綠原酸抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥及機制探索

周云鑫 劉 柯 丁軍穎

近年來,部分地區抗生素使用不規范,加之抗生素的應用與多重耐藥和泛耐藥細菌的傳播之間存在時間差,導致抗生素耐藥性逐年升高[1,2]。其中,耐藥菌感染所致肺炎主要表現為獲得性肺炎,在臨床獲得性感染疾病中占第1位,治療頗具挑戰,給患者和社會帶來了沉重的經濟負擔[3]。

中醫藥治療耐藥菌感染因不易引起耐藥而備受關注,耐藥菌屬風熱之邪,侵襲機體首先犯肺,其所致肺炎核心病機為正氣不足,邪毒內伏[4]。芪歸銀方由黃芪、當歸、金銀花、青蒿和虎杖五味藥合理配伍而成,為扶正透邪治則經典方,契合耐藥菌所致肺炎病機,且前期研究證實芪歸銀方治療耐藥菌所致肺炎臨床療效肯定[5]。綠原酸為芪歸銀方中金銀花和青蒿共同藥理成分且在芪歸銀方中含量較高,此外,在動物模型中綠原酸已被證明可以減少炎癥并調節炎癥和神經性疼痛[6]。

在機體免疫應答的諸多細胞中,巨噬細胞以其對非特異免疫應答不可替代的作用而受到廣泛關注[7]。在炎性疾病中,巨噬細胞在病程的不同階段表型發生相應的改變,以維持、加劇或者抑制、終止炎性反應[8]。芪歸銀方治療耐藥菌所致肺炎療效肯定,但其機制尚不完全明確。為此,本研究以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導巨噬細胞RAW264.7炎癥,探討芪歸銀方重要成分綠原酸對RAW264.7細胞炎癥的抑制作用及可能的機制,以期為耐藥菌所致肺炎的中醫藥防治提供可能的治療策略。

材料與方法

1.細胞與試劑:小鼠巨噬細胞(RAW264.7)購自中國科學院細胞庫(上海);DMEM購自美國Hyclone公司;胎牛血清、0.25%胰酶購自美國Gibco公司;LPS(純度≥98%)、綠原酸(純度≥98%)購自上海碧云天生物技術有限公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所;小鼠白細胞介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)、精氨酸酶-1(arginase-1, Arg-1)及單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司;DMSO購自美國Sigma公司;SG高純總RNA提取試劑盒、Thermo First cDNA Synthesis Kit及One-Step miRNA RT Kit購自北京信諾金達生物科技有限公司。

2.RAW264.7細胞培養與分組:巨噬細胞以含15% FBS的DMEM進行復蘇,于恒溫培養箱(37℃,5%CO2)中培養,倒置顯微鏡下動態監測細胞生長情況。生長密度達到85%,按1∶2以含10% FBS的DMEM進行傳代,取對數生長期的細胞用于實驗。將處于對數生長期的細胞接種于6孔板(5×105/ml,每孔2ml),各組分別進行不同干預:模型對照組(L組),以LPS刺激RAW264.7,使LPS終濃度達到1μg/ml;實驗組(S組),以LPS刺激RAW264.7,使LPS終濃度達到1μg/ml,加入以不含FBS的DMEM為溶劑的綠原酸,使綠原酸終濃度達到50μg/ml;空白對照組(K組),加入同等體積的不含FBS的DMEM。

3.細胞活性檢測:將處于對數生長期的RAW462.7細胞接種于96孔板(1×105/ml,每孔100μl)。參考文獻[9]并結合前期實驗,設置校正組、空白對照組(K′,0μg/ml)、不同濃度綠原酸組(S12.5、S25、S50、S100及S200,即12.5、25、50、100及200μg/ml)。校正組中只含有等體積不含FBS的DMEM,空白對照組中含細胞及不含FBS的DMEM,綠原酸組中含細胞及不同濃度的綠原酸,每組3個樣本,每個樣本設置3個復孔,于恒溫培養箱中(37℃,5%CO2)培養24h。檢測前2h每孔加入10%的CCK-8溶液,避光孵育2h,酶標儀檢測450nm處的吸光度。實驗結果以細胞活性表示,細胞活性(%)=(綠原酸組A450-校正組A450)/(空白對照組A450-校正組A450)×100%。

4.ELISA檢測炎性細胞因子濃度:培養48h后獲取上清及沉淀。根據ELISA試劑盒說明書操作,終止顯色后,立即檢測各組A450,分別繪制ELISA標準曲線,依據曲線公式,結合稀釋倍數求得IL-1β、Arg-1及MCP-1的濃度。

5.qPCR檢測mRNA表達:采用Trizol直接裂解法分別提取不同組別樣本的總RNA,按照反轉錄試劑盒(Thermo First cDNA Synthesis Kit)將總RNA反轉錄為相應cDNA,再以cDNA為模板進行擴增。反應條件:95℃預變性10min,95℃變性30s,60℃退火,40個循環。引物序列詳見表1。所有樣本進行3個重復,取循環閾值(CT)平均值,反應內參均為Actin。采用2-△△Ct相對定量法進行分析。

表1 引物序列

結 果

1. 不同濃度綠原酸干預下RAW264.7的細胞活性:經不同濃度綠原酸處理的RAW264.7細胞活性,說明12.5～200.0μg/ml的綠原酸對RAW264.7細胞無明顯毒性作用(P>0.05),其中50μg/ml的綠原酸對RAW264.7細胞有顯著的提高細胞活性的作用,差異有統計學意義(P<0.05),詳見圖1。

圖1 不同濃度綠原酸預處理后RAW264.7的細胞活性*P<0.05,**P<0.01

圖2 不同干預方式及時間點RAW264.7的細胞形態(×100)

圖3 LPS誘導的RAW264.7細胞中炎性細胞因子的mRNA水平

圖4 細胞上清中炎性細胞因子及極化標志物的含量

圖5 細胞中炎性細胞因子及通路因子的mRNA水平

2.最佳濃度綠原酸干預下不同時間點RAW264.7的細胞形態:以1μg/ml的LPS刺激巨噬細胞,倒置顯微鏡下細胞形態,在24h及48h時,K組細胞呈圓形或橢圓形,與K組比較,L組增殖狀態無明顯區別,而細胞形態變化明顯,表現為L組巨噬細胞偽足明顯,長梭形細胞增多;相較于L組,S組細胞增殖明顯,此外,從形態上看,S組偽足減少,梭形細胞減少(圖2)。

3.LPS預制RAW264.7的細胞炎性狀態:以qPCR法檢測1μg/ml濃度的LPS刺激RAW264.7后24、48h時的炎性細胞因子核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-kappaB, NF-κB)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)及高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB1)的mRNA表達,與K組比較,L組除24h時HMGB1、TGF-β1的mRNA表達水平比較,差異無統計學意義外(P>0.05),24h時NF-κB的mRNA表達顯著升高并且48h時NF-κB、HMGB1及TGF-β1表達均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05),此外,各炎性因子mRNA表達隨時間延長而增加,差異有統計學意義(P<0.05),詳見圖3。

4. 細胞上清中炎性細胞因子及極化標志物的水平:與K組比較,L組炎性細胞因子IL-1β及MCP-1的含量明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05),且M2極化標志物Arg-1的含量明顯下降;S組中,IL-1β含量明顯降低,而Arg-1含量明顯上升,差異有統計學意義(P<0.05),詳見圖4。

5.綠原酸處理后炎性細胞因子及通路因子的mRNA表達結果:RAW264.7巨噬細胞經LPS刺激后產生炎癥,引起相應的炎性細胞因子的表達改變。S組中綠原酸顯著抑制LPS誘導24h及48h的RAW264.7細胞中的NF-κB、TGF-β1及前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)的mRNA水平。此外,S組可降低LPS刺激24h時炎性通路關鍵因子HMGB1的mRNA水平,差異無統計學意義(P<0.05),并且顯著降低LPS刺激48h時HMGB1的mRNA水平,差異有統計學意義(P<0.05),詳見圖5。

討 論

耐藥菌所致肺炎,究其核心病機,當屬正氣不足,邪毒內伏,故而以扶正透邪為組方原則的芪歸銀方契合耐藥菌所致肺炎的病機,且有研究報道芪歸銀方可明顯延緩耐藥菌對抗生素的耐藥性,有效提高抗生素療效,探究其機制發現,可能是通過調節機體免疫應答,影響T、B等細胞及相關細胞因子實現的[10]。綠原酸是芪歸銀方重要活性藥理成分,是一種具有生物活性的酚酸類物質,具有抗氧化活性、抗菌、抗炎、解熱、抗病毒等作用[11～13]。有研究顯示,小鼠感染肺炎克雷伯桿菌后,綠原酸治療組,尤其是綠原酸+抗生素治療組顯著降低了血清中炎性細胞因子的水平,改善了小鼠存活率和肺病理變化,證實綠原酸可有效減輕肺炎克雷伯桿菌感染小鼠的肺部感染,與抗生素合用可增強其抗菌作用[14]。本研究以LPS預制RAW264.7炎癥,同樣發現綠原酸可降低炎性相關通路因子水平及炎性細胞因子水平,發揮抑制巨噬細胞炎癥的作用。

HMGB1是免疫網絡的核心調控分子,可通過促進對無菌或感染性刺激的免疫反應在調節先天性免疫和適應性免疫中發揮關鍵作用[15]。HMGB1參與免疫反應的方式多樣,經研究證實,通過遞送LPS和促進內吞作用,HMGB1可激活非經典抗炎途徑并誘導細胞凋亡,揭示HMGB1是調節炎癥的重要靶點[16]。NF-κB是一個轉錄因子家族,因它能夠調節參與建立免疫和炎性反應的基因的轉錄,因此被認為是炎性反應的關鍵調節因子[17]。炎癥會誘導HMGB1激活NF-κB信號通路,繼而維持炎性微環境[18]。本實驗通過對通路相關因子mRNA水平的檢測,提示綠原酸抑制炎性反應的作用可能是通過HMGB1調控NF-κB通路實現的。

IL-1β及MCP-1是炎性反應中的標志性因子,MCP-1又稱趨化因子(CC基序)配體2(C-C motif chemokine ligand 2, CCL2),來自CC趨化因子家族,可吸引或增強其他炎性細胞因子/細胞的表達,在炎癥應答過程中起重要作用,近年來研究顯示,在人類多種肺部疾病中均有表達異常升高的現象[19,20]。本實驗中檢測各組上清中IL-1β及MCP-1蛋白濃度結果顯示,與模型對照組比較,實驗組顯著降低了IL-1β的水平。PTGS2是參與前列腺素生物合成的關鍵酶,有研究提示PTGS2在炎癥期間水平升高,此外,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)異常炎癥與PTGS2密切相關,提示PTGS2可作為潛在的炎癥標志物[21]。同樣,轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)可通過抑制T、B細胞的增殖分化,降低NK細胞的殺傷作用及補體系統的溶菌作用,調節巨噬細胞的吞噬能力及對抗病原微生物的反應能力,來達到調節免疫炎性反應的作用[22]。本實驗檢測各組mRNA水平發現,綠原酸組明顯降低各炎癥標志物的mRNA水平,這表明綠原酸具有明確降低LPS誘導的RAW264.7細胞炎性反應的作用。

巨噬細胞在免疫反應中有著不可替代的作用,通過吞噬、遞呈抗原和分泌細胞因子參與免疫反應[23]。由于不同的刺激,巨噬細胞可以極化成幾個不同的亞群,其中交替激活或抗炎M2型巨噬細胞主要由一些細胞因子(IL-4、IL-10和IL-13)、糖皮質激素、免疫球蛋白復合物或Toll樣受體等刺激分化而來[24]。M2型巨噬細胞可控制炎癥和適應性Th2免疫,支持血管生成,修復受損組織,清除碎屑,還可引起過敏性炎癥、幫助腫瘤組織生長[25]。Arg-1是經典的M2型巨噬細胞標記因子[26,27]。本實驗中檢測M2型巨噬細胞的活化狀態,結果顯示經LPS干預后,上清中Arg-1水平明顯下降,而經過綠原酸處理后顯著升高,提示綠原酸調節巨噬細胞極化可能是綠原酸發揮抗炎作用的一種途徑。

綜上所述,綠原酸對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥具有明確的抑制作用,其機制可能是通過調控HMGB1介導的NF-κB通路,進而抑制炎性細胞因子的表達,從而發揮抗炎作用,這為耐藥菌肺炎的中醫藥防治提供了潛在的靶點及可能的策略。