長鏈非編碼LncHECW1-IT1對滑膜間充質干細胞成軟骨分化的調控機制

王 彬,范世珍,郭艷玲,趙 碩,林松青*

(1.廣州中醫藥大學深圳醫院(福田),廣東 深圳518034;2.深圳市福田區婦幼保健院)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是臨床上常見的年齡相關性退行性關節疾病,它多發生于中老年人,是老年人群中慢性疾病的主要原因,其特點是關節軟骨的退變和滑膜炎,可引起疼痛,甚至殘疾。最近的一項流行病學研究顯示:全世界約3.03億人患有骨關節炎,給患者和社會造成巨大負擔。然而,骨性關節炎的發病機制尚不清楚,現有的治療只能緩解癥狀,一種有效的臨床治療骨關節炎的藥物或方法仍不確定。因此,更好地了解骨關節炎的發病機制,對于探索新的骨關節炎治療方法具有重要意義。

對于骨關節炎,軟骨自我修復和重塑能力有限,因此,其治療必須涉及關節軟骨的修復,而基于細胞的治療是一種潛在的治療策略[1-2]。間充質干細胞(MSCs)存在于骨髓、臍帶、脂肪組織和滑膜中[2-3],它們具有多線性分化和自我更新能力,已成為許多不治之癥的理想治療選擇,如急性腎損傷[4]、腎缺血/再灌注損傷[5]、OA[6]和肝細胞癌[7],與其他來源的骨髓間充質干細胞相比,滑膜骨髓間充質干細胞(SMSCs)含量豐富,具有最大的軟骨生成潛力,它們逐漸成為干細胞研究的熱點,近年來被認為是OA治療中軟骨修復的理想干細胞[8-10]。但是,了解SMSCs形成軟骨的潛在分子機制還需要進一步的闡明。

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是一類長度為200nt的非編碼RNA;它們在分子結構上類似于信使RNA(mRNAs),已被發現在細胞分化、增殖和凋亡[11-12]等過程中發揮重要的調控作用。lncRNAs還與多種疾病的發生發展密切相關,包括心血管疾病[13]、癌癥[14]、代謝綜合征相關疾病和OA[15]。此外,它們已被發現在SMSCs的軟骨生成分化中發揮重要作用,如lncRNAMEG3和lncRNA DANCR[16]。然而,lncrna在SMSCs成軟骨分化中的作用迄今尚未完全闡明。

在本研究中,我們分離了SMSCs,并通過高通量RNA測序分析了SMSCs軟骨分化誘導后lncRNAs和mRNA的不同表達水平,lncRNAHECW1-IT1(LncHECW1-IT1)和激活轉錄因子2(ATF2)在SMSCs的軟骨分化中被鑒定出來。接下來,我們研究了LncHECW1-IT1對SMSCs軟骨生成分化的影響,隨后的實驗表明:LncHECW1-IT1通過上調ATF2的表達,促進了人SMSCs的軟骨生成分化,LncHECW1-IT1-ATF2軸是一種調控SMSCs成軟骨分化的新機制,我們的發現可能為骨性關節炎的治療提供新的見解。

1 材料和方法

1.1 材料

Dulbecco改良的Eagle培養基F-12,胎牛血清,青霉素與鏈霉素雙抗溶液均購買自美國Gibco公司。SMSCs表面抗原的抗體,包括CD105,CD31,CD34和CD90均購買自美國eBioscience公司。阿利新藍染色液購買于北京索萊寶生物科技公司。TRIzol購買于美國MRC公司。PCR的引物序列由廣州英濰捷基合成,逆轉錄試劑盒Moloney Murine Leukemia Virus(M-MLV) Reverse Transcriptase與熒光定量PCR試劑盒GoTaq qPCR Master Mix由美國Promega公司提供。轉染試劑EndoFectin Max與LncHECW1-IT1的干擾片段均由廣州復能基因有限公司提供。一抗collagen II,SOX9,MEF2C,WNT11均購買自英國abcam公司。Aggrecan購買于美國Santa公司,ATF2購買于美國CST公司,GAPDH購買于中國proteintech公司。Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)和Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)購買于美國Jackson公司。BCA試劑盒購買于美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1SMSCs的分離與鑒定 所有實驗均經廣州中醫藥大學深圳醫院(福田)倫理委員會批準,所有滑膜組織捐贈者均獲得書面知情同意,按照標準化程序從滑膜組織中分離,并按照之前報道的進行培養[17]。它們在杜爾貝科改良的Eagle培養基F-12(目錄號C11330500BT;Gibco)中培養,該培養基補充有10%胎牛血清(目錄號040011ACS;BI)和1%青霉素/鏈霉素(目錄號15140122;Gibco)。采用流式細胞儀分析SMSCs的表面標志物,相相應的抗體包括CD105(分類號85-12-1057-41;eBioscience)、CD34(分類號85-11-0349-41;eBioscience)、CD31(分類號85-11-0319-41;eBioscience)和CD90(分類號85-11-0909-41;eBioscience),用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌收獲的SMSCs,用1%牛血清白蛋白封閉,然后在4℃下與抗體孵育30 min,用PBS洗滌3次后,使用流式細胞儀分析所有細胞。

1.2.2轉錄組分析 將SMSCs暴露于軟骨分化誘導液中(誘導組),按照制造商的說明,在第14天使用TRIzol(目錄號TR118-500;MRC)提取總RNA;然后,通過高通量RNA測序表征差異表達的lncRNA(DElncRNA)和mRNA(DEmRNA)譜,dDElncRNAs和DEmRNAs通過log2倍變化確定≥1和錯誤發現率≤0.001作為使用R包的標準。分別使用ggplot2、先家圖和核倍圖進行火山圖、熱圖和染色體圖,以獲得lncrna和mRNA的表達譜概述,采用基因本體論(GO)分析和《京都基因和基因組百科全書》(KEGG)通路分析來預測所有DEmRNA的潛在功能。

1.2.3軟骨分化 SMSCs的播種密度為5×105每孔的細胞在六孔板中,有細胞爬升;如前所述,用軟骨誘導培養基整夜培養2周,隨后在37℃下培養14天分化,每3天更換誘導培養基。在初始誘導后,通過對阿利新藍的免疫化學染色來評估軟骨形成的分化。

1.2.4阿利新藍染色 SMSCs的播種密度為5×105每孔細胞放在6孔板中,細胞爬升,然后在杜爾貝科改良的Eagle培養基F-12或軟骨分化誘導培養基中培養14天,用PBS洗滌3次,每次5 min后,在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min,再用PBS洗滌3次,然后將其與Alcian酸化工作溶液(目錄號G2542;Solarbio)(Alcian酸化溶液/蒸餾水=1∶2)在室溫下孵育5分鐘,并在Alcian染色溶液中浸泡30分鐘。隨后,用自來水沖洗SMSCs,用乙醇梯度脫水,并用二甲苯清除。最后,用中性膠密封染色細胞,并在相差顯微鏡下觀察。

1.2.5RNA分離與實時定量聚合酶鏈反應 使用TRIzol試劑(目錄號TR118-500;MRC)從培養細胞中提取總RNA,使用莫洛尼小鼠白血病病毒逆轉錄酶(目錄號M1705;Promega)合成互補DNA。使用GoTaq-qPCR主混合物(分類號A6002;Promega)進行實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)分析;使用StepOnePlus qPCR系統(Applied Biosystems)進行RT-qPCR,一式三份。比較循環閾值(2-ΔΔCt)方法進行分析,結果歸一化為U6或甘油醛-3-磷酸脫氫酶的表達。RT-qPCR引物列于表1中。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6細胞轉染 使用小干擾RNAs敲除靶lncRNAs。簡單地說,將SMSCs置于6孔板中,并在轉染前在37℃下培養24 h。當SMSCs的密度達到80%時,使用EndoFectin Max(目錄號EF004;GeneCopoeia)將200 pmol si-LncHECW1-IT1-2、si-LncHECW1-IT1-3或陰性對照小干擾RNA轉染SMSCs,轉染后的細胞用于后續實驗;采用RT-qPCR方法檢測轉染效率。

1.2.7蛋白質印跡 在含有1%蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀分析緩沖液中裂解細胞,并使用BCA蛋白質分析試劑盒(目錄號23225;Thermo Fisher)定量總蛋白質;總變性蛋白(20 g)經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,并轉移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶溶液在室溫下封閉細胞膜1 h,然后與一抗在4℃下孵育過夜。使用了以下一級抗體:膠原蛋白Ⅱ(1∶1 000;分類號ab34712;Abcam),SRY相關高遷移率族盒9(SOX9)(1∶1 000;分類號ab26414;Abcam),聚集蛋白聚糖(1∶500;分類號sc25674;Santa),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(1∶10 000;分類號60004-1;蛋白質),ATF2(1∶1 000;分類號9226;CST),心肌細胞增強因子2C(MEF2C)(1∶1000;分類號ab191428;Abcam),和Wnt家庭成員11(WNT11)(1∶1 000;分類號ab31962;Abcam)。隨后在室溫下將印跡與辣根過氧化物酶結合的二級抗體孵育1 h(1∶5 000;目錄號111-035-003和115-035-003;Jackson)。使用Tanon 5200化學發光成像系統檢測條帶。

1.3 統計分析

所有測量均進行3次,所有定量值均繪制為平均±標準差。所有數據均采用SPSS 23.0進行分析。兩組間和多組間的差異分別采用t檢驗和單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMSCs的分離與鑒定

流式細胞術的結果顯示分離出的SMSCs高表達CD90和CD105,CD31和CD34低表達(圖1A)。實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應結果顯示collagen II (COL2A1)、Aggrecan和Sox9的表達水平在誘導14 d后的細胞中明顯高于對照組(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,and ****P<0.0001)(圖1B);相對于對照組,蛋白免疫印跡法檢測到collagen II (COL2A1)、Aggrecan和Sox9的蛋白表達水平在誘導組中明顯上調(圖1C)。此外,與對照組相比,誘導組中阿利新藍的染色強度明顯增加(圖1D)。這意味著我們成功的將SMSCs誘導為軟骨了[18]。

圖1 SMSCs的分離與鑒定

2.2 mRNAs在SMSCs軟骨分化中的差異表達

接下來通過高通量測序研究了差異表達的mRNAs(即DEmRNAs)和差異表達的lncRNAs(即DElncRNAs)。首先,上調的DEmRNAs分布在染色體上的數量最多的前三條染色體分別為chr1、chr2和chr3,下調的DEmRNAs分布在染色體上的數量最多的前三條染色體分別為chr1、chr11和chr2 (圖2A)?？偣舶l現2539個DEmRNAs,其中1458個上調,1081個下調 (圖2B-2C)。接著對這差異基因進行了GO和KEGG分析。圖2D顯示出這些DEmRNAs參與了cellular process,binding,biological regulation,以及metabolic process。圖2E顯示出絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Wnt信號通路在軟骨形成分化過程中顯著富集。提示DEmRNAs在SMSCs成軟骨分化中有重要作用。

圖2 軟骨分化過程中信使核糖核酸的表達譜

2.3 lncRNAs在SMSCs軟骨分化中的差異表達

此外,通過高通量測序研究了差異表達的lncRNAs(即DElncRNAs)。測序得到的大部分lncRNAs的長度集中在300～1 000 bp (圖3A)。上調的DElncRNA分布在染色體上的數量最多的前三條染色體分別為chr1、chr15和chr17,下調的DElncRNA分布在染色體上的數量最多的前四條染色體分別為chr16、chr1、chr12和chr17 (圖3B)。誘導組共121個DElncRNAs,其中68個上調,53個下調(圖3C-3D)。提示DElncRNAs可能參與SMSCs的成軟骨分化。

圖3 在軟骨分化過程中的lncRNA表達譜

2.4 lncHECW1-IT1和ATF2在SMSCs軟骨分化中的鑒定

通過生物信息學分析選擇了參與MAPK和Wnt信號通路的五個上調的DEmRNAs(WNT11、DKK2、FGF1、ATF2和MEF2C)進行表達驗證。實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應結果顯示,與對照組相比,FGF1的表達在誘導組是顯著下調的(P<0.05),DKK2的表達無明顯變化(P<0.05),WNT11、ATF2和MEF2C的表達在誘導組中是上調的(P<0.05)(圖4A)。對WNT11、ATF2和MEF2C進行蛋白免疫印跡檢測,與對照組相比,只有ATF2的表達在誘導組中是上調的(圖4B)。因此根據競爭的內源性RNA機制,生物信息學分析了ATF2可能結合到的microRNAs,受DElncRNAs調控的microRNAs,并根據這兩個的集合繪制了網絡圖(圖4C)。選擇圖中的5個在測序中表達上調的lncRNAs進行表達驗證,包括HECW1-IT1、RP11-713C5.1、AF131215.3、RP11-815M8.1和CTD-2201E9.1。實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應結果顯示誘導組較對照組上調的lncRNAs包括了HECW1-IT1、AF131215.3和CTD-2201E9.1,與測序的結果一致((P<0.05,圖4D)。而誘導組中RP11-713C5.1和RP11-815M8.1的表達相較于對照組是上調的(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)(圖4D)。其中lncRNA HECW1-IT1在誘導組中的上調倍數大于AF131215.3和CTD-2201E9.1,因此選這個lncRNA用于功能驗證。

圖4 差異表達mRNAs和lncRNAs在滑膜間充質干細胞軟骨分化中的鑒定

2.5 敲除LncHECW1-IT1可減弱SMSCs的成軟骨分化

為了研究LncHECW1-IT1在SMSC軟骨分化中的作用,我們在SMSCs中轉染si-LncHECW1-IT1-2和si-LncHECW1-IT1-3,以敲除LncHECW1-IT1的表達。RT-qPCR分析顯示,轉染si-LncHECW1-IT1-3后,顯著下調了LncHECW1-IT1的表達,轉染效率80%(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001,與對照組比較)(5A)。因此,在進一步的研究中,我們使用si-LncHECW1-IT1-3來敲除LncHECW1-IT1的表達。然后我們使用RT-qPCR檢測關鍵基因ATF2和軟骨分化標記基因(Ⅱ膠原蛋白、聚合聚糖和Sox9)后14天的軟骨分化誘導,分析顯示的表達水平低于控制,WB對相應蛋白表達有相同的趨勢(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001,與對照組比較)(圖5B、C)。為了進一步確定LncHECW1-IT1對軟骨生成分化的相對貢獻,我們分析了軟骨生成分化誘導后的阿利新藍染色。結果顯示,與陰性對照組相比,轉染干擾si-LncHECW1-IT1不僅降低了軟骨細胞的堿性磷酸酶染色(比例尺=100 μm),而且還降低了基質蛋白聚糖的產生(圖5D)。這些數據表明,LncHECW1-IT1在SMSC的軟骨分化中發揮重要作用,轉染干擾si-LncHECW1-IT1可以抑制SMSCs的軟骨分化。

圖5 LncRNA HECW1-IT1的下調抑制了滑膜間充質干細胞的軟骨分化

2.6 LncHECW1-IT1通過正向調控ATF2的表達來促進SMSCs的軟骨分化

根據上述結果,LncHECW1-IT1影響了SMSCs的軟骨生成分化。此外,生物信息學分析顯示,LncHECW1-IT1上調了ATF2的表達。為了進一步驗證LncHECW1-IT1是否調控ATF2,我們首先使用RT-qPCR和WB檢測了ATF2的過表達效率(圖6A,B)。然后,我們檢測了si-LncHECW1-IT1干擾對ATF2的影響,結果顯示,si-LncHECW1-IT1干擾后,ATF2、II型膠原、聚集聚糖和Sox9的mRNA表達顯著降低,而共轉染si-LncHECW1-IT1和ATF2的mRNA表達部分減輕了這一現象,同樣,WB對相應的蛋白表達量也表現出相同的趨勢(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001,與對照組比較)(圖6C、D)。同時,轉染干擾si-LncHECW1-IT1不僅降低了軟骨細胞的堿性磷酸酶染色(比例尺=100 μm),而且還降低了基質蛋白多糖的產生,而過表達ATF2顯著逆轉了si-LncHECW1-IT1的作用(圖6E)。綜上所述,這些結果表明,ATF2是LncHECW1-IT1在SMSCs成軟骨分化過程中的下游靶點。

圖6 過表達ATF2減弱了干擾lncRNA HECW1-IT1表達對滑膜間充質干細胞成軟骨分化的抑制作用

3 討論

骨關節炎是一種由關節退變、軟骨損傷引起的骨關節疾病,目前臨床上仍沒有十分有效的治療方法。因此,研究其發病機制和尋找新的治療方法是目前的研究工作的熱點及重點。SMSCs由于其強大的軟骨生成潛力,被認為是修復受損和病變關節軟骨的合適細胞來源,但SMSCs成軟骨分化的機制尚不清楚。我們的研究首次確定并證實了LncHECW1-IT1在SMSCs成軟骨分化中的作用。

我們首先從供體的滑膜組織中分離出SMSCs,并通過流式細胞術、RT-qPCR和WB鑒定出SMSCs。我們還通過阿利新藍染色分析了SMSCs的高軟骨分化能力。為了更徹底地闡明lncRNA在SMSCs軟骨分化中的作用,我們采用高通量RNA測序技術分析了軟骨分化誘導后lncRNA和mRNA的不同表達水平。最終共發現121個lncRNA和2539個mRNA。這些在SMSCs軟骨分化中富集的DElncRNAs和DEmRNAs可能是SMSCs的重要調控因子。為了進一步研究DEmRNAs在SMSCs軟骨分化中的調控作用,我們對所有DEmRNAs進行了GO富集和KEGG通路分析。我們發現MAPK和Wnt信號通路在軟骨分化過程中顯著富集。值得注意的是,這些通路與OA密切相關。多個信號通路參與了OA的發生過程,如c-Junn端激酶、Akt、MAPK、信號轉換器和轉錄激活因子6、Wnt/-連環蛋白和雷帕霉素通路[19]的機制靶點。

MAPK作為調控細胞增殖、穩態和發育的關鍵信號分子,MAPK信號通路參與形態發生和組織模式,在骨骼發育中,特別是軟骨形成中發揮重要作用[19]。最近的證據表明,Wnt和MAPK信號通路在OA病理中的作用。MAPK信號通路,包括c-Junn-末端激酶、p38 MAPK和細胞外信號調節激酶1/2通路,參與了OA的發病機制。c-Junn-末端激酶和p38 MAPK信號通路與OA軟骨細胞的凋亡相關[20],而p38 MAPK和細胞外信號調節激酶信號通路與骨軟骨串擾相關[21-22]。Wnt信號通路是發育、生長、穩態和疾病中細胞和分子過程的關鍵調節因子和激活因子,特別是在關節和骨中。在OA的發展過程中,典型的和非典型的Wnt信號通路都被過度激活。增加表達Wnt信號表達激動劑在人類OA軟骨可能加速軟骨降解上調基質金屬蛋白酶和聚集酶[23]各種成員Wnt信號通路在滑膜的過表達,包括Wnt和wnt1誘導信號通路蛋白,這可能導致OA的病理過程[24]?；ぶ蠾nt信號通路(WNT8A和WNT16)的增加可能會有效地誘導OA[25]的進展。MAPK和Wnt信號都是OA治療的很有希望的靶點[20,24]。

我們分析了與軟骨生成分化相關的MAPK和Wnt信號通路中的DEmRNA,通過構建ceRNA網絡,預測了能夠調控這些DEmRNAs的lncRNAs,并選擇了前5個基因,包括ATF2、MEF2C、WNT11、Dickkopf2和WNT11。我們通過RT-qPCR和WB進一步驗證了其mRNA和蛋白的表達,并確定ATF2為后續研究的關鍵基因。然而,ATF2是否促進sMSCs的軟骨分化還有待進一步研究。lncRNA在染色質的組織、轉錄和轉錄后水平上調節基因的表達。我們進一步選擇了通過ceRNA網絡上調ATF2的前5個lncRNAs(HECW1-IT1、RP11-713C5.1、AF131215.3、RP11-815M8.1和CTD-2201E9.1)。通過RT-qPCR驗證其表達,只有HECW1-IT1的結果與測序結果一致。LncHECW1-IT1的生物學功能在其他研究中尚未得到闡明。LncHECW1-IT1是否促進SMSCs的軟骨分化有待進一步研究和驗證。

研究了LncHECW1-IT1對SMSCs軟骨生成分化的影響。我們的研究表明,LncHECW1-IT1通過抑制ATF2的表達來抑制SMSCs的軟骨生成分化。據報道,lncRNA在許多生物過程中發揮重要的調控作用,包括軟骨分化[26]。相比之下,只有少數lncRNA被報道特異性參與了SMSCs[26]的軟骨生成分化。我們首先鑒定了LncHECW1-IT1是SMSCs軟骨生成分化中的一個新的陽性調控因子。ATF2是激活蛋白1超家族的一員,它參與了響應細胞應激、炎癥細胞因子和生長因子的多種通路的轉錄調控,它可與其他調節細胞分化和存活的轉錄因子異二聚,并在滑膜組織中發揮重要作用[26]。此外,有研究表明,ATF2通過調控pRB基因的表達[27],對骨生長、軟骨增殖和分化以及骨骼發育均有顯著影響。這一發現提示ATF2可用于預防OA,這與本研究的結果一致。

我們的研究發現了一種新的SMSCs成軟骨分化的調控機制。結果表明,LncHECW1-IT1通過上調ATF2的表達,作為SMSCs成軟骨分化的關鍵啟動子,也為OA的治療提供了新的證據。然而,我們的結論是基于體外實驗的。LncHECW1-IT1是否促進體內軟骨分化有待進一步研究和驗證。LncHECW1-IT1與ATF2在SMSCs中相互作用的分子機制也有待進一步研究。

4 結論

據我們所知,這是第一個發現LncHECW1-IT1,并證實其在SMSCs軟骨分化中作為一種新的正調節因子的功能的研究。LncHECW1-IT1通過上調ATF2的表達來促進SMSCs的軟骨生成分化。該LncHECW1-IT1-ATF2軸是一種調控SMSCs成軟骨分化的新機制。我們的發現可能為骨性關節炎的治療提供新的見解。