量的RSD為1.11%,表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗取地骨皮藥材(批號:2018110621)粉末6份,每份約0.5 g,按“2.2”項下方法分別檢測,結果6份樣品地骨皮乙素平均含量為4.73%,RSD為0.93%,表明方法重復性良好。

2.3.6 準確度試驗取地骨皮藥材(批號:2018110621)粉末9份,每份約0.25 g,按“2.2”項下的方法,添加不同比例的地骨皮乙素對照品(1∶0.5、1∶1、1∶1.5),制成3 種濃度的供試品溶液各3份,分別檢測,結果見表1?？偲骄厥章蕿?6.18%(92.97%～99.93%),RSD為2.85%,表明方法準確度良好,符合相關要求。

表1 地骨皮乙素含量測定準確度試驗結果

2.4 特征圖譜照“2.2”項下試驗,記錄色譜圖和各色譜峰的保留時間及峰面積。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2.0版)》軟件對22批地骨皮藥材HPLC圖譜進行分析,生成對照圖譜,確定7個峰為共有特征峰。通過與對照品比較保留時間、DAD紫外光譜圖及峰純度檢查確定峰6為地骨皮乙素峰、峰7為地骨皮甲素峰。與地骨皮乙素對照品相應的色譜峰(峰6)為S峰,計算上述穩定性試驗、重復性試驗中其余6個特征峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積,計算RSD,結果均小于3%,穩定性、重復性較好。

2.5 浸出物、總灰分、酸不溶性灰分測定方法照《中國藥典》2020年版(四部)相關規定,分別進行浸出物(通則2201,水溶性浸出物測定法 之熱浸法)、總灰分和酸不溶性灰分(通則2302)的測定。

2.6 樣品分析檢測對22批地骨皮藥材及對應飲片分別進行地骨皮乙素含量、特征圖譜、熱水浸出物、總灰分和酸不溶性灰分的分析測定,結果見表2,HPLC色譜圖及對照特征圖譜見圖1。特征圖譜與文獻[8-9]比較,藥材基原、供試品處理及供試品溶液制備(提取溶劑等)不同,色譜條件有差異,特征圖譜整體相似,各有不同。將記錄的各特征峰峰面積首先折算為單位質量峰面積(相同供試品濃度下的峰面積),計算公式為:

表2 地骨皮藥材及對應飲片檢測結果(%)

再用此結果計算平均峰面積及平均轉移率等,結果見表3。

表3 22批地骨皮藥材及對應飲片特征圖譜特征峰峰面積統計分析

2.7 地骨皮藥材與飲片質量相關性分析我們選擇以藥材、飲片檢測結果直接比較計算轉移率的方式進行相關性研究,更合理的反映炮制前后地骨皮乙素、特征圖譜各特征峰、浸出物等內在質量的變化,凈制過程為物理過程,凈制去除的雜質產生的重量損失,不宜引入相關性分析當中。

22批次的檢測結果表明,炮制前后,浸出物平均轉移率為84.55%,RSD為9.01%,說明炮制工藝穩定,清洗程度均一。

總灰分和酸不溶性灰分的轉移率較高,說明合格藥材的總灰分主要為生理灰分(內在灰分),如薄壁細胞中草酸鈣砂晶等鈣鹽。產地加工未洗凈的殘留泥沙等,特別是嵌合在根皮凹陷部分或不同層理間的泥沙已經很難再被清洗去除,如果再要清除它們,勢必造成浸出物等更大的損失。

地骨皮乙素平均轉移率僅有43.70%,且RSD較大,達48.39%。RSD較大可能與藥材、飲片取樣代表性有一定關系,也可能與藥材形狀大小等關系更大[7]。轉移率低可能是因為地骨皮乙素易溶于水。以峰面積計算,特征圖譜其余6個特征峰平均轉移率在43.32%～86.85%之間,RSD在31.94%～78.24%之間,部分峰的轉移率與地骨皮乙素(峰6)基本一致,其中,峰2、峰3、峰4轉移率較高,均超過了65%,峰4達87%,與浸出物轉移率基本一致,峰7(地骨皮甲素)的轉移率RSD較高,達78%。

3 討論

本文選擇地骨皮藥材和飲片的幾個關鍵質量屬性指標,研究建立了HPLC檢測方法,或照藥典通則中的方法,對多個產地的炮制前后的多批藥材樣品和飲片樣品進行檢測,以檢測結果直接計算轉移率,直觀反映炮制前后各指標的相關性,結果表明,浸出物平均轉移率為84.55%,以此為基礎進行比較,總灰分和酸不溶性灰分的轉移率較高,達到96%以上,地骨皮乙素轉移率較低,僅為43.70%,6個特征峰轉移率有高有低。炮制前后地骨皮藥材和飲片幾個關鍵質量指標之間,轉移率嚴重不一致。在相關中藥的工藝質量研究及生產質量管理過程中,設計空間的確定、藥材與飲片質量控制等,均應充分考慮這種不一致性。

3.1 關于質量相關性評價指標地骨皮乙素是地骨皮藥材與飲片相關性的主要評價指標。特征圖譜是目前常用的整體質量評價指標,浸出物特別是水溶性浸出物傳統上就是中藥材及飲片整體質量評價的主要指標,也是清洗程度的衡量指標?？偦曳?、酸不溶性灰分是地骨皮法定標準收載的質量控制項目[1],且為地骨皮的主要風險項目[13]。以上指標均為地骨皮關鍵質量屬性指標,以它們作為指標進行評價,能夠較全面地反映藥材與飲片間的相關性。

3.2 關于HPLC分析測定方法地骨皮乙素含量測定,經提取方式選擇(超聲提取、回流提取)、提取溶劑選擇(50%甲醇、甲醇、甲醇-1%醋酸(1∶1)混合溶液)、粉碎粒度選擇(過二號篩、三號篩、四號篩)、提取溶劑用量選擇(40、100、150 倍)、提取時間選擇(10、20、30、60 min)等試驗,擬定了供試品溶液制備方法;參考文獻[3,6]方法,試驗確定了梯度洗脫條件和最佳色譜柱等色譜條件。經方法學驗證,擬定的測定方法用于地骨皮乙素含量測定和特征圖譜分析,分離度、精密度、重復性、準確度、耐用性等良好,結果準確、可靠。

3.3 關于飲片炮制和藥材與飲片質量控制《中國藥典》2020年版[1]中,地骨皮藥材與飲片的總灰分和酸不溶性灰分的限度規定一致,均為不得過11.0%和3.0%。依據文獻[13]報道,地骨皮飲片的抽檢不合格率為26.4%,總灰分都是主要不合格項目。依據本文研究結果,合格藥材在炮制前后總灰分和酸不溶性灰分下降很少,清洗的作用極其有限,與此同時,浸出物和地骨皮乙素等水溶性成分,特別是后者,則損失嚴重。因此,地骨皮飲片炮制,應在加強采收及產地加工質量控制,提高藥材質量水平的基礎上,嚴格凈選質量控制,盡量先行除去根皮表面的泥沙和灰屑;選擇適宜的洗藥設備和干燥設備,合理確定相關關鍵工藝參數,在總灰分和酸不溶性灰分的去除,與浸出物和地骨皮乙素的保留之間,找到合理的平衡點,確保地骨皮飲片的安全性和有效性。